Monitoramento do ácido 2,4-diclorofenoxiacético em produtos de abelha por fluorescência de superfícies sólidas

Summary

Este trabalho propõe o desenvolvimento de uma nova metodologia alternativa às técnicas tradicionais para controle e monitoramento do ácido 2,4-diclorofenoxicarboxílico em amostras de produtos de abelha do centro e norte da Argentina.

Abstract

A saúde das abelhas é essencial para a produção de mel e a polinização das culturas. A produção de mel pode ser prejudicada pelo uso de herbicidas, pois as abelhas podem entrar em contato com esses produtos químicos ao coletar néctar e pólen das plantas tratadas, o que pode levar à contaminação do mel com esses resíduos tóxicos. Embora o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) seja projetado para controlar ervas daninhas de folhas largas, ele pode alcançar flores e contaminar a produção das abelhas, potencialmente afetando a saúde e a qualidade de vida delas. Por essas razões, é importante analisar o mel periodicamente, a fim de detectar a presença de resíduos de herbicidas e, se necessário, tomar medidas corretivas. Este trabalho propõe o desenvolvimento de uma nova metodologia alternativa às técnicas tradicionais para controle e monitoramento do 2,4-D em amostras de produtos de abelha do centro e norte da Argentina. As amostras foram condicionadas a pH = 7,0 na presença do surfactante aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS), filtrando os sistemas através de papel filtro de banda azul como suporte sólido antes da determinação pela fluorescência em fase sólida. Em condições ideais de trabalho, foram alcançados limites de detecção e quantificação de 0,33 ng/L e 0,90 ng/L, respectivamente, e uma faixa de linearidade de 0,90 x 10³ ng/L a 1,13 x 10³ ng/L. Entre as vantagens do novo método estão o uso de instrumentos baratos e solventes ecológicos, baixa geração de resíduos e, consequentemente, a proteção de alguns princípios da química verde.

Introduction

A saúde das abelhas é essencial para a produção de mel e a polinização das culturas. Uma colônia saudável depende de um manejo abrangente da saúde, que inclua nutrição adequada, medidas de higiene e prevenção e tratamento de doenças. A produção de mel, se realizada de forma responsável, não prejudica as abelhas, pois os apicultores extraem apenas uma pequena parte do mel total, deixando reservas para a colônia ^1,2.

A produção de mel pode ser prejudicada pelo uso de herbicidas, pois as abelhas podem entrar em contato com esses produtos químicos ao coletar néctar e pólen das plantas tratadas, o que pode levar à contaminação do mel com resíduos de pesticidas. Além disso, alguns herbicidas, como o glifosato, podem afetar diretamente o desenvolvimento e o comportamento das abelhas, reduzindo sua capacidade de forrageamento e desenvolvimento^fisiológico 3,4,5,6. Embora o herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) tenha sido desenvolvido para controlar ervas daninhas de folhas largas, ele pode atingir as flores e contaminar o mel, potencialmente impactando a saúde e a qualidade do mel^{das abelhas 7,8,9}.

O comércio doméstico e internacional de mel e outros produtos abelhas apresentou crescimento significativo e sustentado nos últimos anos, refletido no aumento^{da produção 10, 11, 12}. De acordo com dados da Organização das Nações Unidas para a Alimentação e Agricultura (FAO), existem cinco grandes países produtores de mel no mundo: China, Argentina, Turquia, Estados Unidos e^{Ucrânia, 13}. A produção apicultora é de grande importância na Argentina e está em constante crescimento devido às oportunidades de mercado de exportação que surgiram nos últimos anos. As condições ambientais da Argentina (clima, flora, etc.) e a tecnologia investida na produção permitiram ao país se posicionar em uma posição importante mundialmente. Por outro lado, a presença de xenobióticos constitui uma questão de preocupação e requer vigilância, como em outros países, pois afeta tanto a comercialização do mel quanto a saúde dos consumidores devido aos seus efeitos^{tóxicos 14,15}.

O 2,4-D é um herbicida sistêmico seletivo amplamente utilizado que controla efetivamente as ervas daninhas de folhas largas ao agir como uma auxina sintética, causando seu crescimento descontrolado e sua própria morte. É usado na agricultura, horticultura e silvicultura, sendo particularmente útil para controlar ervas daninhas em culturas como trigo, milho e arroz, pois não prejudica gramíneas ou^{cereais 16}. O 2,4-D também pode ser usado como regulador de crescimento de plantas e está disponível em diferentes formulações, incluindo sais de amina e ésteres, para atender a diversas aplicações. As funções do 2,4-D são influenciadas pela dose administrada e pela suscetibilidade de espécies e tipos de tecido^{específicos 17,18}. Por exemplo, o contato com 2,4-D tem sido implicado em desfechos reprodutivos adversos e alterações genéticas significativas em camundongos, indicando um efeito genotóxico^{notável 19}.

As abelhas melíferas, como polinizadoras-chave e organismos modelo para estudar eusocialidade, aprendizagem e memória, são altamente vulneráveis ao envenenamento direto por agroquímicos usados em^{campos 20}. A aplicação aérea de herbicidas e inseticidas durante a floração pode levar a mortalidade significativa entre as abelhas melíferas e reduzir drasticamente a produção de mel. Misturas de pesticidas, mesmo em doses subletais, podem desorientar as abelhas forrageadoras, prejudicar sua memória e diminuir a eficiência da coleta. Isso, por sua vez, enfraquece as colônias ao reduzir a coleta de pólen e néctar, resultando em deficiências nutricionais. Além disso, 2,4-D foi detectado em amostras de mel, e pólen e néctar contaminados podem ser espalhados entre os parceiros^{de colmeia 21}.

É importante analisar periodicamente o mel para detectar resíduos de herbicidas e, se necessário, tomar medidas corretivas. Para a detecção e quantificação de contaminantes alimentares, como herbicidas, neste caso específico 2,4-D, os métodos instrumentais mais comumente usados são cromatografia, a saber, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia líquida espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS) e cromatografia gasosa espectrometria de massas tandem (GC-MS/MS⁾22,23,24,25,26 . No entanto, pesquisadores apresentam periodicamente novos métodos de monitoramento para 2,4-D que oferecem vantagens em relação aos métodos convencionais de quantificação 27,28,29, por exemplo: uso de instrumentos mais baratos, simplicidade operacional, uso de menos solventes, aplicação em amostras mais complexas, entre outros.

A fluorescência em fase sólida é uma técnica versátil que, ao combinar fluorescência molecular com métodos de extração em fase sólida, potencializa a já alta sensibilidade inerente à instrumentação de fluorescência. Também melhora a faixa de linearidade e a seletividade ao reduzir ou eliminar os efeitos da matriz^30,31.

Nesta pesquisa, uma nova metodologia analítica para monitoramento e quantificação do 2,4-D é proposta e aplicada a amostras de mel e outras amostras de abelha do centro e norte da Argentina. As amostras contêm quantidades desconhecidas de 2,4-D. O que se sabe são as concentrações dos níveis superadicionados, que são a concentração fornecida pela amostra mais a concentração de 2,4-D que adicionamos. Esse último valor é conhecido e nos permite calcular a recuperação. A nova metodologia baseia-se na determinação direta do analito usando fluorescência em fase sólida, demonstrando múltiplas vantagens em termos de economia de instrumentação, redução de custos operacionais e maior proteção ambiental.

Protocol

Este manuscrito não contém estudos com participantes humanos ou animais realizados por qualquer um dos autores.

Aparelhos utilizados
Medições espectrofluorimétricas foram realizadas usando um espectrofluorômetro baseado em PC equipado com uma lâmpada de xenônio de 150 W. Um suporte de amostra era usado para medições de fluorescência de superfície sólida (SSF). Os parâmetros usados para a quantificação 2,4-D foram os seguintes: λ_em= 580 nm, usando λ_ext= 555 nm (Fendas 3-3), usando um suporte sólido para amostra.

Amostragem e tratamento da amostra
Este estudo sobre a produção de amostras de mel produzidas em 2025 foi realizado nas províncias de San Luis, San Juan, Jujuy e Salta, na região centro-norte da Argentina. As amostras analisadas foram: quatro melis multiflorais, dois céis de própolis, doces de mel puro e doces feitos a partir de uma mistura de mel, coca e própolis, adquiridos de apicultores da região. Os méis estudados eram frescos, extraídos das colmeias em menos de 1 semana após a produção, para evitar possível degradação do 2,4-D por diferentes mecanismos. Todas as amostras foram coletadas em novos vasos estéreis e imediatamente transportadas para o laboratório. Elas eram armazenadas a 4-8 °C em um local escuro até a análise. O caramelo sólido era homogeneizado com um pilão e almofariz; seu conteúdo era diluído em 5 mL de água ultrapura, e 0,5 μL era extraído dessa solução.

Metodologia
Aliquotas de 0,5 μL ou 1 μL de 2,4-D (1,23 ng/L e 3,49 ng/L), 100 μL de amostra, 250 μL de SDS (1 x ^10-4 mol/L) e 100 μL de tampão fosfato (1 x ^10-4 mol/L, pH=7) foram adicionados, e o volume da mistura foi elevado a 3 mL adicionando água duplamente destilada. A mistura era filtrada através do suporte sólido (filtro de papel; veja a Tabela de Materiais para detalhes). Suportes sólidos foram secos em temperatura ambiente, e então a fluorescência da superfície sólida (SSF) foi medida em λ_em= 580 nm, usando λ_ext= 555 nm (Fendas 3-3) com um suporte sólido para amostra.

O acima descreve o procedimento geral da metodologia desenvolvida, na qual cada parâmetro foi estudado e otimizado, conforme mostrado na seção de Resultados.

Efeito do pH e do tampão
A otimização do pH foi realizada ajustando os sistemas ao pH em estudo usando ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para levá-los ao valor desejado (pH testado na faixa 5-7). Subsequentemente, uma vez obtida a faixa de pH mais adequada para alcançar um sinal analítico adequado, o buffer a ser utilizado era selecionado.

Os tampões testados foram fosfato, Tris e bórax, que foram preparados em concentração de 1 x ^10-4 mol/L. O volume deles foi variado para obter o melhor sinal de intensidade de fluorescência. Os resultados para o único fosfato tampão que melhorou a intensidade da fluorescência são mostrados, juntamente com sua respectiva concentração ideal. Aqui, o tampão selecionado era fosfato, e o pH = 7.

Concentração de surfactantes
O uso de diferentes surfactantes na fluorescência molecular oferece vantagens que melhoram a determinação do analito em estudo. Meios micelares são usados para minimizar as interações intermoleculares entre o analito e os componentes da matriz da amostra. Além disso, as propriedades fotofísicas dos solutos fluorescentes podem ser modificadas no meio micelar, melhorando assim a sensibilidade à fluorescência. O efeito de diferentes surfactantes (SDS e HTAB) na quantificação do 2,4-D usando fluorescência de superfície sólida (SSF) foi estudado. Foi constatado que o surfactante aniônico SDS, em uma concentração de 8,3 x 10⁻⁶ mol/L, aumentou a intensidade de fluorescência do herbicida em estudo.

Suporte sólido
Considerando que a configuração planar é energeticamente preferida no estado de fluorescência excitada, explorou-se a retenção do herbicida em suportes sólidos. Os sistemas eram filtrados por vários tipos de membranas, incluindo nylon, acetato de celulose, ésteres mistos e papel filtro Blue-Ribbon. As soluções filtradas foram coletadas em recipientes separados e limpos, e as membranas secaram em temperatura ambiente. Subsequentemente, as membranas foram colocadas em um suporte sólido para amostras e a fluorescência em fase sólida (SSF) foi registrada. Foi observada retenção adequada e seletiva em papel de filtro, então esse suporte foi selecionado para a determinação da fluorescência em fase sólida. As soluções filtradas também foram analisadas por fluorescência molecular. A ausência do complexo 2,4-D era evidente, demonstrando a retenção do herbicida no papel filtrante.

Estudo de recuperação
2,4-D foi adicionado a um volume apropriado de cada amostra estudada (0,5 μL foi usado para as amostras de mel e 1 μL para as outras amostras analisadas), aumentando gradualmente sua concentração para 1,23 ng/L e 3,49 ng/L. As concentrações de analitos foram determinadas usando a metodologia, com média de seis réplicas (n = 6).

Estudo de precisão
A repetibilidade do método e a precisão intradiária foram estudadas por testes repetidos de amostras (n = 6) contendo 1,23 ng/L e 3,49 ng/L de 2,4-D, e determinando o conteúdo analítico usando a metodologia. Além disso, a reprodutibilidade da precisão entre dias foi avaliada ao longo de 7 dias para os mesmos sistemas.

Estudo de interferência
Diferentes quantidades de íons comuns foram adicionadas à solução de teste contendo 3,49 ng/L de 2,4-D, e a metodologia foi aplicada. Os seguintes potenciais interferentes foram testados:

Concentração da razão molar interferente/2,4-D = 1000:1:00 para Na⁺, K⁺, Cl^-, Fe³⁺,²⁺, Cd²⁺, Sb^3+, Mn²⁺, As³⁺, CO^{3 2-}, SO₄^2-, Ca²⁺, Mg²⁺, NO^3-, Ni²⁺, frutose, glicose, sacarose, maltose, 2,4,5-T, sulfometurona-metil, glifosato e atrazina.

Concentração da razão molar interferente/2,4-D = 500:1:00 para Zn²⁺, Co²⁺, Al³⁺, clorsulfurona, bensulfurona-metilo e triasulfona.

Cálculo dos parâmetros analíticos de qualidade
Os parâmetros de qualidade analítica são o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ). Esses cálculos foram calculados aplicando os seguintes passos. O ruído de fundo foi medido medindo a resposta de 15 amostras vazias (amostras sem o analito) para obter um conjunto de dados de ruído de fundo. O desvio padrão do ruído foi calculado. Isso é aceito como um valor LOD. Os limites de detecção são baseados em 3,3x os desvios padrão do blank (N = 15). Os limites de quantificação são baseados em 10x os desvios padrão do espaço em branco (N = 15).

Results

Os resultados apresentados abaixo indicam como o estudo de cada uma das variáveis que influenciam o procedimento geral, sua otimização e as condições ideais de trabalho alcançadas foi abordado passo a passo.

Caracterização do espectro 2,4-D
A caracterização 2,4-D foi realizada por espectroscopia UV-Vis e fluorescência molecular, observando máximos de intensidade fluorescente em λ_em= 580 nm, usando λ_ext= 555 nm (Fendas ...

Discussion

O uso intensivo de herbicidas aumentou exponencialmente na Argentina e no resto do mundo devido à necessidade de atender à demanda alimentar de uma população crescente. Se o uso desses produtos for monitorado de forma adequada, racional e periódica, isso não comprometeria os benefícios esperados nem teria efeitos negativos no meio ambiente como um todo. O 2,4-D tem sido amplamente utilizado mundialmente, e muitos estudos mostraram que esse herbicida induz alterações em organismos não alv...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-D	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	49083
Ácido acético/acetato	Fábrica Química Mallinckrodt & nbsp;
Papel filtro Blue Ribbon	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	WHA1001929	2-5 & mu; m tamanho de poros e 12,5 cm de diâmetro
Membrana de acetato de celulose	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA		0,45 & mu; m tamanho dos poros e 47 mm
Brometo hexadeciltrimetilamãe (HTAB)	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	H5882
ácido clorídrico	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	1.09063
Membranas de imobilão (+)	Millipore, São Paulo, Brasil	HATF04700	0,45 & mu; m tamanho dos poros e 47 mm
Membranas mistas de ésteres	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA		0,45 & mu; m tamanho dos poros e 47 mm
Membranas de náilon	Millipore, São Paulo, Brasil	Z290793	0,45 & mu; m tamanho de poro e 47 mm de diâmetro
pHmeter (Analisador de Íons Expansível Orion, )	Orion Research, Cambridge, MA, EUA	Modelo EA 94.
Diidrofosfato de potássio	Biopack, Buenos Aires, Argentina & nbsp;	2000168900
Ácido ftalato de potássio	Merk &Co., Inc
Dodecil sulfato de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	11667289001
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	S2770
Tetraborato de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	221732
Espectrofluorimetria	Shimadzu	RF-5301	equipado com uma lâmpada de xenônio de 150 W e células de quartzo de 1,00 cm
Tris-(hidroximetil)-aminometano	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	77-86-1