Avaliação Quantitativa Otimizada da Estabilidade do RNA Potenciador em Células-Tronco Embrionárias de Camundongos

Summary

Este protocolo mede quantitativamente a estabilidade e a meia-vida de RNAs potenciadores intergênicos e intragênicos em células-tronco embrionárias de camundongo, utilizando tratamento com Actinomicina D, RT-qPCR e análise de regressão não linear. Estratégias de normalização específicas de posição são incorporadas para modelar com precisão a dinâmica do decaimento do eRNA de forma dependente do contexto.

Abstract

RNAs potenciadores (eRNAs) são transcritos não codificantes produzidos a partir de regiões de aprimoramento ativas em transcrição e são cada vez mais reconhecidos como reguladores-chave da expressão gênica. Apesar de sua importância funcional, a estabilidade e a dinâmica de degradação do eRNA permanecem pouco caracterizadas, especialmente em células-tronco embrionárias (ESCs), onde os programas transcricionais são altamente dinâmicos e dependentes do contexto. Este protocolo apresenta um método quantitativo para avaliar a cinética de decaimento e a meia-vida de eRNAs intergênicos e intragênicos em ESCs de camundongo. A transcrição é inibida usando Actinomicina D, e o RNA total é coletado em múltiplos pontos de tempo definidos. O cDNA é sintetizado usando hexameros aleatórios e primers oligo(dT) para permitir a detecção de transcritos poliadenilados e não poliadenilados. Para eRNAs intergênicos, a normalização é realizada usando um gene de manutenção ou o valor Ct no tempo 0 min. Para eRNAs intragênicos, uma abordagem de normalização dupla é empregada para minimizar a interferência causada pela sobreposição de pré-mRNA. As curvas de decaimento são analisadas usando um modelo de decaimento exponencial monofásico, permitindo uma estimativa precisa da meia-vida. O protocolo revela que eRNAs em mESCs apresentam rápida renovação, com meia-vida de aproximadamente 2-3 min. Essa metodologia fornece uma estrutura robusta e reprodutível para estudar a estabilidade do eRNA, oferecendo insights sobre a atividade dos potenciadores e a dinâmica do RNA em contextos de células-tronco pluripotentes.

Introduction

Os aprimoradores são elementos cis-reguladores (CREs) que regulam a expressão gênica específica de tecidos e estímulos, servindo como plataformas de ligação para fatores de transcrição e co-reguladores 1,2,3,4,5,6. Embora os aprimoradores possam estar localizados distantes de seus genes-alvo no nível genômico linear, os mecanismos de looping da cromatina permitem a proximidade espacial com os promotores, facilitando a regulação transcricional. Os realçadores ativos são transcritos bidirecionalmente pela RNA polimerase II (Pol II), produzindo RNAs longos e não codificantes conhecidos como RNAs potenciadores (eRNAs), que tipicamente têm um comprimento mediano de^{aproximadamente 1} kb 1,2,7,8,9. A expressão dos eRNAs está fortemente correlacionada com a ativação dos genes-alvo^próximos 10,11,12, e estudos funcionais têm consistentemente demonstrado que a depleção dos eRNAs reduz a transcrição de seus genes-alvo, sugerindo que os eRNAs atuam como reguladores funcionais e não como subprodutos ^{transcricionais 13,14,15,16,17}. Apesar de sua importância funcional, protocolos experimentais para detectar e quantificar eRNAs de forma confiável continuam limitados.

Nas células-tronco, a atividade do potenciador desempenha um papel crucial na manutenção da pluripotência e na condução das transições de desenvolvimento^18,19. Os aprimoradores podem residir em regiões intergênicas (potenciadores intergênicos ou extragênicos) ou estar embutidos nos corpos gênicos como potenciadores^{intragênicos 8}. Embora os realçadores intergênicos tenham sido amplamente estudados em vários tipos celulares, os realçadores intragênicos permanecem relativamente pouco explorados devido a desafios técnicos, como a sobreposição transcricional com os pré-mRNAs do gene hospedeiro e a presença de modificações de histonas associadas ao alongamento transcricional^20,21. No entanto, estudos recentes mostraram que tanto potenciadores intergênicos quanto intragênicos contribuem para redes reguladoras gênicas envolvidas na pluripotência^22,23 e na diferenciação^{inicial 24} em CES. Notavelmente, quase metade de todos os realçadores anotados são^{intragênicos 20,25}, e sua atividade varia entre estágios de desenvolvimento, frequentemente aumentando em tecidos^{diferenciados} 8,26,27,28. No entanto, a prevalência e os papéis funcionais dos realçadores intragênicos em ESCs permanecem incompletamente compreendidos. Em particular, enquanto eRNAs intergênicos são transcritos entre genes, eRNAs intragênicos são transcritos dentro dos corpos gênicos e podem se sobrepor a transcritos pré-mRNA. Essa diferença posicional exige abordagens analíticas distintas ao interpretar e quantificar eRNAs intergênicos e intragênicos.

Ao contrário dos mRNAs, os eRNAs normalmente não possuem uma cauda poli(A) de 3′, resultando em baixa estabilidade e rápida^degradação 1,2,7,8,9. Essa instabilidade intrínseca dificulta a análise da expressão de eRNA, especialmente em experimentos de curso temporal. Em neurônios, eRNAs têm apresentado meia-vida tão curta quanto 7,5 min¹⁷. No entanto, ainda não está claro se essa instabilidade é consistente entre diferentes tipos celulares, especialmente em ESCs, onde tanto a atividade do potenciador quanto a transcrição de eRNA são altamente específicas do tipo^celular 7,17,29,30. Os ESCs dependem de programas dinâmicos de regulação gênica para manter a pluripotência ou iniciar a diferenciação, tornando-os um sistema único para examinar a renovação de^{eRNA 31,32}. Dadas as rápidas mudanças transcricionais nos ESCs, entender o decaimento do eRNA nesse contexto pode revelar como a atividade do potenciador é regulada^{temporalmente 17}. Além disso, diferenças entre eRNAs intergênicos e intragênicos, como a sobreposição com transcritos gênicos do hospedeiro, exigem abordagens analíticas^{distintas 20}. Apesar da importância dessas questões, poucos métodos padronizados existem para medir a meia-vida dos eRNAs em ESCs ou para comparar a dinâmica do decaimento de diferentes tipos de eRNA.

Este estudo apresenta um protocolo quantitativo para avaliar a estabilidade e a meia-vida de eRNAs transcritos de realçadores intergênicos e intragênicos em mESCs. A inibição transcricional é alcançada usando actinomicina D (ActD) em intervalos de tempo definidos, seguida por análise de PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e regressão não linear para quantificar o decaimento do eRNA. Para abordar as diferenças posicionais entre realçadores intergênicos e intragênicos, o método incorpora estratégias de normalização distintas, permitindo uma comparação sistemática e precisa da dinâmica da degradação do eRNA. Essa estrutura analítica fornece insights valiosos sobre a renovação de eRNA em células-tronco pluripotentes.

Protocol

Todos os experimentos deste estudo foram realizados usando células-tronco embrionárias de camundongos (mESC; E14Tg2A) que não foram gerados diretamente em nosso laboratório, mas obtidos de uma linha celular estabelecida, que também está comercialmente disponível pelo ATCC (CRL-1821). Portanto, o trabalho descrito neste artigo não requer revisão do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) na Chungnam National University. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura celular de mESCs

1. Pré-revestimento das placas de cultura celular de 6 poços com 0,1% de gelatina (2 mL por poço). Incube as placas a 37 °C por 10 minutos.
2. Aspire a gelatina e lave cada poço uma vez com 1 mL de PBS. Esterilize as placas por irradiação UV por pelo menos 15 minutos.
3. Sementes os mESCs sobre as placas revestidas de gelatina usando 2 mL completos de meio de cultura celular (Tabela 1).
   NOTA: Adicione o LIF fresco ao meio de cultivo na concentração requerida imediatamente antes do uso, com base no volume total do meio necessário para o experimento.

Componentes	Concentração Final	Volume utilizado
Médio Mínimo Essencial (GMEM) de Glasgow	-	500 mL
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)	10%	50 mL
Penicilina-estreptomicina	0.50%	2,5 mL
Soro fetal bovino (FBS)	1%	5 mL
Piruvato de sódio	0,1 mM / 1 %	5 mL
Solução de Aminoácidos Não Essenciais (MnEA) do MEM	0,1 mM/ 1 %	5 mL
2-mercaptoetanol	0,1 mM	910 uL
Fator inibidor da leucemia (LIF)	1000 U/mL	-

Tabela 1: Composição do meio de cultura mESC. Componentes e suas concentrações finais são usados para preparar o meio de cultura mESC. Os volumes típicos são listados por 500 mL de meio total.

4. Mantenha as células sob condições padrão de cultura a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ (Figura 1A).

Figura 1: Desenho experimental para análise de estabilidade de eRNA. (A) Esquema do experimento de parada transcricional. As células foram placadas em placas de 6 poços revestidas com gelatina a 0,1% e tratadas com actD (concentração final: 5 μg/mL) nos momentos indicados (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min e 30 min) após a colheita. (B) Layout do ensaio RT-qPCR. O RNA total foi transcrito reversamente usando hexâmeros aleatórios ou primers oligo(dT). Amostras de cDNA de cada ponto de tempo foram analisadas usando RT-qPCR para os alvos indicados: Tbp_mRNA, eRNA intergênico e eRNA intragênico. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Tratamento com Actinomicina D (ActD)

1. Dissolva o actD em DMSO para preparar uma solução padrão a uma concentração de 1 mg/mL³³.
   NOTA: Embora a Actinomicina D seja usada aqui para inibição transcricional de curto prazo, inibidores alternativos como o triptolido também podem ser empregados para bloquear a iniciação da transcrição em estudos futuros. Como tanto a Actinomicina D quanto a DMSO são sensíveis à luz, prepare a solução original em microtubos âmbar, proteja-a da luz e armazene-a a -20 °C até o uso.
2. Dois dias após a semeadura das células (ou no dia da colheita), adicione a solução de stock de ActD ao meio de cultivo até uma concentração final de 5 μg/mL³³. Colete amostras em 0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 e 30 min após o tratamento (Figura 1A).
   NOTA: Embora a maioria dos eRNAs apresente decaimento rápido na faixa de 0 a 30 minutos, alguns eRNAs podem apresentar meias-vidas mais longas. Dependendo das características do locus-alvo, amostragens adicionais em pontos de tempo prolongados (por exemplo, 1 h, 3 h ou 6 h) podem ser incluídas para capturar com mais precisão a cinética do decaimento. Neste estudo, a Actinomicina D foi usada em uma concentração de 5 μg/mL para bloqueio transcricional de curto prazo (≤30 min); no entanto, para incubações mais longas (>1 h), recomenda-se reduzir a concentração para 1-2 μg/mL para minimizar as respostas ao estresse celular. Como o próprio DMSO pode afetar a atividade transcricional, um controle apenas DMSO também deve ser incluído.

3. Extração de RNA e síntese de cDNA

1. Remova o meio de cultura celular por sucção e adicione 1 mL de reagente TRIzol a cada poço. Incube as placas em um shaker por 10 minutos à temperatura ambiente (RT) ^34,35, depois transfira o lisado para um novo tubo de 1,5 mL.
   NOTA: Após o tratamento com Trizol (Trizol treatment), as amostras podem ser armazenadas a -80 °C por até uma semana antes da extração de RNA. Como o reagente TRIzol contém fenol e isotiocianato de guanidinium, que são altamente tóxicos e corrosivos, manuse-o com muito cuidado. Todos os resíduos de Trizol devem ser coletados em um recipiente designado para solventes orgânicos para descarte adequado.
2. Adicione 500 μL de clorofórmio a cada amostra. Sacode vigorosamente os tubos e incube em RT por 3 minutos.
3. Centrifuge as amostras a 13.500 × g por 10 minutos a 4 °C.
4. Transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 mL contendo volume igual de isopropanol. Incube a mistura em RT por 10 minutos para aumentar a precipitação de RNA.
   NOTA: Transfira cuidadosamente apenas a fase aquosa superior clara para evitar contaminação com a interfase. Para aumentar o rendimento de RNA, incube amostras a -20 °C por 1 hora até a noite (O/N) após a adição de isopropanol. Para amostras de baixa entrada, adicione glicogênio (10-20 μg/mL final) ou GlycoBlue logo antes de adicionar isopropanol, para melhorar a visibilidade dos pellets de RNA e a eficiência da recuperação. O isopropanol é altamente inflamável e potencialmente prejudicial à saúde humana; A inalação de vapores ou o contato com pele ou olhos pode causar irritação, dor de cabeça, tontura ou depressão do sistema nervoso central. Manuseie com cautela e reúna todas as soluções restantes em um recipiente aprovado para resíduos de solvente orgânico para descarte adequado.
5. Centrifuge as amostras novamente a 13.500 × g por 10 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante.
6. Lave o pellet de RNA resultante com 1 mL de etanol 75%. Centrifuge a 6.800 × g por 5 minutos a 4 °C.
   NOTA: Inverta suavemente o tubo após a adição de etanol para levantar o pellet.
7. Remova cuidadosamente o sobrenadante e seco o pellet ao ar por 10 minutos a 42 °C. Ressuspenda o pellet seco em água sem RNase e incube a 55 °C por 10 minutos.
   NOTA: Quando a pureza do RNA é alta, o pellet branco pode se tornar translúcido durante o processo de secagem ao ar. Evite secar demais o pellet por mais de 10 minutos, pois a secagem excessiva pode reduzir a eficiência da ressuspensão.
8. Meça a concentração e pureza do RNA usando um espectrofotômetro NanoDrop.
9. Sintetize cDNA a partir de μg de RNA usando o Kit de Síntese de CDNA M-MLV, seguindo as instruções do fabricante (Tabela 2).

Componentes	Volume utilizado
Buffer RT 10X M-MLV	2 uL
dNTP	2 uL
Primer (Random / Olido dT)	1uL
M-MLV RT	1uL
Inibidor de rnase	0,5 uL
Amostra de RNA	2ug (Ajuste de volume com base na concentração da amostra de RNA)
DW	Ajuste de volume dependendo da concentração da amostra de RNA (para compor o volume final)
Total Volume	20 uL

Tabela 2: Composição da reação de síntese de cDNA (transcriptase reversa M-MLV). Volumes detalhados e reagentes usados para transcrição reversa de 2 μg de RNA total usando o Kit de Síntese de CDNA M-MLV. O volume da amostra de RNA foi ajustado com base em sua concentração, e DW livre de nuclease foi adicionado para elevar o volume final de reação a 20 μL.

10. Incube a reação de cDNA a 37 °C por 2 horas, depois inative a enzima a 85 °C por 5 minutos.
    NOTA: Armazene cDNA sintetizado a -20 °C. A concentração típica de cDNA é de aproximadamente 100 ng/μL. Para detectar eRNAs intragênicos, sintetize cDNA da mesma amostra de RNA usando tanto primers hexameros aleatórios quanto primers oligo(dT).

4. Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (RT-qPCR)

1. Prepare uma mistura de reação de 10 μL contendo 15 ng de cDNA, 5 μL de mistura master Power SYBR Green PCR, 5 pmol de cada primer e água destilada (DW).
   NOTA: loci de eRNA frequentemente contêm ou estão adjacentes a sequências repetitivas, exigindo um design cuidadoso de primer. Use sequências com máscara repetida para restringir regiões candidatas e verificar a especificidade de pares de primer em todo o genoma usando BLAST. Quando possível, inclua regiões de controle próximas para excluir a amplificação^{não específica 36}.
2. Realize amplificação usando um sistema de PCR em tempo real com as seguintes condições de ciclo térmico: um passo inicial de ativação e desnaturação a 50 °C por 2 minutos e 95 °C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 segundos, e medição de recozimento, extensão e fluorescência a 60 °C por 1^{min 34, 37} (Tabela 3).

Palco	Passo	Temperatura (°C)	Hora	Ciclo
Hold Stage	Transcrição reversa	50	2 min	1
	Desnaturação inicial	95	10 min	1
Estágio PCR	Desnaturação	95	15 s	40
	Recozimento/Extensão	60	1 min	40
Estágio da curva de fusão	Desnaturação	95	15 s	1
	Recozimento	60	1 min	1
	Dissociação (curva de fusão)	95	15 s	1

Tabela 3: Condições de ciclo térmico para RT-qPCR. Resumo das condições de temperatura, tempo e ciclo para transcrição reversa, qPCR de 40 ciclos (reação de 10 μL) e análise padrão da curva de fusão.

3. Para quantificação de eRNA intragênico, analise tanto o Tbp (ou outro gene de controle/controle) quanto a região do realçador intragênico usando cDNA sintetizado com primers oligo(dT). Para eRNAs intergênicos, use apenas cDNA sintetizado com primers hexaméricos aleatórios (Tabela 4 e Figura 1B).
   NOTA: Rodar cada amostra em duplicados técnicos (dois poços) para permitir a média durante a análise de dados.

Nome do gene	Sonda de espoleta	Sequência (5'-3')	Tamanhos de amplicons
TBP	Encaminhar	TGACTCCTGGAATTCCCATC	122 BP
	Inverter	TTGCTGCTGCTGTCTTTGTT
Nsun2_mRNA	Encaminhar	GGATGAAGCAGTGATCGCAG	93 pb
	Inverter	ATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNA	Encaminhar	TCCCTACAGCAGATCACTCAC	80 pb
	Inverter	CGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNA	Encaminhar	ACAGATGCAACCGATGCACC	105 pb
	Inverter	TGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNA	Encaminhar	CCTGAGAGGTGTTTGCTTTGT	110 pb
	Inverter	AGGTTAACACATCAGCCCCA
Pou5f1_eRNA	Encaminhar	CACTTCTCTGGGGTCTCTGG	107 BP
	Inverter	CCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNA	Encaminhar	AGTCAGCTACATGGGCAGAG	119 BP
	Inverter	CCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative controle	Encaminhar	CCCCGTGTGTTTAAGAGGAATGA	88 pb
	Inverter	ACTGAACAACCACTACTAGCA

Tabela 4: Sequências de primer para análise RT-qPCR. Sequências de espoletas para frente e reverso usadas para amplificação específica de cada gene-alvo em experimentos RT-qPCR. Esses primers foram otimizados para garantir a quantificação precisa da expressão de mRNA e eRNA.

5. Análise de dados de estabilidade de ^{eRNA 22}

1. Analise todos os dados usando o método ΔCt e normalize os níveis relativos de eRNA ao Tbp_mRNA (Arquivo Suplementar 1 e Figura 2A).
   NOTA: Se a diferença de valor Ct entre duas réplicas técnicas exceder 0,5, exclua os dados da análise posterior. Calcule os níveis relativos de expressão gênica usando o método ΔCt subtraindo o valor Ct do gene controle (por exemplo, Tbp_mRNA) do do gene-alvo (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). A expressão relativa pode então ser calculada como 2^-ΔCt (Arquivo Suplementar 2B).
2. Para quantificação intragênica de eRNA, normalize os valores de expressão dividindo os valores de cDNA sintetizado usando hexâmeros aleatórios pelos valores de cDNA sintetizado usando primers oligo(dT).
   NOTA: Realize todas as reações qPCR usando três réplicas biológicas independentes (n = 3).
3. Normalize o nível de expressão de cada ponto temporal (obtido viamétodo ΔCt) para o valor 0 min e plote a curva de decaimento.
   NOTA: Embora este protocolo utilize tratamento curto com Actinomicina D, a exposição prolongada a inibidores de transcrição (por exemplo, ActD) também pode reduzir a expressão gênica de manutenção doméstica. Para quantificação de maior precisão, recomendamos adicionar um RNA exógeno de espike-in (por exemplo, ERCC) na etapa de lise celular para corrigir variações na eficiência da extração de RNA, eficiência de transcrição reversa e precisão de pipeteamento, permitindo assim uma normalização mais consistente entre^{amostras 38,39}.
4. Plote os níveis normalizados de eRNA ao longo do tempo e ajuste-os usando um modelo de regressão não linear (decaimento exponencial de uma fase) no GraphPad Prism (Arquivo Suplementar 3).
5. Estimar a meia-vida do eRNA a partir de replicações biológicas individuais.
   1. Abra o GraphPad Prism e selecione Criar > XY (Opções: X = Números; Y = Introduza e plote um único valor Y para cada ponto).
   2. Insira os pontos de tempo (0, 5, 10, 15, 20 e 30 min) como valores do eixo X.
   3. Liste os nomes das amostras no eixo Y (Grupo) e insira o valor único correspondente para cada ponto de tempo.
   4. Selecione Analisar > Regressão e Curvas > Regressão Não Linear (Ajuste de Curva).
   5. Na aba Exponencial , selecione o modelo de decaimento monofásico .
   6. Na folha Tabela para Resultado , calcule a média e o desvio padrão dos valores de meia-vida para cada amostra usando Excel ou software similar. Plote os valores resultantes.
6. Curvas de decaimento ajustadas com intervalos de confiança de 95%
   1. Abra o GraphPad Prism e selecione Criar > XY (Opções: X = Números; Y = Insira 3 valores replicados em subcolunas lado a lado).
   2. Insira os pontos de tempo (0, 5, 10, 15, 20 e 30 min) como valores do eixo X.
   3. Liste os nomes das amostras no eixo Y (Grupo) e insira os três valores replicados para cada amostra de eRNA na folha de dados correspondente.
   4. Selecione Analisar > Regressão e Curvas > Regressão Não Linear (Ajuste de Curva).
   5. Na aba Exponencial , selecione o modelo de decaimento monofásico para análise.
   6. Na folha Table to Resultat, extraia os valores do intervalo de confiança (IC) de 95% obtidos a partir da análise das amostras triplicadas.
      NOTA: Use a seguinte equação de decaimento: Y = (Y₀ - Planalto) • ^e-kt + Planalto, onde Y é o nível relativo de eRNA no tempo t, Y₀ é o nível inicial de eRNA e k é a constante de decaimento (eRNA). Não fixe o platô a zero durante o ajuste da curva de eRNA, pois estudos anteriores mostram que o eRNA pode persistir e não se degradar completamente ao longo do^{tempo 17,40}. No entanto, fixe o Platô a zero ao analisar o decaimento do mRNA, seguindo os protocolos anteriores^{de mRNA 41,42}. Permita que o GraphPad Prism calcule automaticamente a meia-vida do eRNA (t₁/₂) usando a fórmula: t_1/2 = In(2)/ k. Insira o tempo em min; Informe os valores de meia-vida resultantes em mínimo.

Results

Para avaliar a estabilidade do RNA após a parada transcricional, os mESCs foram tratados com actD, e o RNA total foi coletado em pontos de tempo definidos (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min e 30 min). Após a síntese de cDNA, foi realizado o RT-qPCR para quantificar o eRNA intragênico de Nsun2 e Sox2, o eRNA intergênico de Pou5f1 e seus correspondentes mRNAs. Esses dados foram usados para gerar curvas de degradação dependentes...

Discussion

Este protocolo descreve um método confiável e reprodutível para medir a estabilidade do eRNA em mESCs. Etapas experimentais críticas, incluindo cultura celular, tratamento com actinomicina D, extração de RNA e quantificação RT-qPCR, estão claramente ilustradas nas figuras e arquivos suplementares para orientar os usuários durante o fluxo de trabalho. Além disso, procedimentos analíticos detalhados, como modelagem de regressão não linear e interpretação de intervalos de confiança, são for...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoetanol	Gibco	21985023
Actinomicina D	Sigma-Aldrich	A9415
clorofórmio	Produtos químicos da Daejung	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glasgow' s Meio Essencial Mínimo (GMEM)	Gibco	11710035
GraphPad Prism (versão 9)	GraphPad Software
Isopropanol	Produtos químicos da Daejung	5035-4105
KnockOut Serum Replacement (KOSR)	Gibco,	10828028
Fator inibidor da leucemia (LIF)	Merck	ESG1106
Solução de Aminoácidos Não Essenciais (MnEA) do MEM	Welgene	LS005
Kit de Síntese de CDNA M-MLV	Enzimômica	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
Penicilina-estreptomicina	Welgene	LS202-02
Power SYBR-Green PCR master mix	Biossistemas Aplicados	4368708
Sistema de PCR em Tempo Real QuanStudio1	Biossistemas Aplicados	A40425
Piruvato de sódio	Welgene	LS013
TRIzol	Invitrogen	15596018