Method Article

Visualizando a dinâmica espaço-temporal dos neurônios do córtex somatossensorial durante a eletroacupuntura usando imagens in vivo com dois fótons

DOI:

10.3791/69340

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo integra janelas cranianas em camundongos transgênicos Thy1-GCaMP6f, eletroacupuntura padronizada e imagem de dois fótons para visualizar a dinâmica do conjunto cortical em escala de milissegundos durante a estimulação, revelando plasticidade específica por camada.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo estabelece uma estrutura experimental abrangente para investigar a dinâmica dos circuitos corticais durante a estimulação da EA (eletroacupuntura). A metodologia integra três componentes principais: implantação crônica de janela craniana em camundongos transgênicos Thy1-GCaMP6f, estimulação padronizada de EA no ponto de acupuntura ST36 usando pulsos bifásicos de 2/100 Hz, e imagem de cálcio de alta resolução com dois fótons. Essa abordagem integrada permite a visualização em tempo real da atividade do conjunto neural no córtex somatossensorial primário (S1) com precisão temporal milisssuficiente, capturando detalhes anteriormente inacessíveis das respostas em nível de rede à neuromodulação. A técnica revela com sucesso padrões distintos de ativação específicos de camada e mudanças longitudinais de plasticidade, fornecendo insights críticos sobre os mecanismos corticais subjacentes aos efeitos do EA. Ao superar as limitações espaciotemporais fundamentais inerentes à fMRI convencional e às técnicas eletrofisiológicas, essa plataforma de alta resolução oferece capacidades analíticas sem precedentes para mapear circuitos neurais dinâmicos. O design robusto do protocolo e os resultados reprodutíveis o tornam particularmente valioso para otimizar terapias de neuromodulação direcionadas e avançar nosso entendimento sobre plasticidade em nível de circuito em resposta à estimulação periférica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A eletroacupuntura, uma adaptação moderna da acupuntura tradicional que incorpora correntes elétricas controladas aplicadas por meio de agulhas em pontos específicos de acupuntura, é reconhecida por modular circuitos neurais envolvidos no processamento da dor, controle motor e função autonômica. Acredita-se que seus efeitos envolvam cascatas complexas de sinalização iniciadas pela ativação dos nervos sensoriais periféricos (principalmente fibras Aδ e C), levando à liberação de neurotransmissores (por exemplo, opioides, serotonina, GABA) e subsequente modulação nos níveis espinhal, tronco encefálico e cortical. As estruturas-chave implicadas incluem córtices somatossensoriais. No córtex S1, que processa informações táteis e nociceptivas, a EA provavelmente influencia tanto os equilíbrios locais inibitório-excitatório quanto a conectividade de longoalcance 3,4. No entanto, a sequência temporal precisa de ativação/inibição entre diferentes populações neuronais (por exemplo, neurônios piramidais, interneurônios) e camadas dentro de S1 durante e imediatamente após a estimulação EA, permanece em grande parte inexplorada devido às restrições metodológicas mencionadasanteriormente 5,6. Compreender essas dinâmicas em tempo real é crucial para otimizar os parâmetros da EA e prever resultados terapêuticos.

Métodos tradicionais para investigar os efeitos neuromoduladores da EA (eletroacupuntura) nos circuitos corticais, como estudos comportamentais e análises post-mortem, oferecem insights valiosos, mas não conseguem capturar a atividade neural em tempo real com alta resoluçãoespaço-temporal 7,8. Para superar essas limitações, a imagem in vivo de cálcio com dois fótons surge como uma alternativa poderosa, permitindo a visualização direta da dinâmica do conjunto neural durante aestimulação 8,9. Essa técnica oferece vantagens incomparáveis para estudos longitudinais crônicos, permitindo que pesquisadores observem — com resolução celular — a atividade rápida e distribuída nas camadas corticais em animais acordados e comportados. Ao contrário da eletrofisiologia aguda, que oferece alta resolução temporal mas cobertura espacial limitada, a imagem por dois fótons facilita o monitoramento em larga escala de centenas a milhares de neurônios simultaneamente dentro de um campo de visãodefinido 9,10. Além disso, comparada à imagem por ressonância magnética funcional (fMRI), que se destaca pela cobertura cerebral total, mas opera em escalas temporais mais lentas e carece de especificidade celular, a imagem de cálcio por dois fótons oferece detecção detalhada da atividade de populações neuronais específicas em uma escala temporal relevante para processos sinápticos e em nívelde circuito 11,12. Assim, a imagem de dois fótons está posicionada de forma única para preencher uma lacuna crítica em nossa compreensão de como estímulos de EA periféricos são traduzidos em padrões de ativação corticais espaço-temporalmente precisos, particularmente em regiões como o córtex somatossensorial primário (S1). Como o principal centro para o processamento somatossensorial (incluindo sinais de pontos de acupuntura), e dado que a EA modula robustamente sua atividade, o S1 representa um portal estratégico para estudar a dinâmica dos circuitos corticais induzida pela eletroacupuntura.

A microscopia de varredura a laser de dois fótons (2PLSM), combinada com indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como o GCaMP6, representa uma ferramenta revolucionária para a neurociência. Ele possibilita a imagem crônica e de alta resolução da atividade neural in vivo com especificidade celular e subcelular13. Os GECIs fluorescem proporcionalmente aos transientes de cálcio intracelulares, servindo como um proxy confiável para a disparaçãoneuronal 14. Crucialmente, o uso de luz de excitação no infravermelho próximo pelo 2PLSM proporciona penetração em profundidade superior (centenas de micrômetros) em comparação com a microscopia convencional, permitindo visualização da atividade em camadas corticais superficiais e até mais profundas (por exemplo, L2/3, L4, L5). Sua seção óptica inerente minimiza a fluorescência fora de foco e o dano fotográfico, tornando-o ideal para estudos longitudinais ao longo de semanas oumeses 15, 16, 17. Essa tecnologia representa um avanço revolucionário na pesquisa em EA, com potencial para transformar fundamentalmente nossa compreensão sobre ela, oferecendo o potencial de acompanhar a dinâmica em escala de milissegundos de centenas a milhares de neurônios individuais simultaneamente dentro de um volume cortical definido durante a estimulação.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos utilizaram camundongos transgênicos Thy1-GCaMP6fde 8 a 12 semanas de idade. Todos os procedimentos experimentais e protocolos de cuidado animal foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong (IACUC; Número de Aprovação do Protocolo: 3603). Todo esforço foi feito para minimizar o número de animais usados e seu sofrimento. Um esquema da configuração experimental é mostrado na Figura 1.

1. Implantação crônica de janela craniana

  1. Indução anestesiosa e estabilização estereotáxica
    1. Inicie a anestesia colocando o camundongo Thy1-GCaMP6f de 8-12 semanas em uma câmara de indução fornecida com 4-5% de isoflurano (vol/vol) em oxigênio 100% de grau médico a uma vazão de 1 L/min.
    2. Após a perda do reflexo de endireitamento (normalmente dentro de 2-3 minutos), transfira o animal para uma almofada térmica controlada termostaticamente (mantida em 37 °C) integrada em uma estrutura estereotáxica digital.
    3. Fixe o camundongo usando um cone nasal, que administre 1,5-2,0% de isoflurano para manutenção cirúrgica. Aplique pomada oftálmica (por exemplo, Pomada Puralube Vet) em ambos os olhos para evitar a dessecação da córnea.
    4. Insira cuidadosamente barras auriculares não traumáticas no meto auditivo externo, garantindo uma posição simétrica sem pressão excessiva que possa causar danos nos tecidos ou ruptura da membranatimpânica 19.
    5. Fixe o palato maxilar usando a pinça nasal, evitando obstrução das vias aéreas.
    6. Confirme anestesia profunda pela ausência de reflexo de retirada do pedal, com um beliscão firme no dedo do pé e uma frequência respiratória estável e lenta (80-120 respirações/min). Monitore continuamente a temperatura central do corpo por meio de uma sonda retal e ajuste a almofada térmica de acordo.
    7. Administre analgesia subcutânea (c.C.) preventiva (por exemplo, Carprofeno, 5 mg/kg) e suporte líquido (soro fisiológico estéril, 0,5-1 mL de s.c.). Verifique parâmetros fisiológicos estáveis (SpO₂ > 95%, respiração regular) durante toda a configuração.
  2. Exposição cirúrgica do crânio
    1. Raspe cuidadosamente o couro cabeludo dorsal usando uma máquina de cortar eletricidade, seguida da aplicação de um creme depilatório químico para a remoção completa dos pelos. Enxágue bem com soro fisiológico estéril.
    2. Realize antissepsia sequencial: Esfregue a pele exposta três vezes, alternando entre swaves de povidona-iodo (10%) e álcool isopropílico de 70%, finalizando com uma solução de gluconato de clorexidina (2%).
    3. Usando tesouras microdissecantes estéreis e pinças finas (Dumont #5), faça uma incisão sagital na linha média (~15-20 mm de comprimento) através da pele e do tecido conjuntivo subjacente, começando ~2 mm atrás dos olhos e se estendendo até a junção interparietal-occipital.
    4. Use pinças micro-hemostáticas ou cauterização bipolar (configuração baixa) para controlar o sangramento capilar ao longo das margens da incisão. Retraa suavemente as abas da pele lateralmente usando micro-retratores curvos ou suturas de seda 5-0 ancoradas ao tecido ao redor.
    5. Expõe todo o calvário dorsal, incluindo ossos frontais, parietais e interparietais. Usando uma micro-cureta (#00), raspe meticulosamente o periósteo – uma membrana vascular fibrosa aderida à superfície óssea – sob alta ampliação (microscópio cirúrgico).
    6. Aplique movimentos suaves e tangenciais para evitar arranhar o crânio ou danificar pontos (bregma, lambda, sagital, coronal). Obtenha uma superfície óssea lisa e avascular, essencial para uma craniotomia precisa e subsequente adesão.
    7. Irrige o campo frequentemente com soro salino estéril e quente (37 °C) de 0,9% para remover a poeira óssea e manter a hidratação dos tecidos.
  3. Segmentação estereotáxica da região do membro posterior S1
    1. Usando um braço manipulador estereotáxico de alta precisão, posicione a ponta de uma caneta cirúrgica fina ou microbroca diretamente sobre a bregma do ponto de referência anatômico (a interseção das suturas coronal e sagital). Confirme as coordenadas sob visualização do microscópio (10x).
    2. Ajuste o manipulador para mover o marcador com precisão anteroposterior (AP) -1,5 mm (posterior ao bregma) e mediolateral (ML) +2,0 mm (hemisfério direito) em relação à linha média (sutura sagital).
      NOTA: Esta localização corresponde à área de representação do córtex somatossensorial primário (S1) do membro posterior (S1HL).
    3. Grave levemente uma pequena mira (<0,5 mm) na superfície exposta do osso parietal nessa coordenada, garantindo visibilidade sem penetrar o osso.
    4. Verifique a ausência de vasculaturas superficiais importantes atravessando o local marcado; se houver vasos significativos presentes, ajuste minimamente as coordenadas ML (±0,1-0,2 mm) para evitá-las, pois os vasos durais podem sangrar profusamente se forem vulnerados e dificultar a clareza óptica.
    5. Documente as coordenadas finais ajustadas.
  4. Execução precisa de craniotomia
    1. Centralize um punção de biópsia estéril e descartável de 3 mm de diâmetro precisamente sobre a coordenada S1HL marcada. Aplique pressão firme e constante para baixo enquanto gira o punção suavemente para marcar a camada externa do osso cortical ao redor da circunferência. Remova o ponche.
    2. Utilizando uma broca microcirúrgica de alta velocidade (por exemplo, com rebarba de carboneto de 0,5-0,8 mm) presa a um braço estereotáxico sob irrigação salina constante a 0,9% (resfriamento e remoção de detritos), afina cuidadosamente o osso dentro do círculo marcado.
    3. Perfure em rajadas curtas usando um movimento leve e tangencial de fresagem, progredindo sistematicamente da periferia em direção ao centro. Monitore a translucidez óssea de perto sob ampliação.
    4. Pare de perfurar imediatamente ao observar uma aparência sutil de "rubor" na dura-máter subjacente, indicando espessura óssea mínima (<50 μm). Troque para micro-pinças finas (Dumont #5/45) e microtesouras para levantar e retirar meticulosamente os fragmentos finos restantes, trabalhando radialmente para fora a partir do centro.
    5. Mantenha a dura-máter intacta – certifique-se de que ela pareça translúcida e brilhante, sem rasgos ou sangramentos significativos. Controle imediatamente qualquer sangramento dural leve aplicando uma pressão suave com um pledget de espuma comprimida estéril embebido em soro fisiológico ou trombina a 0,9%.
    6. Irrige a dura-máter exposta abundantemente com líquido cefalorraquidiano artificial quente e estéril (aCSF) ou soro fisiológico 0,9% para remover todos os detritos ósseos. Evite dessecação17,20.
  5. Implante crônico de janela craniana e fixação de barras de cabeça
    1. Prepare uma cobertura circular de vidro estéril de 3 mm de diâmetro, espessura #1 (aprox. 150 μm). Opcionalmente, recubra sua superfície interna com uma fina camada de elastomero de silicone para clareza óptica e redução da aderência.
    2. Posicione a cobertura com precisão sobre a craniotomia usando pinças finas. Prepare um cimento dental de cura rápida e cura leve (por exemplo, Metabond ou Charisma) conforme as instruções do fabricante.
    3. Trabalhando rapidamente (<90 s de tempo de trabalho), aplique uma fina esfera de cimento ao redor do perímetro da cobertura, diretamente sobre a superfície seca e limpa do crânio. Certifique-se de que o cimento vede completamente a borda do revestimento, mas não absorva por baixo na dura-máter.
    4. Cure imediatamente o cimento usando uma luz de cura dental (luz azul, 450 nm) por 20-30 segundos por quadrante. Reforce a vedação com múltiplas camadas de um cimento acrílico acrílico auto-curável de 5 mL de cura mais lenta (por exemplo, Jet Repair Acrylic ou Paladur), construindo uma capa robusta de cimento de perfil baixo (<2 mm de altura) que se estende vários milímetros além da borda da craniotomia até o crânio ao redor.
    5. Embutida uma barra de cabeça leve e feita sob medida em aço inoxidável ou titânio (por exemplo, 15-20 mm de comprimento com abertura central) na tampa de cimento durante sua fase inicial de cura.
    6. Certifique-se de que a barra da cabeça esteja posicionada paralela à sutura sagital e centralizada sobre a janela, fornecendo pontos de fixação rígidos e equilibrados para futuras fixações de cabeça sob o microscópio sem obstruir o acesso óptico.
    7. Deixe o cimento curar completamente (≥15 min). Verifique hemostase completa e clareza da janela21.
  6. Recuperação e monitoramento pós-operatório
    1. Após a cura com cimento, solte cuidadosamente o rato das barras auriculares e do pinça nasal. Descontinuar o isoflurano e administrar 100% de oxigênio até que a respiração espontânea volte completamente.
    2. Administrar buprenorfina HCl (0,05-0,1 mg/kg de s.c.) imediatamente após a cirurgia para analgesia. Transfira o animal para uma câmara de recuperação pré-aquecida (30-32 °C), suplementada com oxigênio, revestida com cama de papel limpa.
    3. Monitore continuamente até que a reclinação esternal e a caminhada completa sejam recuperadas (tipicamente 30-60 minutos). Administre uma segunda dose de carprofeno (5 mg/kg de s.c.) 24 horas após a cirurgia. Forneça solução de Ringer lactada aquecida (1 mL de s.c.) para suporte à hidratação, se necessário.
    4. Alojar o camundongo sozinho em uma gaiola padrão enriquecida com material de nidificação para evitar que os companheiros de gaiola danifiquem o implante de cabeça. Mantenha condições ambientais (22-24 °C, 40-60% de umidade, ciclo claro/escuro de 12:12 h) com acesso ad libitum a alimentos e hidrogel.
    5. Monitore o camundongo pelo menos duas vezes ao dia durante 7 dias após a cirurgia para sinais de dor/sofrimento (postura curvada, piloereção, redução da atividade, perda de peso >15%), infecção (secreção purulenta, inchaço, vermelhidão), déficit neurológico ou afrouxamento da barra da cabeça.
    6. Permita um período mínimo de recuperação de ≥7 dias antes de iniciar qualquer procedimento experimental (imagem ou EA) para garantir a resolução da inflamação cirúrgica aguda, restauração do comportamento normal e da eliminação glymphática, e estabilização da atividade cortical basal. Pese o animal diariamente para acompanhar a recuperação22.

2. Estimulação por eletroacupuntura

  1. Localização anatômica precisa do ponto de acupuntura ST36
    1. Foque no ponto de acupuntura ST36 ("Zusanli") com base em marcos anatômicos estabelecidos no membro posterior do camundongo. Antes da inserção da agulha, palpe a tíbia anterior proximal para identificar a tuberosidade tibial – a proeminência óssea proeminente localizada logo distal da articulação do joelho, onde o ligamento pateliano se insere.
    2. Usando pinças finas ou um marcador estéril, meça 2 mm lateral (em direção à fíbula) e 2 mm caudal (posterior) em relação ao centro da tuberosidade tibial. Essa localização corresponde ao ventre do músculo tibial anterior, superficial ao ramo profundo do nervo peroneal e proximal à bifurcação da artéria tibial anterior.
    3. Confirme a ausência de vasos sanguíneos superficiais importantes no local por meio de transiluminação, se necessário.
      NOTA: A precisão é fundamental, pois pequenas variações (>0,5 mm) podem alterar significativamente as estruturas neurais estimuladas e as respostas corticais subsequentes em S1. A identificação de marcos deve ser realizada de forma consistente por pessoal treinado para minimizar a variabilidade entre operadores23,24.
      NOTA: Métodos para garantir a estabilidade da agulha são: (i) Após a inserção e fixação da agulha, é permitido um período de adaptação para o camundongo se aclimatar e reduzir a dificuldade inicial. (ii) A frequência de vibração gerada pelo estimulador de eletroacupuntura (por exemplo, 2 Hz) é inerentemente baixa em amplitude. Além disso, as agulhas finas usadas (por exemplo, Φ0,16 mm) possuem rigidez suficiente para resistir efetivamente a essa vibração mínima. (iii) Durante todo o experimento, o operador monitora continuamente a posição da ponta da agulha. Os dados dos ensaios serão excluídos se houver algum deslocamento significativo causado pelo movimento dos animais.
  2. Técnica de inserção com agulha estéril
    1. Após a desinfecção da pele (alternando 70% de etanol e esfoliação de clorexidina), inserir uma agulha de acupuntura estéril de aço inoxidável descartável (diâmetro nominal: 0,18 mm, equivalente a calibre 36; comprimento: 13 mm) perpendicularmente na pele na coordenada marcada ST36.
    2. Avance a agulha de forma constante pela pele, tecido subcutâneo e até o músculo tibial anterior subjacente, usando um movimento rotativo suave para minimizar o trauma tecidual.
      NOTA: A profundidade de inserção do alvo é de 3 mm a partir da superfície da pele. Essa profundidade garante o engajamento ótimo dos aferentes musculares tipo II/III (fibras Aδ) e fibras potencialmente somáticas de pequeno diâmetro, sem risco de contato com a tíbia subjacente ou feixes neurovasculares profundos.
    3. Fixe firmemente o cubo da agulha usando uma pequena almofada adesiva estéril ou clipe personalizado para evitar deslocamento durante a estimulação elétrica subsequente e possíveis movimentos sutis dos membros.
    4. Verifique a posição estável da agulha observando uma leve fasciculação muscular local transitória na inserção – um indicador fisiológico do posicionamento intramuscular correto.
    5. Mantenha uma técnica asséptica rigorosa durante todo o processo para prevenir infecções, especialmente em paradigmas de estimulaçãocrônica.
  3. Parametrização e administração da estimulação por eletroacupuntura
    1. Conecte o cabo isolado da agulha inserida ao canal de saída do ânodo (+) de um estimulador programável de eletroacupuntura (por exemplo, Estimulador Nervoso de Ponto de Acupuntura HANS, modelo LH202).
    2. Posicione um eletrodo de referência de cátodo (-), tipicamente uma pequena placa de aço inoxidável ou eletrodo de clip revestido com gel condutor, na pata traseira ipsilateral (por exemplo, superfície plantar próxima ao calcanhar).
    3. Garantir contato seguro e baixa impedância (<5 kΩ) em ambos os locais. Programe o estimulador para fornecer pulsos de onda quadrada bifásica (fases positivas/negativas equilibradas) para minimizar a polarização dos eletrodos e o dano tecidual.
    4. Defina o paradigma de estimulação para modo de dispersão densa: rajadas alternadas de 2 Hz (baixa frequência) por 3 s seguidas por 100 Hz (alta frequência) por 3 s.
      NOTA: Esse padrão combinado de frequência (frequentemente denotado como 2/100 Hz) demonstrou empiricamente aumentar a liberação de opioides endógenos (por exemplo, β-endorfina, encefalina) e monoaminas (por exemplo, serotonina, noradrenalina) no SNC de forma mais eficaz do que frequências individuais isoladas.
    5. Ajuste a intensidade atual de forma incremental a partir de 0,1 mA até que um leve e rítmico espasmo da pata (flexão dos dedos ou tornozelo) seja observado visualmente – tipicamente atingido entre 1,0 mA em camundongos adultos sob anestesia leve. Esse limiar de contração indica recrutamento suficiente de eferentes motores e aferentes de grande diâmetro associados (fibras Aβ), confirmando a ativação fisiológica sem causar sofrimento ou luta vigorosa. Mantenha essa intensidade calibrada durante os 20 minutos de estimulação25,26.
  4. Controles processuais críticos e monitoramento fisiológico
    1. Mitigação de artefatos de estimulação
      1. Separe fisicamente os cabos EA dos equipamentos de imagem/headstage.
      2. Implemente aterramento robusto: Conecte o terminal de terra do estimulador a um aterramento dedicado e certifique-se de que a estrutura do microscópio e a almofada térmica para animais compartilhem um ponto de terra comum.
      3. Sincronize temporalmente os pulsos de estimulação com o sinal de apagamento do microscópio, se disponível, ou utilize processamento pós-hoc do sinal para remover artefatos elétricos residuais dos vestígios de cálcio.
    2. Estabilidade fisiológica
      1. Monitore continuamente a temperatura corporal central (mantida em 37,0 ± 0,5 °C via almofada térmica controlada por feedback), a frequência respiratória (80-120 respirações/min) e a SpO₂ (>95%) durante a sessão de 20 minutos de EA.
      2. Manter anestesia leve com isoflurano (1,0-1,5%) para imobilidade durante a combinação de imagem/estimulação. Observe continuamente o movimento induzido da pata; se diminuir ou cessar, verifique o contato e a impedância da agulha, e ajuste levemente a intensidade (incrementos de ≤0,1 mA) para manter uma ativação motora leve e consistente.
      3. Interrompa imediatamente a estimulação se ocorrerem sinais de sofrimento (por exemplo, taquipneia, luta vigorosa).
    3. Reprodutibilidade
      1. Use o mesmo tipo de agulha, profundidade de inserção, modelo de estimulador e método de calibração (limiar de contração da pata) em todos os animais e sessões. Documente a intensidade final de estimulação usada para cada sujeito.
      2. Permita um período mínimo de recuperação pós-estimulação de 5 minutos antes de encerrar a anestesia ou realizar procedimentosadicionais 27,28.

3. Imagem de dois fótons durante EA

  1. Preparação animal, fixação da cabeça e manutenção fisiológica
    1. Após ≥7 dias de recuperação pós-cirúrgica, fixe a cabeça do rato Thy1-GCaMP6f usando a barra implantada dentro de um aparelho de fixação projetado sob medida, com vibração, montado em um palco motorizado XY.
    2. Posicione o animal confortavelmente em uma esteira cilíndrica de baixa fricção lubrificada a ar, permitindo o movimento livre dos membros posteriores. Mantenha anestesia cirúrgica leve por meio de administração de 0,5-0,8% de isoflurano em 100% de O₂. Esse nível reduzido de isoflurano minimiza a supressão da atividade neural, ao mesmo tempo em que garante imobilidade suficiente para imagens de alta resolução.
    3. Monitore e registre continuamente a temperatura corporal central (mantida em 37,0 ± 0,2 °C via almofada térmica controlada por feedback), a taxa respiratória (100-140 respirações/min) e a saturação periférica de oxigênio (SpO₂ > 95%).
    4. Aplique gel oftálmico para evitar o ressecamento da córnea durante exames prolongados. Certifique-se de que o ipsilateral do membro posterior à janela craniana S1HL esteja acessível para a inserção da agulha EA no ST36.
    5. Deixe 15-20 minutos para estabilização fisiológica após a fixação da cabeça antes de iniciar a imagem29.
  2. Direcionamento óptico e otimização para imagens das camadas II/III
    1. Determine com precisão o plano focal para adquirir sinais neuronais de alta qualidade. Siga este procedimento de verificação.
      1. Reduza a potência do laser para um nível baixo (tipicamente 10-20% da potência de imagem, por exemplo, 5-10 mW) para evitar descolorimento desnecessário e danos fotográficos durante a localização do plano.
      2. Usando o acionamento do eixo Z do microscópio de dois fótons, mova o objetivo lentamente em passos de micrômetro. Comece pela superfície da janela craniana e avance mais fundo no tecido cerebral.
      3. No modo de pré-visualização ao vivo , identifique o plano focal usando esses indicadores visuais conforme descrito nos passos 3.2.1.4 e 3.2.1.5.
      4. Para o plano focal correto em uma camada de soma neuronal: Confirme que a imagem mostra estruturas claras, brilhantes e pontuadas (somata neuronal) aparecendo redondas ou ovais com bom contraste de fundo. Certifique-se de que os limites das células estejam nítidos e exibam uma aparência distinta de "sal e pimenta".
      5. Para um plano focal incorreto: Se a imagem parecer borrada ou homogênea sem estruturas pontuadas bem definidas, reconheça que o foco está em uma região sem somata. Se sombras vasculares grandes, escuras e não estruturadas forem visíveis, identifique isso como a camada dos vasos sanguíneos.
    2. Verificação da linha de base de fluorescência apropriada
      1. Confirme uma linha de fluorescência saudável e estável antes de aplicar qualquer estímulo experimental para garantir a interpretação válida dos sinais subsequentes de cálcio (ΔF/F). Execute os passos 3.2.2.2-3.2.2.4.
      2. Ajuste a potência do laser para o nível formal de imagem (por exemplo, 30-50 mW).
      3. Adquira imagens por alguns segundos em um modo de pré-visualização rápida e de baixa resolução.
      4. Observe a intensidade média de fluorescência exibida em tempo real (ou monitore diretamente o brilho da imagem). Verifique se o sinal permanece estável e não apresenta sinais de fotobranqueamento rápido antes de prosseguir para a aquisição experimental dos dados.
    3. Centralize o campo de visão de imagem dentro da janela craniana.
      1. Aplique gel ultrassônico ou água destilada entre o objetivo e o coverslip para acoplamento por imersão. Utilizando contraste por gradiente Dodt infravermelho ou iluminação por epifluorescência, identifique a vasculatura superficial e alinhe o campo de visão (FOV) para evitar grandes vasos superficiais (>20 μm de diâmetro).
      2. Mude para o modo de excitação de dois fótons usando um laser Ti:Sapphire pulsado por femtosegundo sintonizável. Ajuste o comprimento de onda da excitação para 920 nm - ideal para excitar GCaMP6f (pico ~920 nm), minimizando a autofluorescência verde e o dano fotográfico em comparação com comprimentos de onda mais curtos.
      3. Aumente gradualmente a potência do laser (tipicamente 20-50 mW medida na amostra) enquanto foca através da dura-madre transparente até a superfície cortical (pia mater). Ajuste a posição Z do objetivo usando um dispositivo piezoelétrico de nano-foco para alcançar uma profundidade de 200 ± 10 μm abaixo da superfície pial, correspondente à Camada cortical II/III.
      4. Confirme a profundidade por meio da densidade e morfologia neuronal características: uma população densa de neurônios somata piramidais pequenos a médios (10-15 μm de diâmetro) com dendritos apicais visíveis.
      5. Otimize as configurações de potência do laser e ganho do tubo fotomultiplicador (PMT) para alcançar uma fluorescência de base forte do GCaMP6f (F0) sem saturação (intensidade dos pixels ~50-70% do máximo do detector) e fundomínimo 30,31.
        NOTA: Durante a imagem, a potência média da luz de excitação de 920 nm foi mantida precisamente entre 30-50 mW no objetivo. Esse nível de potência foi validado por meio de experimentos-piloto em tecido animal submetido a procedimentos cirúrgicos idênticos, garantindo a aquisição eficaz de sinais para durações de varredura de até 25 minutos, minimizando o fotodano e o descolorimento por fluorescência.
  3. Protocolo de aquisição de cálcio por imagem de alta velocidade
    1. Configure o scanner ressonante para aquisição de quadros em alta velocidade:
      Tamanho do quadro: 512 × 512 pixels (campo de visão típico: ~450 × 450 μm, tamanho do pixel ~0,88 μm)
      Taxa de quadros: 7 quadros por segundo (fps) alcançada por varredura bidirecional (~14 kHz de taxa de linha). Essa taxa amostra adequadamente a cinética de decaimento GCaMP6f (τ~500 ms) enquanto equilibra a relação sinal-ruído (SNR) e minimiza o fotobranqueamento.
      Tempo de permanência dos pixels: ~0,8 μs (otimizado para SNR a 7 Hz).
    2. Inicie aquisição contínua em time-lapse usando software de aquisição (por exemplo, ScanImage, Prairie View). Registre um período inicial de 5 minutos antes do início da estimulação da EA para estabelecer a dinâmica da atividade neural pré-estímulo (F₀).
    3. Em exatamente t = 5 min, inicie a estimulação EA em ST36 enquanto a imagem continua ininterrupta. Adquira dados continuamente durante o período de estimulação EA, que é de 20 minutos. Duração total da varredura = 25 min (1500 s, ~10.500 quadros).
    4. Os dados são salvos como uma pilha multi-TIFF ou formato binário proprietário com carimbos de tempo embutidos sincronizados com pulsos de disparo EA via um canal de entrada TTL.
    5. Monitorar a estabilidade da potência do laser e o desvio de foco (<2 μm) em tempo real; pausa brevemente para refocar somente se ocorrer deriva significativa (por exemplo, >5 μm), observando o ponto de tempo32,33.
  4. Correção rigorosa de movimento e registro espacial
    1. Após a aquisição, processe a pilha de imagens brutas usando NoRMCorre (Correção de Movimento Não Rígida) no MATLAB para eliminar artefatos espaciais de micromovimentos residuais (por exemplo, respiração, pulso).
    2. Primeiro, divida a pilha em patches espaciais sobrepostos (por exemplo, 64 × 64 pixels, 50% de sobreposição). Para cada patch, calcule um modelo de referência fazendo a média dos quadros de SNR alto a partir do período base.
    3. Usando correlação cruzada baseada em Fourier, calcule os deslocamentos translacionais X-Y para cada quadro relativo ao modelo. Aplique esses deslocamentos via interpolação por subpixel.
    4. Em seguida, aborde deformações não rígidas: modele distorções locais dentro de patches usando transformações afins por partes (translação + cisalhamento). Atualize iterativamente o modelo para melhorar a precisão do registro. Parâmetros-chave:
      max_shift: 20 pixels (limite para tradução)
      max_dev: 3 pixels (desvio máximo não rígido)
      bin_width: 50 quadros (binning temporal para atualizações de templates)
    5. Visualize a eficácia da correção inspecionando o gráfico de correlação quadro a quadro (deve estabilizar perto de 1,0 após a correção) e gerando um mapa de diferença de projeção média de imagem (pré vs. pós-correção). Guarde a pilha corrigida por movimento para análise posterior. Essa etapa é fundamental para uma análise precisa de transientes de cálcio pixelada a pixel, especialmente durante movimentos sutis dos membros induzidos pelo EA.

4. Análise de dinâmica espaço-temporal

A pilha de imagens corrigidas por movimento passa por segmentação neuronal automatizada e extração de sinais usando o pipeline Suite2p (v0.12.3) em Python. Estágios principais de processamento incluem:

  1. Identificação de pegada espacial
    1. Aplique fatoração matricial não negativa restrita (CNMF) para decompor a pilha em componentes espaciais.
    2. Inicialize regiões de interesse (ROIs) usando uma abordagem baseada em correlação: mesclar pixels com correlação cruzada espacial > 0,7 e SNR local > 4 em ROIs candidatos. Distinga-se ROIs somáticos de dendritos/axônios pelo tamanho (8-15 μm de diâmetro) e circularidade (limiar de compacidade >0,6).
  2. Correção da contaminação por neuropil
    1. Para cada ROI, defina um anel neuropil concêntrico (raio interno: 1,5× raio ROI, raio externo: 2,5× raio ROI).
    2. Calcule o coeficiente neuropil (r_neuropil) via regressão de mínimos quadrados:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0,7 × F_neuropil(t)
      (Coeficiente validado empiricamente para camundongos Thy1-GCaMP6f).
  3. Deconvolução de sinal
    1. Inferir a atividade de picos usando OASIS (deconvolução regularizada l₁) com o modelo de ruído AR(2) para estimar a probabilidade de pico S(t) a partir de trilhas ΔF/F:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      onde 'k' é o grão transiente de cálcio e ε é o ruído gaussiano.
  4. Controle de qualidade
    1. Exclua ROIs com SNR <3, sobreposição espacial >30% ou correlação neuropil >0,3. A verificação visual é realizada via interfacegráfica Suite2p 34.
      Operações específicas e elementos de interface são fornecidos no Arquivo Suplementar 1. O arquivo TIFF corrigido por movimento gerado acima foi alimentado diretamente para o pipeline Suite2p. Embora o ambiente integrado do Suite2p inclua sua própria correção de movimento rígida, essa etapa interna redundante foi desativada, pois uma correção não rígida mais precisa já havia sido aplicada. ROIs neuronais extraídos automaticamente podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 2.

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Results

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Caracterização estrutural do córtex S1 e da atividade neural de base
Começamos estabelecendo uma linha base estrutural e funcional de alta fidelidade para nossos experimentos de imagem. A análise da morfologia tecidular revelou diferenças estruturais perceptíveis entre preparações cranianas de janela não caplicada (Figura 2A) e aplicadas por coverslip (Figura 2B). Embora a aplicação de um coverslip tenha intr...

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Discussion

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Para preencher a lacuna crítica na observação dos efeitos corticais da eletroacupuntura (EA) em tempo real, apresentamos um protocolo integrado abrangente que combina implantação crônica de janela craniana para acesso óptico, estimulação padronizada da EA e imagem longitudinal de cálcio com dois fótons direcionada ao córtex somatossensorial primário (S1).

Esse protocolo integrado oferece várias vantagens distintas em relação aos métodos tradicionais para estud...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nº 82405550). Agradecemos aos membros do laboratório Zhang pelas discussões úteis.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CarprofenoMCEN/A5 mg/kg para analgesia
Quadro estereotáxico digitalRWDKopf Modelo 1900
Estimulador de eletroacupunturaHANS LH202 (pulsos bifásicos de 2/100 Hz)N/AHANS LH202 (pulsos bifásicos de 2/100 Hz)
IsofluranoRWDR510-22-10Grau médico, 100% transportador de oxigênio
Sistema micro-perfuraçãoRWDRebaba de carboneto de 0,5 mm, resfriada por soro fisiológico
Povidona-iodoMCEHY-B2234Solução de 10%
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
Solução salina estérilBeyuntianST341-500ml0,9% NaCl
Microscópio cirúrgicoZeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40 e mais vezes; ampliação
Camundongos transgênicos Thy1-GCaMP6fCygen55239788-12 semanas, macho/fêmea
Microscópio de dois fótonsNikon A1MPNikon A1MPLaser Ti:Safira (excitação de 920 nm)

References

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