Artigo de método

Isolamento de Protoplast de Alta Qualidade Específico para Tecidos para Análises de Células Únicas em Arabidopsis

DOI:

10.3791/69330

⸱

6 de fevereiro de 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo apresenta um protocolo aprimorado de isolamento de protoplastos para raizes, folhas, caules e tecidos florais de Arabidopsis thaliana. Ele utiliza etapas otimizadas de digestão e purificação enzimática para minimizar danos e detritos celulares, aumentando assim o rendimento e obtendo protoplastos de alta qualidade para métodos unicelulares, como sequenciamento de RNA unicelular.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) tornou-se uma ferramenta essencial na biologia vegetal para obter informações de alta resolução sobre expressão gênica específica de tipo celular, dinâmica do desenvolvimento e respostas específicas de tecidos a fatores ambientais. Um grande desafio técnico na aplicação do scRNAseq às plantas é o isolamento eficiente e reprodutível de células únicas viáveis sem paredes celulares, representando a heterogeneidade dos tecidos vegetais. O isolamento de protopasto, que remove enzimaticamente a parede celular para produzir células vegetais vivas únicas, é uma abordagem amplamente utilizada para esse fim. No entanto, o isolamento bem-sucedido do protoplasto requer otimização cuidadosa para manter a viabilidade celular e preservar perfis transcriptomais específicos do tipo celular. Aqui, apresentamos um protocolo robusto e reprodutível para isolar protoplastos de alta qualidade de múltiplos tecidos da Arabidopsis thaliana , incluindo tecidos acima do solo (folhas, caules, flores) e tecidos radiculares. Este protocolo leva em conta as propriedades fisiológicas únicas dos tipos de tecidos, otimizando as condições enzimáticas de digestão e as etapas de purificação para garantir alto rendimento e ampla representação de diversos tipos celulares. Os protoplastos resultantes são adequados para aplicações como scRNAseq, citometria de fluxo (FACS) e análise de expressão gênica transitória. Ele permite a geração de suspensões unicelulares a partir de múltiplos tipos de tecido. O método apresentado apoia a exploração da heterogeneidade celular e aumenta a confiabilidade das abordagens unicelulares na pesquisa com plantas.

Introdução

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O sequenciamento de RNA unicelular (scRNAseq) revolucionou a biologia vegetal ao permitir a análise da expressão gênica em uma resolução sem precedentes. O scRNAseq fornece informações do transcriptoma sobre heterogeneidade celular, trajetórias de desenvolvimento e respostas a estímulos ambientais na resolução específica do tipo celular 1,2,3.

Diferentemente dos sistemas animais, a parede celular rígida das plantas e a complexidade estrutural dos tecidos vegetais apresentam barreiras significativas para o isolamento eficiente de células individuais para análise transcriptômica. Entre os métodos disponíveis, a remoção enzimática da parede celular para produzir protoplastos surgiu como um método amplamente utilizado, desenvolvido há mais de 60 anos 4,5,6. Apesar de seu uso generalizado, o isolamento de protoplastos continua sendo um procedimento tecnicamente exigente que requer otimização específica para tecido para equilibrar rendimento celular, viabilidade e um transcriptoma estável. Métodos alternativos, como o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq), evitam a necessidade de digestão da parede celular ao isolar o núcleo7. No entanto, isso tem o custo de perder informações sobre os transcritos maduros presentes no citoplasma. Outros métodos de dissociação física, como microdissecação mecânica e assistida por laser, evitam a digestão enzimática da parede celular, mas frequentemente são suscetíveis à contaminação cruzada e podem resultar em menor viabilidade celular e taxa limitada 8,9,10.

Muitos atlas celulares vegetais foram desenvolvidos nos últimos anos, especialmente para Arabidopsis, fornecendo insights importantes sobre as paisagens transcriptômicas de vários tecidos 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . No entanto, esses atlas são baseados principalmente em plantas em estágios juvenis ou de mudas, focando principalmente em tecidos radiculares ou foliares. Os protocolos usados nesses estudos exigem processos de otimização para tecidos mais antigos de Arabidopsis, como folhas maduras, flores e caules. Além disso, até o uso de estudos de sequenciamento específicos por tipo celular, como scRNAseq ou Filtração Celular Ativada por Fluorescência (FACS), combinados com sequenciamento de RNA, as alterações no transcriptoma causadas pelo isolamento do protoplasto não foram totalmenteconsideradas 19.

O método apresentado aqui se baseia em esforços anteriores e apresenta várias melhorias críticas: ele leva em conta a variabilidade fisiológica e anatômica entre os tecidos vegetais ao otimizar as concentrações de tampão tanto para os tecidos radiculares quanto acima do solo (folhas, caules, flores) e incorpora etapas suaves de purificação para minimizar danos celulares e melhorar a pureza dos protoplastos. Comparado às abordagens baseadas em núcleos, esse método tem potencial para reter o transcriptoma da célula inteira, permitindo informações de maior resolução das moléculas maduras de mRNA presentes no citosol. Importante destacar que o procedimento resulta em alta viabilidade do protoplasto, heterogeneidade e concentrações reprodutíveis entre tecidos, variando de aproximadamente 9,8 × 103 células/mg em flores até 2,2 ×10 2 células/mg em folhas.

O objetivo geral do método apresentado é apresentar um protocolo robusto e reprodutível de isolamento de protoplastos, adaptado para múltiplos tecidos de Arabidopsis thaliana, atendendo a uma necessidade crítica de entrada de alta qualidade que cubra diversos tipos celulares para estudos de células únicas em plantas.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os reagentes e os equipamentos utilizados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do tampão

  1. Prepare o respectivo tampão de isolamento doprotoplasto 17,18 de acordo com a Tabela 1 em um tubo centrífugo de 15 mL; Buffer de isolamento de protoplastos radiculares para tecido radicular ou buffer de isolamento de protoplastos de flor/caule/folha para tecidos acima do solo.
    NOTA: Quantidade aproximada de tampão de isolamento de protoplasto necessária para cinco plantas com flores de Arabidopsis thaliana colhidas (estágios 11-12 com botões florais fechados): Raiz (~ 375 mg): 7 mL, Folha (~930 mg): 5 mL, Caule (~215 mg): 3 mL, Flor (~10 mg): 2 mL.
  2. Adicione 2% (p/v) de celulase RS e 1% (p/v) de Macerozima R10 fresca antes de usar o tampão de isolamento de protoplastos de raiz/folha. Misture bem colocando o buffer de isolamento do protoplasto em um rotador até que o pó esteja completamente dissolvido (cerca de 10 minutos a 25 °C). Evite criar bolhas de ar e certifique-se de que não restem grumos de pó dentro do buffer.

2. Digestão de tecidos

  1. Filtre o respectivo tampão de isolamento do protoplasto através de um filtro de 0,2 μm antes de usá-lo. Use uma placa de Petri de tamanho padrão (100 mm x 15 mm) para folhas e raízes, e uma placa de Petri pequena (30 mm x 15 mm) para pequenas quantidades de tecidos, como flores. Adicione algumas gotas de buffer de isolamento de protoplastos na placa de Petri antes de transferir os tecidos.
  2. Transfira o papel de papel respectivo para a placa de Petri e corte-o em pedaços menores por movimentos verticais usando uma lâmina de barbear de forma fina e rápida (Figura 1A).
    NOTA: Sempre use lâminas e pinças diferentes para cada amostra para evitar contaminação cruzada. Use luvas de proteção ao manusear a lâmina de barbear.
  3. Adicione o restante do tampão de isolamento do protoplasto na respectiva placa de Petri para imergir o tecido picado e incube a 25 °C por 1 hora. Mantenha os tecidos acima do solo na bancada (sem tremores) e transfira os tecidos radiculares para uma plataforma agitadora orbital (60 rpm).

3. Filtragem

  1. Amostra de raiz após a incubação:
    1. Usando uma pipeta Pasteur, transfira os protoplastos da placa de Petri para um Filtro de Células de 40 μm colocado sobre um tubo centrífugo aberto pré-resfriado de 50 mL.
    2. Para colher os protoplastos restantes, adicione exatamente o mesmo volume de solução W5 (2 mM pH 5,7 de MES, 154 mM de NaCl, 125 mM deCaCl 2, 5 mM de KCl) na mesma placa de Petri para coletar os protoplastos aderidos à base da placa de Petri. Transfira os protoplastos ressuspensos na solução W5 para o mesmo Filtro de Célula de 40 μm colocado sobre um tubo centrífugo aberto pré-resfriado de 50 mL.
    3. Passe uma segunda vez por um novo Filtro de Célula de 40 μm em um novo tubo de centrífuga pré-resfriado de 50 mL. De agora em diante, mantenha as amostras no gelo e seja muito cuidadoso ao manusear os protoplastos.
  2. Amostras acima do solo após a incubação:
    1. Usando uma pipeta Pasteur, transfira os protoplastos da placa de Petri para um Filtro de Células de 70 μm colocado sobre um tubo de centrífuga aberto pré-resfriado de 50 mL.
    2. Para colher os protoplastos restantes, adicione exatamente o mesmo volume de solução W5 (2 mM de pH 5,7 de MES, 154 mM de NaCl, 125 mM deCaCl 2, 5 mM de KCl) na mesma placa de Petri para coletar os protoplastos aderidos à base da placa de Petri. Transfira os protoplastos ressuspensos na solução W5 para o mesmo Filtro de Célula de 70 μm colocado sobre um tubo centrífugo aberto pré-resfriado de 50 mL. De agora em diante, mantenha as amostras no gelo e seja muito cuidadoso com os protoplastos.

4. Lavagem e purificação de Ficoll

  1. Pré-resfrie a centrífuga a 4 °C e colete (pellet) os protoplastos por 5 minutos a 500 × g sem freio na centrífuga.
  2. Amostra de raiz após centrifugação:
    1. Descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet de protoplasto.
    2. Resuspenda os protoplastos muito suavemente em um buffer de ressuspension radicular pré-resfriado (4 °C) de 600-700 μL (partes iguais do buffer de isolamento do protoplasto radicular (sem enzimas) e solução W5) usando uma pipeta Pasteur ou uma pipeta Gilson de 1 mL com ponta cortada para evitar cisalhamento.
    3. Transfira a suspensão para tubos pré-resfriados de 1,5 mL (4 °C).
  3. Amostras acima do solo após centrifugação:
    1. Descarte o sobrenadante sem mexer na bola.
    2. Resuspenda o pellet muito suavemente em um tampão de ressuspension de flores/caule/folhas pré-resfriado (4 °C) de 600-700 μL (partes iguais de tampão de isolamento de protoplastos flor/caule/folha (sem enzimas) e solução W5) usando uma pipeta Pasteur ou uma pipeta Gilson de 1 mL com ponta cortada para evitar cisalhamento.
    3. Transfira a suspensão para tubos pré-resfriados de 1,5 mL (4 °C).
    4. Prepare 300 μL de solução Ficoll PM 400 a 13,3% (p/v) em um tubo de 1,5 mL. Misture e deixe no gelo.
    5. Adicione a amostra de protoplasto ressuspensa (600-700 μL) lentamente sobre a solução preparada de Ficoll, sem tocar/misturar a camada de Ficoll.
    6. Centrifuge a 4 °C por 5 minutos a 700 × g com ajuste zero de freio da centrífuga.
    7. Colete os protoplastos presentes na camada média (interface) junto com a fase superior (primeira camada) (Figura 1B). Tenha cuidado para não coletar a terceira camada inferior, que contém Ficoll e os detritos separados. Armazene a 4 °C até uso adicional.

5. Contagem e verificação de qualidade

  1. Use 10 μL da solução do protoplasto para contar o número de protoplastos isolados com um hemocitômetro de Neubauer.
    OPCIONAL: Pode ser adicionado 1% (p/v) de corante Evans Blue para avaliar a viabilidade dos protoplastos (Figura 1C).
  2. Dilua a solução do protoplasto até a concentração necessária de protoplastos/mL usando um tampão de ressuspension pré-resfriado (4 °C) (explicado no passo 4.2.2 para a raiz e no passo 4.3.2 para tecidos acima do solo) do respectivo tecido.
  3. Prossiga com o experimento pretendido o mais rápido possível, por exemplo, sequenciamento de RNA unicelular e/ou FACS15,19.

Resultados

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Os protocolos de isolamento de protoplastos implementados para tecidos acima do solo e radiculares permitem com sucesso a digestão eficiente da parede celular e a liberação de células isoladas intactas de todos os tecidos da Arabidopsis thaliana. Nos tipos de tecido testados, que incluíam flores, caules, folhas e raízes, o processo enzimático de digestão produziu protoplastos bem separados com um número mínimo de grupos celulares não digeridos (Figura 2A-D). Os ensaios de corante Evans Blue confirmaram que os protoplastos que apresentaram morfologia esférica com limites suaves de membrana plasmática são células viáveis (Figura 1C). Para cada tipo de tecido, foram contados os protoplastos esféricos. Flores continham em média 97.875 ± 7.531 (9.788 células/mg, n = 3), caules 119.025 ± 22.508 (550 células/mg, n = 4), folhas 210.483 ± 15.572 (225 células/mg, n = 3) e raízes 225.363 ± 52.561 (599 células/mg, n = 4).

As suspensões de protoplastos mostraram uma ampla distribuição de tamanhos celulares e a presença de plastídeos verdes ou claros, refletindo a composição celular heterogênea de cada tecido colhido (Figura 3A-D). Para confirmar isso, foi realizada uma isolação de protoplastos com uma linha repórtera YFP específica para célula companheira transgênica, e a suspensão continha pequenos protoplastos viáveis com um sinal YFP representando células companheiras (Figura 3E). Isso ressalta que o protocolo de isolamento de protoplastos utilizado é adequado para células vasculares difíceis de isolar com paredes celulares rígidas.

Com o método otimizado apresentado, é possível isolar um alto número de protoplastos viáveis com uma quantidade mínima de detritos de vários tecidos de plantas adultas. Para melhorar a purificação das amostras acima do solo, incluímos uma etapa de limpeza de almofada Ficoll para remover organelos liberados e outros detritos celulares das amostras digeridas, preservando a qualidade do transcriptoma (Figura 4).

Nas bibliotecas de cDNA de scRNAseq geradas a partir dos protoplastos, foram detectados transcritos de manutenção altamente expressos, como ACTIN2, e transcritos raros/de baixa expressão, como o fator de transcrição homeodomínio KNAT1, um marcador específico para células cambiais e meristemáticas, bem como os marcadores celulares companheiros SUC2 e PARCL1, por ensaios específicos de PCRde cDNA 15 (Figura 5). Isso indica uma ampla representação celular e heterogeneidade da população de protoplastos obtida, o que foi confirmado posteriormente pela análise dos dados de scRNAseq produzidos por essemétodo 15.

figure-results-1
Figura 1: Fluxo de trabalho das etapas de isolamento do protoplasto. São mostrados seis passos principais: (1) preparação do tampão, (2) digestão de tecidos, (3) filtração, (4) lavagem e purificação de Ficoll, (5) contagem e controle de qualidade, e (6) continuação com experimentos a jusante. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Imagens das etapas de preparação do protoplasto. (A) Imagem representativa da etapa de corte da amostra da folha (Passo 2.1). A imagem superior mostra o tecido colhido com algumas gotas de tampão em uma placa de Petri de tamanho padrão e uma lâmina de barbear para picar. A imagem abaixo, à esquerda, representa o tecido após alguns movimentos verticais com a lâmina de barbear (veja a seta). A imagem abaixo, à direita, representa a amostra picada, pronta para o próximo passo. (B) Imagem de uma almofada de Ficoll após centrifugação em um tubo de 1,5 mL (Passo 4.3.7). A seta branca indica a camada intermediária, que contém protoplastos. (C) Imagem representativa de microscópio de protoplastos foliares incubados no corante Evans Blue. Barra de escala: 250 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Imagens microscópicas de protoplastos gerados. Imagens de protoplast de cada tipo de tecido são exibidas. (a) flor, (b) caule, (c) folha, (d) raiz. Barra de escala: 250 μm. (E) Imagens do microscópio confocal de uma linha de repórter YFP específica para célula companheira. A primeira imagem (à esquerda) representa a expressão do repórter celular companheiro YFP na vasculatura foliar (cor verde). A segunda imagem (à direita) representa protoplastos de células que expressam o repárter YFP (sinal verde). A cor roxa/azul representa autofluorescência do cloroplasto. Barra de escala 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Imagens microscópicas de protoplastos foliares antes (A) e depois (B) da limpeza da almofada de Ficoll. Barras de escala: 250 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: PCRs de controle de qualidade das bibliotecas scRNAseq. Imagens representativas em gel de PCRs de controle de qualidade das bibliotecas de RNAseq unicelular de tecidos radicais e acima do solo. Genes testadosSUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (de A a D, respectivamente), e para cada tecido: flor, caule, folha, raiz da esquerda para a direita, respectivamente. cDNA (+) é usado como controle positivo, e água como controle negativo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Buffer de Protoplasting RadicularBuffer Protoplasting de Flores/Caules/Folhas
600 mM Mannitol400 mM Mannitol
2 mM MgCl2-
0,1% BSA0,1% BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 mM MES pH 5,720 mM MES pH 5,7
10 mM KCl20 mM KCl
Ajuste o pH para 5,5 com 1M de Tris Base, se necessárioAjuste o pH para 5,5 com 1M de Tris Base, se necessário

Tabela 1: Composições de buffer de isolamento de protopasto. São fornecidas receitas de isolamento de protetoplast para tecidos radiculares e acima do solo (flor, caule, folha).

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo otimizado para isolar protoplastos de vários tecidos de Arabidopsis foi adaptado para aplicações de scRNAseq, analisando todo o transcriptoma presente no citoplasma e nos núcleos. A otimização específica dos tampões para tecido e etapas adicionais para digestão e purificação resultaram em rendimentos robustos e reproduzíveis em diferentes tecidos. Especificamente, protoplastos de flores tiveram em média ~98.000 células por amostra (~9.788 células por mg de tecido), protoplastos tronco ~119.000 células (~550 células por mg), protoplastos foliares ~210.500 células (~225 células por mg) e protoplastos radiculares ~225.000 células (~599 células por mg), refletindo a diversidade estrutural e fisiológica desses tecidos.

Um refinamento chave nesse protocolo foi o uso de uma almofada à base de Ficoll em vez dos gradientes/almofadas à base de sacarose mais comumente usados para purificação. Ao contrário da sacarose, que é absorvida pelas células e tem um efeito importante sobre o transcriptoma 13,20,21, Ficoll é osmoticamente inerte e impermeável à membrana, preservando assim a integridade do RNA durante o isolamento22. Essa etapa também reduziu o número de organelos livres, como cloroplastos, provenientes de células quebradas e detritos celulares na suspensão. A presença desses detritos pode interferir na formação de gotículas ao entupir os canais dos dispositivos microfluídicos ou resultar na presença de mais de uma célula nas gotículas formadas, o que contribui para a contaminação por RNA ambiente. Todos esses fatores podem levar a conclusões incorretas ou vieses na análise dos dados de scRNA-seq.

Foi demonstrado que o isolamento de protoplastos pode alterar o transcriptoma das célulasvegetais 2,15,16,19. Uma estratégia chave nesse protocolo para minimizar esse artefato é manter os protoplastos a 4 °C (no gelo) após a digestão enzimática, o que desacelera a atividade metabólica e transcricional e, assim, reduz as alterações transcricionais conhecidas por estarem associadas ao isolamento de protoplastos. Além disso, é fundamental manter o tempo de colheita de tecidos consistente entre as replicações e alinhá-lo com o objetivo do estudo, já que variações no tempo demonstraram influenciar tanto genes induzidos por protoplastos quanto transcritos regulados circadianos detectados nos conjuntos de dadosscRNA-seq 15.

Nesse método, além de produzir células individuais com detritos mínimos, outro ponto muito importante foi manter a heterogeneidade dos tecidos para potencialmente representar todos os tipos celulares. A diversidade nas suspensões de protoplastos foi confirmada pela detecção de diferentes morfologias dos protoplastos, incluindo tamanhos diversos e a presença de sinais de linhas repórteres específicas de tipo celular dentro da população obtida (Figura 2). Além disso, a população de protoplastos foi avaliada detectando transcritos raros e específicos de tipo celular, bem como de manutenção em bibliotecas de cDNA de scRNA-seq usando PCR (Figura 4). Esses incluíram genes marcadores raros do meristema apical do broto e marcadores de célulascompanheiras 15. A captura bem-sucedida desses transcritos confirma que o método apresentado permite o isolamento de diversos tipos celulares com alta integridade, tornando-se uma ferramenta valiosa para o avanço da pesquisa com células únicas em plantas. Além do scRNAseq, esse método pode ser usado para citometria de fluxo, análise de expressão gênica transitória e ensaios de regeneração de plantas.

Divulgações

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Os autores declararam não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo faz parte de um projeto que recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (Acordo de Subvenção nº 810131).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RS  de celulase;Bioquímica DuchefaC8003
Modelo Centrífuga 5810REppendorf5810000010
Ficoll PM 400 Sigma-Aldrich26873-85-8
Macerozima R10Bioquímica DuchefaM8002
Microcentrífuga modelo 5417REppendorfDescontinuado
Filtro de Seringa Estéril Puradisc 30, 0,2 & micro; mCytiva10462200Referido como 0.2 & micro; Filtro m no protocolo
Filtro de Células Estériles 40 & micro; m Nylon Mesh Fisherbrand22363547
Filtro de Células Estériles 70 & micro; m Nylon Mesh Fisherbrand22363548

Referências

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