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Engenharia Epigenética de Células K562: Estratégia Episómica de Vetor Duplo para Metilação de DNA Direcionada Estável usando Proteínas de Fusão dCas9-DNMT3A e -HDAC1

DOI:

10.3791/69328

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31 de outubro de 2025

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um sistema não integrativo e episômico baseado em CRISPR/dCas9 para edição epigenética direcionada em células K562, combinando efetores dCas9-DNMT3A e dCas9-HDAC1 com sgRNAs específicos para induzir metilação de DNA específica do locus com precisão e efeitos fora do alvo reduzidos.

Resumo

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Investigar o papel preciso da metilação do DNA na regulação transcricional gênica e desenvolver terapias direcionadas a padrões específicos de metilação gênica apresenta desafios significativos devido à escassez de ferramentas versáteis capazes de induzir modificações epigenéticas específicas do local e de longo prazo para modular a expressão gênica. O estudo teve como objetivo desenvolver e validar um sistema inovador baseado em episódios para facilitar a metilação estável do DNA em um locus de gene alvo, potencialmente útil tanto para pesquisa epigenética básica quanto para aplicações terapêuticas. Para conseguir isso, a linhagem celular K562 foi co-transfectada com dois vetores epissómicos distintos. Ambos os tipos de vetores foram projetados para expressar RNAs guia (gRNAs) visando uma região não metilada de 367 pb dentro da ilha CpG 326, localizada a montante do gene ZBTB7A . Cada vetor codificou uma forma desativada de endonuclease Cas9 (morta ou dCas9) fundida ao domínio catalítico da DNA metiltransferase DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) ou à histona desacetilase HDAC1 de comprimento total (dCas-HDAC1). A sequência dCas incluiu dois Sinais de Localização Nuclear (NLS) para garantir a importação nuclear da proteína. Este de expressão de sistema duplo promove um estado de cromatina potencialmente propício ao silenciamento epigenético de longo prazo, prometendo resultados epigenéticos robustos e duráveis. Essa abordagem interveniente ao epigenoma do hospedeiro por meio da utilização de vetores epissómicos auto-replicantes oferece várias vantagens: manutenção e expressão de vetores em baixo número de cópias em várias divisões celulares sem integração no genoma do hospedeiro, minimizando assim os efeitos fora do alvo e preservando a integridade do genoma. Relatamos o aumento preciso e significativo da metilação do DNA na ilha ZBTB7A CpG 326 alvo. As descobertas validam que os sistemas CRISPR / dCas episómicos projetados podem provocar metilação de DNA durável e específica do local. Portanto, este sistema é uma ferramenta de pesquisa valiosa para avaliar os efeitos funcionais de mudanças de metilação direcionadas e uma plataforma promissora para o desenvolvimento de futuros tratamentos epigenéticos.

Introdução

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A regulação epigenética, incluindo metilação do DNA e modificações de histonas, desempenha um papel fundamental no controle da expressão gênica, diferenciação celular e estabilidade do genoma. A desregulação desses mecanismos está frequentemente envolvida, seja como causa ou consequência, em vários estados patológicos, particularmente no câncer, distúrbios neurológicos e síndromes de imprinting 1,2,3. Notavelmente, intervindo precisamente na paisagem epigenética em loci genômicos específicos usando a tecnologia de edição de epigenoma Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), níveis de repressão gênica comparáveis aos observados em modelos de nocaute genético podem ser alcançados, sem alterar a sequência de DNA subjacente4. Como resultado, a edição epigenética direcionada surgiu como uma estratégia promissora para dissecar mecanismos reguladores de genes e desenvolver terapias de precisão.

Os inibidores da DNA metiltransferase (DNMT) e os inibidores da histona desacetilase (HDAC) são terapias epigenéticas atualmente aprovadas para uso clínico. No entanto, esses agentes visam de forma não seletiva marcadores epigenéticos em todo o genoma, alterando os estados globais da cromatina, causando efeitos fora do alvo e toxicidade em pacientes5. Para abordar as limitações dos agentes de alteração epigenética tradicionais, editores epigenéticos programáveis baseados em Cas9 (dCas9) cataliticamente morto fundido a domínios efetores, como DNA metiltransferases (por exemplo, DNMT3A), desmetilases (por exemplo, TET1), histonas acetiltransferases (por exemplo, p300) ou desacetilases (por exemplo, HDAC3), foram desenvolvidos 6,7,8,9 . O sistema efetor dCas9 permite a modificação do epigenoma específico do locus guiada por uma pequena molécula de RNA, conhecida como RNA guia único (sgRNA), sem introduzir quebras de fita dupla na sequência alvo. Estudos recentes demonstraram seu uso na modificação da expressão gênica, remodelando a acessibilidade da cromatina e até mesmo reprogramando fenótipos celulares 10,11,12.

Apesar dos rápidos avanços, os sistemas de engenharia de epigenoma baseados em dCas9 continuam a enfrentar algumas limitações. O desafio mais comum são os efeitos fora do alvo devido à inespecificidade dos domínios efetores epigenéticos, especialmente com expressão forte ou prolongada das ferramentas de fusão dCas913,14. Além disso, o grande tamanho das fusões dCas9 apresenta desafios significativos de entrega. O tamanho da sequência de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) é de aproximadamente 4,2 kb15, o que é comparável ao tamanho máximo da capacidade dos vetores de vírus adeno-associados (AAV). Embora os vetores lentivirais tenham uma capacidade relativamente grande (~ 12-1 kb), permitindo a entrega do SpCas9 de comprimento total fundido com efetores epigenéticos, eles ainda mantêm a possibilidade de integração genômica aleatória, arriscando mutagênese insercional e limitando suas aplicações clínicas16. Por outro lado, abordagens não virais, como a transfecção de plasmídeo, sofrem de baixa retenção nas células em divisão. As abordagens de entrega transitórias ou "hit-and-run" excluem a possibilidade de integração genômica, mas muitas vezes não conseguem sustentar as mudanças de metilação entre as divisões celulares, a menos que combinadas com remodeladores de cromatina ou efetores cooperativos 17,18,19.

Para enfrentar esses desafios, empregamos um sistema de vetor epissomal não integrativo e auto-replicante (pEPI-S / MAR) para fornecer efetores epigenéticos fundidos com dCas9. Este vetor persiste extracromossomicamente em células em divisão em baixo número de cópias (~ 1-2 por célula), permitindo expressão sustentada, mas moderada, a fim de minimizar funções indesejadas associadas à superexpressão20,21. O elemento Scaffold/Matrix Attachment Region (S/MAR) do epissoma interage com a matriz nuclear, contribuindo para a manutenção estável do epissoma no núcleo das células durante a divisão celular22,23. Além disso, o sistema de vetor pEPI evita riscos associados à integração viral e permite a entrega de construções sem exceder os limites de embalagem.

Estudos recentes mostraram que as regiões promotoras marcadas por modificações ativas de histonas, particularmente a acetilação de H3K27 (H3K27ac), são frequentemente resistentes à metilação do DNA projetada. Abordagens combinatórias que removem ou adicionam marcas de histonas usando gravadores ou borrachas de modificações de histonas e simultaneamente introduzem metilação do DNA via DNMT3A demonstraram aumentar a estabilidade e a persistência da repressão gênica, mesmo em abordagens transitórias19,24. Com base nesses insights, levantamos a hipótese de que a co-entrega de dCas9-HDAC1 e dCas9-DNMT3A e o direcionamento de áreas genéticas vizinhas promoveriam a remodelação da cromatina e facilitariam uma metilação mais eficiente e durável nos elementos reguladores alvo.

Neste estudo, nosso objetivo foi projetar e construir um sistema capaz de fornecer metilação de DNA direcionada e estável para a ilha CpG 326 de ZBTB7A, uma região caracterizada por baixa metilação endógena e marcas aberrantes de H3K27ac em células K562. O objetivo deste estudo foi fornecer duas construções episómicas que codificam dCas9 fundido a cada um dos efetores epigenéticos distintos, juntamente com sgRNAs, visando a região regulatória rica em CpG a montante do gene ZBTB7A usando o sistema pEPI de baixa expressão, estável e não integrativo. Conforme ilustrado na Figura 1, a co-transfecção de células K562 com esses epissomos permite o recrutamento duplo dos complexos de edição para a ilha CpG de interesse, onde HDAC1 remove a acetilação local de histonas para facilitar a metilação subsequente do DNA por DNMT3A, resultando em modificação epigenética coordenada e específica do local.

O sistema descrito aqui é apropriado para aplicações em que a entrega viral não é viável devido ao tamanho da construção, preocupações de segurança ou limitações de custo. Ele suporta clonagem modular de diferentes sgRNAs e fusões efetoras, tornando-o adaptável a uma variedade de loci alvo. Atualmente, é mais adequado para estudos in vitro ou pré-clínicos em linhagens celulares que toleram a transfecção de plasmídeos e a seleção de antibióticos. Em nossa implementação, a entrega episómica em células K562 foi alcançada usando reagentes à base de lipofectamina e mantida sob seleção G-418.

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Protocolo

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1. Desenho de sgRNAs

  1. Identifique a ilha CpG desejada ou os locais reguladores de CpG dentro da região promotora do gene de interesse usando um navegador de genoma (por exemplo, navegador de genoma UCSC). Aqui, o delineamento foi aplicado na ilha CpG 326 (GRCh38) do gene ZBTB7A .
  2. Projete RNAs de guia único (sgRNAs) usando uma plataforma de design de sgRNA CRISPR online [por exemplo, ferramenta da web CHOPCHOP (versão 3)]. Ao projetar sgRNAs, siga as recomendações abaixo para garantir alta atividade no alvo e efeitos mínimos fora do alvo:
    1. Selecione a proteína SpCas9 como endonuclease, usando 5'-NGG-3' como motivo adjacente ao protoespaçador na extremidade 3' (PAM-3').
    2. Escolha o comprimento do sgRNA para ser 20 pb (além da sequência PAM). Permitir correspondências fora do alvo com apenas três incompatibilidades na sequência do protoespaçador.
    3. Ao selecionar para atingir uma região específica do gene, escolha a opção 'Promotor' e defina a faixa upstream (por exemplo, de 1500 bp a 3000 bp upstream para a ilha CpG 326) para posicionar os sgRNAs dentro da região regulatória.
    4. Use pontuações de eficiência no alvo, como as desenvolvidas por Doench et al.25, para avaliar a atividade do sgRNA.
  3. Ao selecionar sgRNAs para uso experimental, considere os seguintes critérios:
    1. Classifique todos os sgRNAs candidatos por eficiência para a região alvo. Escolha sgRNAs entre os 10-20% superiores da eficiência prevista. Ao escolher, evite sgRNAs com incompatibilidades (MM0, MM1, MM2, MM3) em possíveis locais fora do alvo.
    2. Escolha sgRNAs que tenham como alvo áreas originalmente não metiladas ou fracamente metiladas para repressão transcricional usando dCas9-DNMTs. Para repressão transcricional usando dCas9- HDACs, direcione regiões altamente acetiladas para aumentar a eficiência. Use bancos de dados on-line (por exemplo, ChIP-Atlas) para confirmar a metilação do DNA e as marcas de acetilação de histonas em células K562 nos loci alvo.
    3. Use vários sgRNAs para cobrir regiões-alvo maiores que 100-200 bp26.
      NOTA: Modificações epigenéticas (metilação e desacetilação) influenciam regiões a montante e a jusante do sítio de ligação do sgRNA, e esses efeitos podem ser limitados a curtos períodos genômicos.
    4. Escolha sgRNAs com um conteúdo de GC entre 40% e 80%.
      NOTA: O conteúdo de GC do sgRNA é importante, pois o conteúdo de GC mais alto melhora a estabilidade do RNA e a ligação de dCas.
    5. Evite sgRNAs contendo trechos de quatro ou mais timidinas (Ts) e escolha sgRNAs com nucleotídeos de adenina ou timina localizados quatro bases a montante do sítio PAM.
      NOTA: Quatro ou mais Ts podem levar ao término prematuro da transcrição. sgRNAs com A ou T localizados quatro bases a montante do sítio PAM podem exibir uma ligação dCas mais forte.
    6. Verifique e evite sgRNAs com alta autocomplementaridade para minimizar o risco de formação de estrutura secundária.
    7. Finalize a seleção de algumas sequências de sgRNA.
      NOTA: Quatro sgRNAs foram projetados abrangendo a ilha CpG 326. As sequências de alvos de sgRNA1-4 e as posições de alvos na ilha CpG 326 são mostradas na Tabela Suplementar 1.
  4. Transforme a sequência de sgRNA de escolha (excluindo o tripleto PAM) em seu complemento reverso. Adicione GATCG à extremidade 5' da sequência direta e G à sua extremidade 3', e AAAAC à extremidade 5' da sequência complementar reversa e C à sua extremidade 3'. Encomende os dois oligos finais para cada sgRNA de um fornecedor comercial de oligos.

2. Clonagem

NOTA: Esta seção descreve a adaptação do plasmídeo pEPI-1 para gerar vetores episômicos que transportam a fusão efetora epigenética dCas e os de expressão de sgRNA. Consulte a Figura 2 para obter uma visão geral abrangente do fluxo de trabalho de clonagem e da arquitetura vetorial. Todas as reações de digestão de restrição e ligadura descritas abaixo foram realizadas de acordo com os protocolos recomendados pelo fabricante para cada enzima e reagente utilizado, e as especificações da reação estão listadas em detalhes na Tabela Suplementar 2.

  1. Digerir o plasmídeo pEPI-1 utilizando AgeI e BspEI, que flanqueiam a sequência de codificação da eGFP (proteína fluorescente verde melhorada). Após a digestão de restrição, embote as saliências resultantes usando o fragmento de Klenow da DNA polimerase I. Ligue a estrutura do plasmídeo de extremidade romba usando T4 DNA ligase para gerar o vetor excluído por eGFP.
    NOTA: A deleção do gene eGFP é realizada para reduzir o tamanho geral do vetor. Um tamanho de vetor maior pode limitar as etapas de clonagem e transfecção a jusante.
  2. Obter as sequências codificantes para o domínio catalítico (CD) do gene DNMT3A e o comprimento total do gene HDAC1 . Acrescente um códon de parada na extremidade 3' (a jusante) de cada sequência de codificação. Adicione os locais de restrição BglII (5') e AseI (3') flanqueando as sequências.
  3. Digerir o vetor pEPI-1 excluído por eGFP com BglII e AseI. Separadamente, digerir as sequências codificadoras DNMT3A(CD) e HDAC1 preparadas com as mesmas enzimas. Execute duas reações de ligação independentes:
    1. Ligue o fragmento DNMT3A(CD) no vetor digerido para gerar a construção pEPI-1-DNMT3A.
    2. Ligue o fragmento HDAC1 no vetor digerido para gerar a construção pEPI-1-HDAC1.
      NOTA: Os locais BglII e AseI colocam as inserções a jusante do promotor pCMV e a montante do elemento S/MAR para uma expressão ideal.
  4. Transforme Escherichia coli quimicamente competente (por exemplo, E. coli competente NEB 5-alfa, alta eficiência) com os produtos de ligação de cada vetor separadamente. Colocar as células transformadas em ágar LB contendo canamicina (50 μg/ml) e incubar durante a noite a 37 °C. Selecione colônias positivas e isole o DNA do plasmídeo usando o método miniprep de ebulição rápida27,28.
  5. Obtenha a sequência que codifica o SpCas9 cataliticamente morto (dCas9). Introduza os seguintes elementos na ordem especificada:
    1. Na extremidade 5': local de restrição de AscI, sequência de consenso de Kozak e códon de início (ATG).
    2. Na extremidade 3': NLS, opcionalmente uma tag HA, seguida por um local de restrição BamHI.
  6. Digerir os vetores pEPI-1-DNMT3A e pEPI-1-HDAC1 com AscI e BamHI. Execute a mesma digestão no inserto dCas9. Ligue o fragmento dCas9 em cada vetor respectivo.
    NOTA: Os sites AscI/BamHI garantem que o dCas9 seja inserido a montante de DNMT3A ou HDAC1, diretamente a jusante do promotor pCMV. Certifique-se de que um ligante curto ou alguns nucleotídeos estejam presentes entre dCas9 e o efetor epigenético para manter o quadro de leitura correto.
  7. Transforme os produtos finais de ligação em cepas de E. coli competentes de alta eficiência com controle rígido da expressão de plasmídeos (por exemplo, E. coli competente com NEB 5-alfa F'Iq, alta eficiência). Selecione transformantes em placas de canamicina. Prepare DNA de plasmídeo de alta qualidade a partir de clones positivos usando o método miniprep de ebulição rápida.
  8. Sequencie as construções finais do plasmídeo (pEPI-1-dCas9-DNMT3A e pEPI-1-dCas9-HDAC1) usando sequenciamento de nanoporos para confirmar a montagem correta de todos os componentes, verifique o quadro de leitura usando uma ferramenta de tradução on-line (por exemplo, ferramenta de tradução Expasy 3.0) e verifique possíveis mutações ou eventos de recombinação usando uma ferramenta de alinhamento on-line (por exemplo, ferramenta de alinhamento BLAST).
    NOTA: Vetores grandes são mais propensos à recombinação e podem acumular mutações. Portanto, a validação completa da sequência é essencial.
  9. Fosforilar os grupos hidroxila 5 'de oligonucleotídeos sgRNA direto e reverso usando polinucleotídeo quinase T4. Hibridizar as duas fitas complementares aquecendo a mistura a 90 ° C por vários minutos para desnaturar as estruturas secundárias e, em seguida, permitir o resfriamento gradual à temperatura ambiente durante a noite para o recozimento completo em DNA de fita dupla.
  10. Digerir o vetor de expressão de sgRNA pGuide selecionado com BamHI e Esp3I. Ligue o fragmento de sgRNA de fita dupla recozido no vetor linearizado usando T4 DNA ligase.
  11. Usando primers de PCR específicos (Tabela Suplementar 3), amplifice o completo de expressão de gRNA compreendendo (1) promotor U6, (2) sequência de sgRNA clonada e (3) andaime de sgRNA. Use uma DNA polimerase de alta fidelidade que não gere saliências de 3' (ou seja, uma polimerase de revisão) para garantir produtos de PCR limpos e sem corte adequados para clonagem a jusante.
  12. Repita as etapas 2.9-2.11 para cada gRNA individual projetado na seção 1. Certifique-se de que cada de gRNA seja preparado e amplificado separadamente para preservar a especificidade do alvo.
  13. Digerir os vetores pEPI-1-dCas9-DNMT3A e pEPI-1-dCas9-HDAC1 com SacII. Embote as extremidades pegajosas usando o fragmento de Klenow da DNA polimerase I. Clone os de andaime promotor-sgRNA U6 previamente amplificados nesses vetores usando ligase T4.
    NOTA: Várias combinações de efetores epigenéticos de gRNA (por exemplo, sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1, etc.) foram construídas durante a fase experimental. No entanto, apenas duas combinações selecionadas foram transportadas para os experimentos apresentados nas seções subsequentes.
  14. Transforme os produtos finais de ligação em cepas de E. coli competentes de alta eficiência com controle rígido da expressão do plasmídeo. Selecione transformantes em placas de canamicina. Prepare DNA de plasmídeo de alta qualidade a partir de clones positivos usando o método miniprep de ebulição rápida.
  15. Sequencie as construções finais do plasmídeo usando sequenciamento de nanoporos, verifique o quadro de leitura e verifique possíveis mutações ou eventos de recombinação.

3. Cultura celular e transfecção

  1. Manter as células K562 em frascos de cultura T-75 a 37 °C, em condições de CO2 a 5% e humidade. Use o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal (FBS) a 10%, solução de penicilina/estreptomicina a 1× (caneta/estreptococos).
  2. Prepare plasmídeos para transfecção:
    1. Use 8 μg de DNA plasmídico total por transfecção, portanto, 4 μg de cada plasmídeo para uma co-transfecção de dois plasmídeos. Quantificar o ADN utilizando a absorvância a 260 nm e, em seguida, diluir a quantidade necessária em 90 μL de água ultrapura.
    2. Adicione 10 μL de solução de acetato de sódio 3 M e 2,5 volumes de etanol 100% ao DNA diluído.
    3. Misture bem e incube a -20 °C durante a noite para precipitar o DNA.
      NOTA: Ao co-transfectar dois plasmídeos com combinações distintas de efetores epigenéticos de gRNA (por exemplo, gRNA1-dCas9-DNMT3A e gRNA2-dCas9-HDAC1), recomenda-se combinar os dois plasmídeos no mesmo tubo de precipitação para simplificar o manuseio para procedimentos a jusante.
    4. No dia seguinte, centrifugar os tubos de precipitação de ADN a 11 000 × g durante 15 min a 4 °C.
      NOTA: Execute todas as etapas subsequentes em condições estéreis em um gabinete de biossegurança, pois esta etapa também envolverá o manuseio de células vivas.
    5. Descarte cuidadosamente o sobrenadante. Adicionar 500 μl de etanol a 70 % para lavar o sedimento. Centrifugue a 11.000 × g por 5 min a 4 °C.
    6. Remover completamente o sobrenadante de etanol. Deixe o pellet secar ao ar até que não haja mais etanol visível.
    7. Ressuspenda completamente o pellet de DNA seco em 50 μL de DMEM. Manter a solução de plasmídeo-DMEM a 4 °C até à utilização.
    8. Execute 400 ng do DNA epissomal preparado (aproximadamente 2,5 μL da solução ressuspensa) em um gel de agarose a 1% para verificar o sucesso da purificação e integridade do DNA antes da transfecção.
  3. Prepare as células:
    1. Colha células K562 de um frasco T-75 quando as culturas atingirem 50-60% de confluência para garantir a eficiência da transfecção.
    2. Conte as células usando um hemocitômetro. Transfira um volume contendo 2 × 105 células para uma placa de cultura de 35 mm contendo 900 μL de DMEM sem FBS ou antibióticos.
      NOTA: Use DMEM sem soro para todas as etapas do procedimento de transfecção. Retome as condições de cultura de meio completo somente após a conclusão do período de incubação da transfecção.
    3. Coloque o prato na incubadora (37 °C, 5% CO2) para manter as células prontas para a transfecção.
  4. Use um kit de transfecção à base de lipofectamina para entrega de plasmídeo. Siga as instruções do fabricante para o kit específico usado, ajustando os volumes, se necessário.
    1. Adicione 3 μL de reagente P3000 (fornecido no kit de transfecção) à solução plasmídica-DMEM preparada. Misture suavemente e incube a mistura de reagentes plasmídeo-P3000 em temperatura ambiente por 5 min.
    2. Adicione 5 μL de reagente de lipofectamina 3000 (fornecido no kit de transfecção) junto com DMEM suficiente para atingir um volume total de reação de 100 μL. Incube em temperatura ambiente por 15 min.
    3. Adicione a mistura de transfecção completa de 100 μL ao prato de 35 mm contendo células. Agite suavemente o prato para dispersar a mistura e, em seguida, devolva o prato à incubadora.
  5. Às 24 h após a transfecção, adicione 3 mL de meio completo (DMEM suplementado com 10% de FBS e 1× de caneta / estreptococo) a cada placa de 35 mm para iniciar a proliferação de células transfectadas. Às 72 horas após a transfecção, inicie o procedimento de seleção adicionando o antibiótico G-418 a uma concentração final de 1 mg/mL.
  6. Uma vez que a seleção esteja adequadamente estabelecida e a contagem total de células exceda 1 × 106, prossiga para isolar clones únicos (Figura 3A) usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS):
    1. Colher as células por centrifugação a 300 × g durante 6 min a 25 °C. Lave uma vez com 1× solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS, pH ~ 7,4) e centrifugue novamente nas mesmas condições.
    2. Ressuspenda o pellet celular em 1× PBS e determine a concentração celular usando um hemocitômetro. Diluir a suspensão para 1 × 106 células/mL, garantindo uma ressuspensão completa.
    3. Configure o FCS mais curto para o modo de célula única (garante 1 célula por gota), usando uma placa tratada com cultura de tecidos de 96 poços como dispositivo de coleta. Ajuste as configurações do software, se necessário, dependendo do instrumento usado (Figura 3B).
    4. Bloqueie a população primária com base no tamanho esperado (FSC) e na granularidade (SSC). Exclua detritos (baixo FSC/SSC) e material altamente granular ou morto (alto SSC). Use gráficos de pontos FSC-A vs. FSC-H ou SSC-A vs. SSC-H para gatear singlets.
    5. Pré-encha a placa de 96 poços com 100 μL de meio cheio contendo 1 mg/mL G-418 por alvéolo. Aqueça o prato na incubadora antes de separar.
    6. Execute a classificação no modo de célula única, mantendo uma taxa de classificação abaixo de 300 eventos/segundo para aumentar a precisão da classificação.
    7. Após a classificação, inspecione os poços ao microscópio para confirmar uma célula por poço. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
  7. Permita que clones de célula única se expandam individualmente na placa de 96 poços. Uma vez estabelecido o crescimento clonal, reduza a concentração de G-418 para 400 μg/mL para manter a seleção.
  8. Transfira clones de crescimento bem sequencialmente para placas de 12 poços, depois para frascos T-25 e finalmente T-75 conforme necessário, até que cada clone atinja ~ 1 × 106 células.
  9. Colete pellets de células duplas em intervalos regulares. Armazene um pellet a -20 °C para extração de DNA genômico. Além disso, armazene um pellet homogeneizado em 500 μL de Trizol Reagent a -20 °C para extração de RNA e síntese de cDNA.
    CUIDADO: O reagente Trizol deve ser manuseado com cautela devido à sua toxicidade e natureza corrosiva em uma capela de exaustão química enquanto estiver usando equipamento de proteção individual, e os materiais contaminados devem ser rotulados para descarte de resíduos perigosos.
  10. Extraia DNA genômico de clones selecionados usando extração tradicional de fenol-clorofórmio, seguida de precipitação de etanol.
    CUIDADO: Fenol: clorofórmio é tóxico e corrosivo e deve ser manuseado em um exaustor químico enquanto estiver usando equipamento de proteção individual. Descarte os resíduos que contêm fenol e clorofórmio como resíduos químicos perigosos.
  11. Certifique-se de que o DNA seja totalmente ressuspenso em água livre de nuclease ou tampão TE. Meça a concentração e a pureza do DNA usando um espectrofotômetro antes de prosseguir para aplicações a jusante.
    NOTA: Este DNA será usado em experimentos a jusante, como PCR e pirosequenciamento, para avaliar a eficiência da edição epigenética.
  12. Extrair o RNA total dos sedimentos celulares utilizando o reagente Trizol, seguido de precipitação de isopropanol29. Manuseie as amostras de RNA com cuidado, garantindo reagentes e descartáveis isentos de RNase e mantendo as amostras a 4 °C durante o procedimento.
    NOTA: O RNA total será usado para a síntese de cDNA usando um kit de transcrição reversa.

4. PCR para confirmar a presença de ambos os epissomos em clones

  1. Colha aproximadamente 5 × 105 células de cada clone de cultura, depois de ressuspender completamente as células. Centrifugue a 7.000 x g por 3 min a 25 °C. Rejeitar o meio sobrenadante.
  2. Lave a célula ressuspendendo em 1× PBS. Centrifugue novamente nas mesmas condições.
  3. Rejeitar o sobrenadante, deixando um pequeno volume, logo acima do nível do pellet. Use 1 μL da suspensão celular diretamente como modelo para PCR.
  4. Alternativamente, use 200 ng de DNA genômico purificado extraído dos clones transfectados.
    NOTA: A PCR direta das células lavadas fornece um método de triagem rápido, mas pode produzir resultados variáveis. Para maior especificidade e sensibilidade, use DNA genômico purificado como modelo.
  5. Preparar a mistura principal de PCR de acordo com o quadro 1.
  6. Use dois conjuntos de primers, com um primer direto comum direcionado à sequência dCas9 e primers reversos separados específicos para cada vetor efetor epigenético (Tabela Suplementar 3).
  7. Siga as condições de ciclismo apresentadas na Tabela 2.
  8. Execute produtos de PCR em gel de agarose ou analise com eletroforese capilar para verificar os tamanhos dos produtos: 230 pb para o vetor contendo DNMT3A e 205 pb para o vetor contendo HDAC1 (Figura 3C). Inclua um controle positivo (mistura de ambos os plasmídeos em uma concentração de 10-20 ng) para confirmar os tamanhos de banda esperados e validar a eficiência da PCR. Inclua um NTC (controle sem modelo).
ReagenteConcentração/quantidade final
10× Buffer1×
Primer direto1 μΜ
Primers reversos0,5 μM
ADN200 ng
Polimerase1,25 U
dNTPs200 μM cada
Água, sem nucleaseaté 50 μL

Tabela 1: Mistura de reação de PCR para verificação do epissoma.

PassoTemperatura, °CHoraNúmero de ciclos
Desnaturação inicial953 minutos1
Desnaturação9530 s30
Recozimento5830 s
Extensão721 minuto
Extensão final725 min1

Tabela 2: Condições de ciclagem de PCR para verificação do epissomo.

5. Análise de pirosequenciamento direcionada

  1. Trate o gDNA (1,5 μg) extraído de clones transfectados com um kit de conversão de bissulfito de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Cartilhas de design flanqueando os locais CpG dentro da região regulatória visada pelos construtos. Use uma ferramenta de design de primer de bissulfito dedicada. Siga estas diretrizes de design:
    1. Converta a ilha CpG ou a região regulatória do site CpG para a versão convertida em bissulfito.
    2. Projete um primer direto e reverso para amplificação por PCR de DNA convertido em bissulfito. Inclua um rótulo de biotina em um primer (geralmente o inverso) para imobilização em esferas revestidas com estreptavidina.
    3. Projete um primer de sequenciamento (18-25 pb) interno ao produto de PCR, a montante do primeiro CpG de interesse. Como região alvo, selecione uma janela de 100 pb a montante ou a jusante do local de ligação do sgRNA para avaliar possíveis modificações epigenéticas locais.
    4. Evite locais CpG dentro das sequências de primers para garantir amplificação imparcial.
    5. Escolha um par de primers com uma pontuação de software de design de ensaio superior a 75% e uma classificação de qualidade de 'alta' (azul), o que indica que a análise do software não identificou nenhum problema ou preocupação.
      NOTA: Para sequências de primers projetadas para atingir a ilha CpG 326, consulte a Tabela Suplementar 3. Os primers foram projetados para se ligar em regiões flanqueando os sítios de ligação sgRNA1 e sgRNA2, permitindo o sequenciamento de sítios CpG ao redor dos loci alvo.
  3. Configure uma reação de PCR usando uma DNA polimerase de partida a quente de alta fidelidade otimizada para modelos de bissulfito.
  4. Procedimento de pirosequenciamento:
    1. Ligue produtos de PCR biotinilados a esferas de sepharose revestidas com estreptavidina e isole o DNA de fita simples usando uma estação de trabalho de pirosequenciamento.
    2. Adicione o primer de sequenciamento ao DNA de fita simples no tampão de recozimento. Aqueça a mistura a 80 °C durante 2 minutos e deixe-a arrefecer gradualmente até à temperatura ambiente.
    3. Realize reações de sequenciamento usando o instrumento de pirosequenciamento e a ordem de dispensação definida durante o projeto do primer.
  5. Análise de dados:
    1. Use um software de pirosequenciamento dedicado para quantificar a porcentagem de metilação em cada local CpG.
    2. Compare os níveis de metilação entre clones transfectados e não transfectados. Avalie a eficiência da edição (Figura 3D). Considere a realização de um teste t não pareado bicaudal para comparar os níveis de metilação entre controles não tratados e cada clone transfectado em cada local CpG individual.

6. Síntese de cDNA e PCR digital para análise da expressão de dCas

  1. Preparar RNA total (1.100 ng por reação) extraído de clones transfectados em 12 μL de água livre de RNase. Mantenha as amostras no gelo.
  2. Monte a mistura de eliminação de DNA genômico no gelo: Misture 2 μL de tampão de limpeza de gDNA, amostra de RNA contendo 1.100 ng de RNA total e água livre de RNase até um volume final de 14 μL. Incube por 2 min a 42 ° C e coloque no gelo.
  3. Prepare a mistura principal de transcrição reversa no gelo: Misture 4 μL de tampão RT com 1 μL de primers RT e adicione 1 μL de transcriptase reversa.
  4. Combine 14 μL de mistura de eliminação de DNA genômico com 6 μL de mistura mestre de transcrição reversa para um volume total de reação de 20 μL. Misture suavemente e incube a 42 ° C por 15 min. Inativar a transcriptase reversa aquecendo a 95 °C durante 3 min.
    NOTA: Armazene o cDNA a -20 ° C até uso posterior.
  5. Dilua o cDNA de todas as amostras 1:1 com água livre de nuclease. Use o cDNA diluído para análise de PCR digital a jusante, usando um sistema de PCR digital com primers específicos para dCas (Tabela Suplementar 3):
    1. Prepare a mistura 4× Master e a mistura de reação de acordo com a Tabela 3. Adicione cDNA diluído à mistura e pipete suavemente para garantir uma mistura completa.
      NOTA: Configure reações em pelo menos duplicatas para todos os clones. Inclua um controle negativo (cDNA de células K562 não tratadas) e um NTC.
    2. Carregue 9 μL da mistura de reação em cada poço da placa de PCR. Configure o sistema de PCR usando as condições de ciclagem apresentadas na Tabela 4.
    3. Selecione o canal de corante FAM para detecção e inicie a execução.
    4. Após a conclusão, recupere as amostras e analise os dados.
      NOTA: A PCR digital relata os resultados como cópias por μL de reação.
    5. Multiplique o valor relatado (cópias/μL) pelo volume de reação (10 μL) para obter o total de cópias por reação. Divida esse valor pela quantidade de cDNA na reação para obter cópias por ng de cDNA (equivalente à entrada de ng RNA).
      NOTA: Se o protocolo exato for seguido, cada amostra começa com 1.100 ng de RNA em uma reação de RT de 20 μL (55 ng/μL). Após diluição 1:1, a concentração de trabalho é de 27,5 ng/μL e, como 1 μL é adicionado a cada reação de PCR, isso corresponde a 27,5 ng de cDNA (equivalente a RNA) por reação.
Mixagem master (4×)
ReagenteConcentração/quantidade final
25× Corante verde SYBR2×
5× Mistura de PCR digital4×
Água, sem nucleaseaté 100 μL
Mistura de reação
ReagenteConcentração/quantidade final
4× Mistura mestre1×
Primer direto1 μΜ
Primer reverso1 μΜ
cDNA (diluído)1 μL
Água, sem nucleaseaté 10 μL

Tabela 3: 4× Master mix e mix de reação para análise de PCR digital da expressão de dCas.

PassoTemperatura, °CHoraNúmero de ciclos
Desnaturação inicial9610 minutos1
Desnaturação965 segundos40
Recozimento/Extensão6015 s

Tabela 4: Condições de ciclagem para PCR digital.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para investigar se nossas ferramentas de edição epigenética direcionadas poderiam induzir alterações de metilação de DNA específicas do local na ilha ZBTB7A CpG 326, primeiro geramos vetores epissómicos que codificam dCas9 fundido a DNMT3A (CD) ou HDAC1, juntamente com vários sgRNAs projetados com locais-alvo dentro da ilha CpG 326. Inicialmente, co-transfectamos células K562 com combinações desses plasmídeos para avaliar se a entrega simultânea de sgRNA e módulos efetores poder...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma das etapas mais críticas neste protocolo é o design de sgRNAs altamente específicos. Os efeitos fora do alvo são uma limitação conhecida dos sistemas de edição epigenética baseados em CRISPR, que muitas vezes podem surgir da infidelidade de ligação do dCas9, bem como da atividade não específica dos domínios efetores. Para minimizar isso, os sgRNAs devem ser projetados usando ferramentas de bioinformática que otimizam para alta atividade no alvo e ligação mínima fora do alvo

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses financeiros ou não financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Dereki e Vasiliki Chondrou são apoiados por uma bolsa de três anos (Grant No. 80706) da Conta Especial de Fundos de Pesquisa (ELKE) da Hellenic Open University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Mistura Mestre Digital PCR Absolute Q DNA (5x)Biossistemas AplicadosA52490
AgeI-HF NEBR3552
ASCINEBR0558
ASEINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
Separador de Células Melodias BD FACSBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Mistura de Solução de Desoxinucleotídeos (dNTP) (10 mM cada)NEBN0447
DMEM Glicose Alta com Glutamina estável, com meio de Piruvato de SódioBiowestL0103
DNA polimerase I, Fragmento Grande (Klenow)NEBM0210
DNMT3A (CD), sequências HDAC1IDT
DreamTaq DNA Polimerase Termo CientíficaEP0712
EpiTectQiagen59104Kit de conversão de bissulfito  
Kit de bisulfito EpitectQiagen59104
Esp3INEBR0734
Soro Fetal BovinoGibcoA5256701
Antibiótico seletivo de geneticina (G418 sulfato)Gibco11811031
Kit de transfecção Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015
NEB®   5-alfa Competent E. coli  (Alta eficiência)NEBC2987I
NEB®   5-alfa F'Iq  Competent E. coli  (Alta eficiência)NEBC2992H
Tecido Nucleospin  Macherey-Nagel740952.50
PBS, solução 10x pH 7,4LonzaBE17-517Q
Solução de penicilina-estreptomicina 100xBiowestL0022
Vetor pGuideOriGene TechnologiesGE100042
Fenol:Clorofórmio:Isoamílico Álcool 25:24:1 Saturado com 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM de EDTASigma-AldrichP2069
Primers, sgRNAs e nbsp;Eurofinas
Projeto de Ensaio PyroMark  QiagenVersão 2.0Ferramenta de design de primer de bisulfito  
Reagentes PyroMark Gold Q24Qiagen970802
Kit de PCR PyroMark & nbsp;Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenEstação de trabalho de pirosequenciamento 
PyroMark Q24 Software Qiagenv2.0.8Software de pirosequenciamento  
Q5® DNA polimerase de alta fidelidadeNEBM0491
Kit de Transcrição Reversa QuantiTectQiagen205311
Kit de Placa QuantStudio Absolute Q MAP16Biossistemas AplicadosA52865Sistema de PCR Digital  
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, concentrado 10.000x em DMSOInvitrogenS7563
T4 DNA LigaseNEBM0202
Polinucleotídeo quinase T4NEBM0201
Reagente TrizolInvitrogen15596026

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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