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Interferometria de Biocamada para Investigar a Ligação Proteína-Inibidor de Membrana: TACAN Mutant e GsMTx4 como Sistema Modelo

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DOI:

10.3791/69348

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8 de maio de 2026

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1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para otimizar e conduzir experimentos de Interferometria de Biocamada (BLI) para estudar as interações entre proteínas de membrana e ligando para proteínas de membrana solubilizadas em detergente. Utilizando a interação entre o mutante TMEM120A M207A e o inibidor de peptídeos GsMTx4 como modelo, esse fluxo de trabalho descreve a preparação de proteínas, o carregamento de biossensores e a aquisição de dados cinéticos.

Resumo

A Interferometria de Biocamada (BLI) é uma técnica biofísica eficiente que permite a análise quantitativa em tempo real das interações biomoleculares. Embora comumente usados para proteínas solúveis, sua aplicação em proteínas de membrana continua sendo desafiadora devido à hidrofobicidade e dependência de detergentes. Este estudo apresenta um protocolo BLI otimizado para caracterizar interações entre proteína de membrana solubilizada em detergente e inibidor de peptídeos.

Como sistema modelo, o peptídeo modificador de gating Grammostola mecanotoxina 4 (GsMTx4) foi testado contra a proteína multifuncional mutante de membrana TMEM120A M207A. A variante TMEM120A marcada com FLAG foi imobilizada em biossensores anti-FLAG — representando um sistema baseado em etiquetas, mas sem marcadores fluorescentes e enzimáticos — e exposta a diluições seriadas de GsMTx4 para medir taxas de associação e dissociação.

O protocolo integra otimização de detergentes usando Neopentil Glicol de Lauryl Maltose (LMNG) e caracterização complementar por fotometria de massa e fluorimetria diferencial de varredura (DSF). Esse fluxo de trabalho permite medições cinéticas confiáveis e é compatível com triagem de média cadeira. A abordagem pode ser aplicável a outros sistemas membrana proteína-ligante onde a estabilidade do detergente é mantida. No geral, o estudo destaca parâmetros-chave que influenciam a eficiência da imobilização e a entrega de analitos, apoiando a utilidade potencial do BLI no perfilamento de inibidores e em estudos mecanicistas das interações proteicas de membrana.

Introdução

As proteínas de membrana desempenham papéis centrais em processos fisiológicos essenciais, incluindo transdução de sinais, transporte de íons e metabólitos, e organização da membrana. Dado seu envolvimento na comunicação celular e homeostase, eles representam uma proporção substancial dos alvos de fármacos no desenvolvimento clínico. Compreender as interações membrana proteína-ligando é fundamental para elucidar a função e orientar o desenho terapêutico. No entanto, a natureza anfipática dessas proteínas e sua dependência de ambientes lipídicos apresentam desafios significativos para purificação, estabilização e caracterização biofísica.

Ressonância de plámpon de superfície (SPR) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC) são técnicas amplamente utilizadas para estudar a cinética e a termodinâmica das interações proteína-ligante demembrana 1,2. Quando otimizados adequadamente, ambos os métodos podem fornecer insights quantitativos detalhados, mesmo para proteínas de membrana solubilizadas ou reconstituídas em detergente. A termoforese em microescala (MST) também foi aplicada com sucesso para avaliar afinidades de ligação sob condições próximas às nativas, especialmente para proteínas de membrana³. No entanto, essas abordagens podem ser limitadas por um consumo substancial de amostras, dificuldades em manter a estabilidade das proteínas de membrana ou compatibilidade restrita com certos sistemas de detergente.

A Interferometria de Biocamada (BLI) é uma técnica óptica em tempo real que permite a medição quantitativa de interações biomoleculares, incluindo aquelas envolvendo proteínas de membrana solubilizadas em detergente ou anfípol. Juntamente com as técnicas biofísicas mencionadas anteriormente, o BLI oferece uma plataforma eficiente que permite a medição direta da cinética de ligação, incluindo as constantes de associação (kon), dissociação (koff) e de dissociação de equilíbrio (KD), com concentrações amostrais mais baixas e adaptação direta a proteínas de membrana solubilizadas em detergente ou nanodisco. Também é importante notar que, como todas as tecnologias biofísicas, o BLI possui suas próprias limitações, que serão mencionadas na seção de Discussão.

O BLI detecta mudanças no padrão de interferência da luz branca refletida pela ponta de um biossensor, com mudanças na espessura óptica correspondentes a eventos de ligação biomolecular. Esses deslocamentos (Δλ, em nm) são registrados como sensorgramas e são proporcionais à massa ligada na superfície do sensor. O BLI tem sido amplamente aplicado a interações proteína-proteína e proteína-ligante (incluindo peptídeos e pequenas moléculas) e é adequado para variações de afinidade que vão de nanomolar amicromolar 4. Sua flexibilidade, baixo consumo de amostras e configuração relativamente simples tornam-na uma ferramenta potencialmente vantajosa para estudar proteínas de membrana solubilizadas em detergente 5,6,7.

Este estudo apresenta um protocolo BLI para caracterizar a interação entre TMEM120A M207A, uma proteína de membrana, e a mecanotoxina Grammostola 4 (GsMTx4), um inibidor de peptídeos. TMEM120A foi proposto como um canal iônico mecanossensível envolvido na detecção mecânica dador 8; no entanto, sua atividade no canal iônico continua sendo controversa. Diversos estudos relataram a ausência de correntes mecanossensíveis quando TMEM120A é expressa em sistemas heterólogos como HEK293 ou célulasCHO 1,9,10,11. Até o momento, mais de quatro estudos crio-EM resolveram a estrutura da TMEM120A no estado fechado, e nenhuma conformação aberta foiobservada 1,9,10,11.

Simulações de dinâmica molecular e análises eletrofisiológicas indicam que a metionina 207 (M207) em TMEM120A humanos selvagens pode atuar como uma barreira de acesso dentro da via de conduçãoiônica 11. A mutação desse resíduo em alanina (M207A) demonstrou aumentar a permeabilidade aos íons, provavelmente alterando o empacotamento da hélice e deslocando cadeias laterais hidrofóbicas como Phe223. Consequentemente, o mutante M207A foi selecionado para estudos de ligação com GsMTx4.

GsMTx4 é um peptídeo modificador de gating derivado do veneno de aranha que inibe canais cátions mecanossensíveis. Consiste em uma sequência de 32 aminoácidos e possui um peso molecular de 4 a 5 kDa, incluindo canais piezo e TRP, principalmente interagindo com a bicamada lipídica em vez de bloquear diretamente oporo 12,13. Estudos anteriores demonstraram que o GsMTx4 reduz TMEM120A atividade em sistemas de bicamadaartificial 8. Nos ensaios do BLI, o mutante M207A TMEM120A foi imobilizado em biossensores anti-FLAG e exposto a concentrações crescentes de GsMTx4, permitindo medir taxas de associação (kligado) e dissociação (kdesligado).

Este trabalho fornece um protocolo detalhado para otimização de detergentes e análise cinética usando Interferometria de Biocamada (BLI). Embora o BLI tenha algumas limitações, como possíveis artefatos de sobrecarga de sensores ou efeitos de transporte de massa e redução da adequação para interações rápidas com taxa de associação (kon), ele é um método útil para estudar as interações membrana entre proteína e ligando sob condições controladas de solubilização em detergente. O protocolo é adequado para sistemas com afinidades de ligação moderadas a baixas (tipicamente na faixa de nanomolar a micromolar) e pode ser adaptado a outros alvos hidrofóbicos quando são aplicados controles e condições de tampão apropriadas.

Protocolo

1. Purificação de proteínas e otimização de amostras

  1. Cultura celular e transfecção
    1. Cultive células de suspensão HEK293T/SF17 em meio sem soro, suplementado com 20 mM de L-glutamina em um incubador agitado ajustado a 120 RPM, 37 °C, 80% de umidade e 8% de CO₂. Manter as células passando até a passagem cinco; permitem que as células atinjam uma densidade de aproximadamente 5 × 10⁶ células/mL.
    2. Transfecte as células com o plasmídeo TMEM120A M207A (N-terminal FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) no vetor pCDNA3.1 usando um reagente comercial de transfecção conforme as instruções do fabricante (veja a Tabela de Materiais).
    3. As células transfectadas em pellet por centrifugação a 5.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Armazene a célula a -80 °C até a purificação.
  2. Lise e solubilização celular (Figura 1)
    1. Ressuspenda um pellet de células de 30 mL em um tampão de solubilização contendo 100 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfônico (HEPES), pH 7,8; 300 mM NaCl; 0,5% (v/v) ou 4,98 mM neopentil glicol de maltose de lauril (LMNG); 1x coquetel inibidor de protease; 50 μg de DNase I; 10% (v/v) de glicerol.
    2. Lisar as células por ultrasonicação a 25% de amplitude usando um ciclo de pulso de 20 s ligado/20 segundos desligado por 15 minutos, mantendo a amostra no gelo para evitar superaquecimento.
    3. Clarifique o lisado por centrifugação a 25.800 × g por 45 minutos a 4 °C.
  3. Purificação de afinidade usando resina anti-FLAG
    1. Equilibrar resina anti-FLAG M2 com tampão de equilíbrio contendo 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,05% (v/v) ou 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) de glicerol.
    2. Incube o sobrenadante clarificado com resina equilibrada por 2 horas a 4 °C em um balanço.
    3. Lave a resina 2x com tampão de lavagem contendo 25 mM HEPES, pH 7,8; 150 mM NaCl; 0,05% (v/v) ou 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) de glicerol.
    4. Eluva a proteína ligada usando um tampão de elução contendo 25 mM de HEPES, pH 7,8; 400 mM NaCl; 0,001% (v/v) ou 0,00995 mM LMNG; 10% (v/v) de glicerol; 200 μg/mL peptídeo FLAG.
  4. Cromatografia de concentração e exclusão de tamanho (SEC)
    1. Concentre a proteína eluída em ~500 μL usando uma unidade de filtro centrífuga com corte de 30 kDa.
    2. Realize SEC usando a coluna de exclusão de tamanho referenciada equilibrada com 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (v/v) ou 0,00149 mM LMNG.
    3. Colete e agrupe frações de pico correspondentes à proteína alvo.
    4. Concentre frações agrupadas até ~3 mg/mL na concentração final. Após a purificação de afinidade, confirme que o monômero da proteína TMEM120A M207A aparece em aproximadamente 43 kDa no SDS-PAGE (Figura 2A). Para a SEC, confirme que a proteína purificada no LMNG elude como um pico monodisperso correspondente a aproximadamente 150 kDa, que representa o dímero TMEM120A M207A junto com a micela detergente LMNG (Figura 2B).
      NOTA: Ocasionalmente, a faixa proteica monômero pode aparecer em torno de 50 kDa, o que é comum para proteínas de membrana solubilizadas em detergente, já que amostras de proteínas de membrana fervendo não são típicas.

2. Análise de estabilidade térmica por fluorimetria de varredura nanodiferencial (NanoDSF)

  1. Dilua a proteína purificada TMEM120A M207A para 0,15 mg/mL em tampão SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
  2. Carregue 10 μL de cada amostra em capilares de alta sensibilidade.
  3. Execute o ensaio de deslocamento térmico em um instrumento NanoDSF com uma rampa de temperatura de 25 °C a 90 °C.
  4. Use um software compatível para configurar o ensaio e realizar a análise automatizada.
  5. Confirme que uma única curva de transição térmica (Tm) é visível, indicando um evento de desdobramento cooperativo (Figura 3).

3. Fotometria de massa para determinação do estado oligomérico

  1. Prepare uma amostra diluída a 80 nM em tampão SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
  2. Coloque a amostra em slides de massa pré-limpos compatíveis com fotometria.
  3. Adquira dados usando configurações padrão e calibre usando padrões de proteína.
  4. Processar dados com software de análise para gerar histogramas de distribuição de massa (Figura 4A-C).

4. Protocolo de interferometria de biocamada (BLI)

NOTA: Este protocolo descreve um ensaio cinético BLI projetado para estudar interações entre TMEM120A M207A marcados com FLAG e ligantes como GsMTx4, usando um formato de microplaca de 384 poços. Embora desenvolvido para TMEM120A, o fluxo de trabalho pode ser adaptado para outras proteínas de membrana. Todos os experimentos foram realizados usando uma plataforma de interferometria óptica com sondas biossensoras FLAG para imobilizar TMEM120A M207A marcados com FLAG. Uma microplaca preta de 384 poços foi usada com um tampão otimizado de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) contendo 25 mM de HEPES, 200 mM de NaCl, 0,00015% (p/v) LMNG e 0,0005% Tween-20, pH 7,8. O Tween-20 foi incluído para minimizar a ligação inespecífica. A concentração de proteína foi mantida em 250 nM, e todos os ensaios foram realizados em duplicado para garantir a reprodutibilidade.

  1. Considerações sobre o projeto do ensaio
    1. Equilíbrio de temperatura
      1. Antes de iniciar o ensaio BLI, equilibre todos os componentes do ensaio — incluindo tampões, amostras e sondas biossensoras — à temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C). Durante a aquisição de dados, mantenha a temperatura do ensaio em 30 °C, o que é recomendado para análises cinéticas a fim de otimizar a estabilidade da proteína, ligação de ligantes e reprodutibilidade.
        NOTA: Esta etapa de equilíbrio garante perfis cinéticos consistentes e minimiza artefatos causados por flutuações de temperatura durante o experimento. Deixe tempo suficiente (pelo menos 10-15 minutos) para que todos os reagentes e biossensores atinjam o equilíbrio térmico antes de iniciar o ensaio.
    2. Hidratação e regeneração de sensores
      1. Hidrate os novos biossensores FLAG em 250 μL de buffer compatível com BLI (buffer SEC contendo 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% w/v LMNG e 0,0005% Tween-20, pH 7,8) na placa máxima por no mínimo 10 minutos antes do uso.
        NOTA: Manuseie os biossensores com cuidado com pinças limpas e sem poeira para evitar contaminação, que pode interferir na aquisição de sinal e levar a resultados inconsistentes. Para reutilização do sensor, realize regeneração usando o buffer Q (0,3 M glicina, pH 3,8). A hidratação e regeneração adequadas são essenciais para manter o desempenho e a reprodutibilidade dos sensores, especialmente ao trabalhar com proteínas de membrana solubilizadas em detergente, que são sensíveis às condições ambientais.
    3. Manuseio do buffer
      1. Evite bolhas de ar ao dispensar líquidos, pois elas podem interferir na aquisição do sinal óptico.
    4. Composição e consistência do buffer
      1. Use um tampão que minimize interações inespecíficas enquanto preserva a função proteica. Para TMEM120A M207A, prepare o tampão contendo 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (p/v) LMNG, 0,0005% (p/v) Tween 20, pH 7,8.
    5. Imobilização de proteínas
      1. Otimize a carga de ligandos para alcançar 50-80% de saturação do sensor. Use uma concentração fixa de proteína em 250 nM, com duração típica de carregamento de aproximadamente 120 s. Carregue TMEM120A M207A (250 nM) marcada com FLAG no biossensor por 120 s para alcançar uma saturação de 50-80%.
      2. Confirme que o sinal do biossensor atinge 50 a 80% da capacidade máxima de ligação durante a fase de carga.
        NOTA: Sinais abaixo de 50% podem indicar imobilização insuficiente de proteínas, enquanto sinais acima de 80% podem introduzir limitações no transporte de massa ou impedimento estérico, potencialmente comprometendo medições cinéticas.
      3. Para avaliar os potenciais efeitos do transporte de massa, realize-se um experimento de controle no qual a concentração do analito (por exemplo, 100 nM GsMTx4) é mantida constante enquanto se variam os níveis de carga do TMEM120A-M207A nos biossensores FLAG (Figura Suplementar S1).
        NOTA: As medições cinéticas subsequentes — incluindo associação, dissociação, ajustes globais de ligação e determinação de kligado e k desligado — não foram significativamente diferentes daquelas obtidas no ensaio principal. Esse resultado indica que TMEM120A carga dentro da faixa de 50-80% não introduz artefatos significativos de transporte em massa, confirmando que o nível de carga do biossensor é adequado para uma análise cinética confiável.
    6. Estimativa KD
      1. Determine a afinidade de ligação (KD) testando as concentrações do analito (GsMTx4) de 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM e 100 μM.
    7. Controles de sinal de fundo
      1. Inclua controles apropriados para subtrair com precisão os sinais de fundo e garantir medições cinéticas confiáveis.
      2. Use uma sonda FLAG de referência para considerar ligações ou derivações inespecíficas que possam ocorrer durante o ensaio.
        NOTA: Esta sonda de referência não deve ter a proteína alvo imobilizada e serve como linha de base para corrigir o sinal obtido das sondas contendo a amostra.
      3. Subtraia o sinal de referência do sinal amostral para analisar apenas interações específicas entre TMEM120A M207A marcados com FLAG e analitos.
        NOTA: Verifique se a sonda FLAG de referência mostra sinal mínimo durante todo o ensaio. Uma linha de base estável e baixa indica ligação inespecífica e insignificante. Se o sinal de referência flutuar ou aumentar, reavalie a composição do tampão, o manuseio da sonda ou a preparação da amostra para reduzir interações inespecíficas antes de prosseguir com a análise cinética.
  2. Configuração dos parâmetros básicos do ensaio para análise cinética
    1. Ajuste a frequência de aquisição de dados para 5 Hz para coletar 5 pontos de dados/s (recomendado para todos os ensaios cinéticos).
    2. Selecione a placa de 384 poços como formato de placa.
    3. Ajuste a velocidade do shaker para 1.000 RPM e a temperatura entre ambiente e 30 °C (30 °C usado neste experimento para resultados cinéticos ótimos).
  3. Configure a configuração da placa.
    1. Navegue até a aba de Configuração de Placas e defina as atribuições de poços tanto para a placa de 384 poços quanto para a placa Max.
    2. Atribua funções de poço na placa de 384 poços.
      NOTA: Os símbolos e anotações usados tanto para a placa de 384 poços quanto para a Max Plate estão resumidos na Tabela Suplementar S1.
      1. Rotule os poços de acordo com o papel: tampão, proteína (carga), ligante (amostra).
      2. Anote poços de carga proteica com concentração (por exemplo, 250 nM) para ensaios cinéticos.
        NOTA: Rotulagem precisa é essencial para calculark on e kD (veja a Figura Suplementar S2A).
    3. Configure o mapa de placas Max (placa de sonda).
      1. Atribuir sondas biossensoras aos poços apropriados.
      2. Se a regeneração da sonda estiver planejada, atribua poços para buffers de regeneração e neutralização. Rotule claramente esses poços no software para garantir a automação adequada durante a regeneração (veja a Tabela Suplementar S2).
        NOTA: O tampão do ensaio consistia em 25 mM HEPES (pH 7,8), 200 mM de NaCl, 0,00015% (v/v) LMNG e 0,0005% (v/v) Tween-20. A etapa de regeneração das sondas biossensoras anti-FLAG foi realizada usando tampão Q contendo 0,3% de glicina (pH 3,8), seguida por uma etapa de neutralização com o tampão do ensaio (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG e 0,0005% Tween-20, pH 7,8).
  4. Selecione a aba Passos do Ensaio .
    1. Navegue até a aba Passos do Ensaio para configurar o fluxo de trabalho do ensaio cinético. Especifique as posições dos poços para cada fase do ensaio, incluindo linha basal, carga proteica, associação e dissociação (veja a Figura Suplementar S3).
    2. Selecione o tipo de passo apropriado no menu suspenso. Certifique-se de que as etapas de associação e dissociação estejam corretamente rotuladas para uma análise cinética precisa.
    3. Insira a duração de cada passo em segundos para definir os tempos de exposição de todas as fases de interação.
      1. Defina a duração do passo de base para permitir o equilíbrio do sensor antes da carga de proteínas (60 s).
      2. Defina a duração da etapa de carregamento proteico para alcançar níveis desejados de imobilização de ligantes de (60 s) (Figura 5).
      3. Defina a duração do passo de associação para permitir ligação suficiente ao analito (300 s) (Figura 5).
      4. Defina a duração da etapa de dissociação para capturar adequadamente a cinética de desligamento do analito (600 s) (Figura 5).
    4. Defina a velocidade do shaker (RPM) para cada etapa para manter a mistura consistente e a qualidade ideal dos dados (1.000 RPM).
  5. Alinhar e filtrar etapas (veja Figura Suplementar S4 e Figura Suplementar S5)
    1. Realize a correção bruta ajustando a faixa de dados conforme necessário para remover artefatos dos passos cinéticos.
    2. Para alinhar o eixo Y, alinhe os dados no início da etapa de associação selecionando Associação em Alinhar Tipo de Passo e ativando a opção Começar .
    3. Ative a opção de correção Interstep para manter a continuidade entre etapas durante ensaios cinéticos padrão.
    4. Filtragem: Aplique suavização de dados para reduzir o ruído do sinal sem distorcer as tendências. Selecione Processado para comparar dados suavizados com sinais brutos.
  6. Defina um passo de referência (veja Figura Suplementar S6).
    1. Designe uma sonda de referência selecionando a sonda de referência e clique no botão Ref. Probe .
    2. Selecione as sondas de amostra clicando nos números das colunas correspondentes para as sondas de amostra.
    3. Para definir a função de subtração, abra o Editor de Fórmulas, clique em Editar Fórmula e defina a função de subtração para remover o fundo.
    4. Revise a vista em tabela para confirmar que a subtração de referência foi aplicada corretamente.
  7. Etapa de ajuste de encadernação
    1. Navegue até a aba Ajuste e defina parâmetros de análise (Figura Suplementar S7).
    2. Seleção de dados: Inclua tanto as fases de associação quanto de dissociação para ajuste cinético local. Exclua manualmente os valores atípicos se apresentarem ajuste de curva ruim ou sinal errático.
    3. Seleção do modelo de binding: Escolha o modelo de vinculação 1:1 para ajustar os dados, a menos que seja observado um comportamento complexo. Revise sobreposições e resíduos de curvas para validar a adequação do modelo.
    4. Estratégia de ajuste: Selecione uma das seguintes estratégias de ajuste dependendo da qualidade dos dados e dos objetivos experimentais:
      1. Local: Adequa-se a cada concentração de analito individualmente, permitindo uma avaliação independente da cinética de associação e dissociação.
      2. Global: Ajusta simultaneamente todas as concentrações de analitos usando um único conjunto de parâmetros cinéticos, fornecendo um modelo geral para o conjunto de dados.
      3. Completo: Atende tanto às fases de associação quanto à de dissociação globalmente em todas as concentrações.
      4. Parcial: Serve apenas para a fase de associação, ignorando a dissociação.
        NOTA: Os dados do BLI foram analisados usando um modelo de ligação de Langmuir 1:1 com ajuste local e completo. O ajuste local garante que cada concentração de analito seja tratada de forma independente, fornecendo uma representação precisa da cinética de associação enquanto minimiza artefatos da heterogeneidade na fase de dissociação. Essa abordagem evita o sobreajuste em regiões com sinais variáveis ou instáveis, permitindo uma estimativa mais confiável dos parâmetros cinéticos (kligado e kdesligado) (Tabela 1 e Tabela 2).
  8. Análise cinética
    1. Revisão das curvas ajustadas e resíduos: Examine as curvas ajustadas e os resíduos correspondentes para avaliar a qualidade e validade do modelo. Confirme que os resíduos estão distribuídos aleatoriamente ao redor de zero sem desvios sistemáticos (veja a Figura 4E para resíduos representativos).
    2. Exclusão de dados mal ajustados: Remover concentrações de analitos que exibem sinais planos, ruidosos ou de outra forma pouco confiáveis para melhorar a precisão geral do modelo.
      NOTA: Por exemplo, a concentração de 10 μM foi excluída do ajuste devido à sobreposição com o conjunto de dados de 5 μM, o que poderia distorcer a estimativa dos parâmetros cinéticos (ver Figura 6A,B).

Resultados

O mutante M207A TMEM120 foi expresso em células de suspensão HEK293SF-17 usando um vetor pCDNA3.1 codificando uma tag FLAG N-terminal Figura 1. A transfecção transitória possibilitou a expressão de proteínas recombinantes. Após a colheita celular, proteínas de membrana foram solubilizadas em neopentil glicol de maltosa de lauril (LMNG), um detergente não iônico adequado para manter a solubilidade proteica de membrana.

A fração solubilizada foi submetida à purificação por afinidade usando resina anti-FLAG M2. A resina foi lavada com tampão contendo 0,01% de LMNG para remover proteínas não especificamente ligadas, e TMEM120 M207A foi eluído em tampão contendo 0,001% LMNG. A elução foi concentrada usando filtros centrífugos com cortes de peso molecular de 30 kDa ou 100 kDa, dependendo do rendimento da amostra. A purificação adicional foi realizada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). A etapa final da SEC foi realizada em um tampão contendo 0,00015% de LMNG, produzindo um perfil de elução monodispersa consistente com uma preparação proteica homogênea e estável, adequada para análises estruturais e funcionais subsequentes (Figura 2B).

A otimização e caracterização biofísica de TMEM120 M207A marcadas com FLAG são resumidas na Figura 2. A expressão e purificação foram confirmadas pelo SDS-PAGE, que mostrou uma única faixa em aproximadamente 50 kDa. A migração observada foi ligeiramente superior ao peso molecular esperado da forma monomérica (Figura 2A), provavelmente devido à amostra não fervida antes da eletroforese. O cromatografia SEC apresentou um único pico simétrico de elusão em um volume correspondente a uma massa molecular aparente de aproximadamente 150 kDa em 0,000015% (p/v) LMNG (Figura 2B), consistente com o dímero TMEM120A M207A em micelas detergentes LMNG. Esse comportamento de elução apresenta uma população homogênea e monodispersa de proteínas, tornando-a adequada para caracterização biofísica a jusante.

As propriedades das micelas detergentes da LMNG sob as condições experimentais de tampão foram analisadas usando fotometria de massa. As medições foram realizadas em tampão SEC com concentrações variáveis de LMNG na ausência de proteína, para avaliar a contribuição das micelas detergentes para a massa molecular clara. A 0,001% (p/v) LMNG, uma concentração acima da concentração crítica de micelas (CMC), o pico predominante foi detectado em aproximadamente 69 kDa, correspondendo apenas às micelles LMNG sem qualquer proteína associada (Figura 4A). Quando a concentração de LMNG foi reduzida para 0,0001% (p/v), abaixo da CMC, a espécie principal mudou para ~48 kDa, indicando a presença de agregados residuais menores de LMNG ou conjuntos submicelares sem proteína (Figura 4B). Mais adiante (Figura 4C), TMEM120A M207A foi diluído em um tampão SEC contendo diferentes concentrações de LMNG para avaliar seu estado oligomérico por fotometria de massa. A 0,00001% LMNG (~20x abaixo do CMC, magenta), um pico predominante foi observado em aproximadamente 42 kDa, correspondendo ao monômero de TMEM120A M207A. Com 0,00015% LMNG (~10x abaixo do CMC, azul), a população principal em ~86 kDa indicou a presença de dímeros. Aumentar a concentração de LMNG para 0,001% (~2x acima do CMC, laranja) resultou em uma espécie principal ~150 kDa, consistente com complexos proteína-detergente. A 0,002% de LMNG (~4x acima da CMC, verde), foi detectada uma distribuição ampla centrada em torno de 180 kDa, representando conjuntos maiores associados a micela ou oligômeros de ordem superior. Esses resultados demonstram que a concentração de LMNG dentro do tampão SEC influencia fortemente o estado oligomérico claro de TMEM120A M207A, com equilíbrio monômero-dímero observado abaixo da CMC e formação do complexo detergente-proteína predominando acima da CMC.

A estabilidade termodinâmica de TMEM120A M207A coletada do pico principal do SEC e mantida no buffer SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (p/v) LMNG, pH 7,8) foi avaliada por análise de desnaturação térmica. A proteína apresentou um ponto de inflexão em aproximadamente 46 °C, correspondente à sua temperatura de fusão (Tm) nessas condições solubilizadas em detergente. Esse valorT m indica estabilidade térmica moderada, sugerindo que TMEM120A M207A mantém uma conformação adequadamente dobrada dentro das micelas LMNG, mas pode começar a se desdobrar ou se agregar em temperaturas mais altas.

A interferometria de biocamada (BLI) mostra afinidade de ligação μM de TMEM120A M207A a GsMTx4T. Os traços na Figura 5 ilustram cinco etapas experimentais: (1) linha de base, (2) carga de amostras de TMEM120A M207A, (3) linha de base para remover ligação inespecífica e excesso de TMEM120A M207A, (4) associação e (5) dissociação. O deslocamento do comprimento de onda (nm) é representado ao longo do tempo para o aumento das concentrações de GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 e 100 μM) interagindo com TMEM120A M207A imobilizado.

Durante a linha de base inicial (passo 1), o sinal permaneceu estável, confirmando o equilíbrio do sensor no buffer. TMEM120A carga M207A (passo 2) produziu um aumento característico no sinal, correspondendo a ~50-80% de saturação da sonda entre os sensores. A fase de carga mostrou uma resposta ligeiramente curva em vez de um platô acentuado, possivelmente refletindo limitação parcial do transporte de massa, onde TMEM120A difusão do M207A para a superfície do sensor é mais lenta que a taxa de ligação — um efeito comum para proteínas solubilizadas em membrana ou detergente que podem influenciar a cobertura aparente da superfície.

O passo de base subsequente (passo 3) removeu efetivamente TMEM120A M207A não ligado ou mal fixado. Durante a fase de associação (passo 4), o aumento das concentrações de GsMTx4 resultou em aumentos claros e dependentes da concentração no deslocamento do comprimento de onda. Durante a dissociação (etapa 5), o biossensor foi colocado em um buffer SEC contendo LMNG a ~10x abaixo da CMC. Os primeiros 5-10 segundos de dissociação mostraram uma rápida diminuição do sinal, provavelmente representando liberação rápida de GsMTx4 de locais facilmente acessíveis, seguida por um decaimento mais lento que pode refletir complexos M207A-GsMTx4 mais estáveis TMEM120A com cinética de dissociação lenta. Os sinais da sonda de referência permaneceram planos durante todo o experimento, indicando ligação inespecífica mínima. No geral, esses dados demonstram interações específicas TMEM120A M207A-GsMTx4; no entanto, a cinética observada deve ser interpretada com cautela devido ao ambiente do detergente e aos potenciais efeitos do transporte em massa.

Os sensorgramas de associação e dissociação dos dados processados após a subtração da sonda de referência (Figura 6A) mostraram respostas dependentes da concentração para GsMTx4 na faixa de 5-100 μM. O aumento das concentrações de ligantes produziu deslocamentos progressivamente maiores no comprimento de onda, seguidos por uma diminuição gradual e lenta durante a fase de dissociação de 200 s. O conjunto de dados de 10 μM foi excluído do ajuste devido à sobreposição com o traço de 5 μM, o que melhorou a qualidade geral do modelo.

A análise cinética foi realizada usando um modelo de associação e dissociação de Langmuir 1:1 com uma estratégia local de ajuste completo, na qual as concentrações individuais dos analitos foram ajustadas independentemente dentro de uma estrutura cinética compartilhada (Figura 6B). As curvas ajustadas (vermelho) estavam em boa concordância com os traços experimentais, resultando em uma constante de dissociação estimada (KD) na faixa dos micromolares baixos. A análise residual (Figura 6C) não revelou desvios sistemáticos significativos, indicando que o modelo aplicado era apropriado para o conjunto de dados. Pequenas diferenças observadas durante a fase inicial de associação podem refletir limitações no transporte em massa ou os efeitos do ambiente de micela detergente. Exemplos adicionais de curvas de associação e dissociação ajustadas, gráficos de resíduos e estatísticas de ajuste entre múltiplas réplicas de ensaio e posições de sonda são mostrados na Figura Suplementar S8.

Nos dados brutos (Figura 5), os primeiros 5-10 segundos de dissociação mostraram uma rápida diminuição do sinal, provavelmente representando a liberação rápida de GsMTx4 de locais facilmente acessíveis, seguida por um decaimento mais lento que pode refletir complexos M207A-GsMTx4 mais estáveis TMEM120A com cinética de dissociação lenta. Portanto, na Tabela 2, os primeiros 100 s de dissociação foram removidos do ajuste. A ausência de desvio sistemático indica um bom ajuste do modelo local de Langmuir 1:1 para TMEM120A M207A em todas as concentrações testadas (Figura 7).

A análise cinética da ligação de GsMTx4 a TMEM120A M207A revelou comportamentos de associação dependentes da concentração e dissociação ao longo da faixa de ligantes de 5 a 100 μM (Tabela 1). As constantes de taxa de associação observadas (kon) aumentaram modestamente com o aumento da concentração de GsMTx4, variando de aproximadamente 1,0 × 10⁻⁶ a 3,2 × 10-6 1/M·s, enquanto as constantes estimadas da taxa de dissociação (koff) permaneceram próximas a zero dentro do erro experimental, sugerindo uma fase de dissociação lenta ou negligenciável sob as condições testadas. As constantes de dissociação de equilíbrio calculadas (Kd) estavam na faixa de micromolar baixa a média (~0,8-3,3 μM), consistentes com uma interação de afinidade moderada. O ajuste local completo usando um modelo de ligação Langmuir 1:1 resultou em ajustes de alta qualidade em todas as concentrações de GsMTx4, com coeficientes de correlação superiores a 0,99 e valores relativos baixos de χ2 tanto para as fases de associação quanto de dissociação (Tabela 1). As constantes de dissociação de equilíbrio calculadas foram consistentes entre concentrações e replicações, com valores de KD na faixa micromolar baixa (~1-2 μM), indicando ligação moderada, porém específica, entre TMEM120A M207A e GsMTx4.

Conjuntos de dados replicados em cada concentração mostraram reprodutibilidade, indicada por altos coeficientes de correlação (R² > 0,99) tanto para ajustes de associação quanto de dissociação. Os valores total e relativo de χ² foram baixos e comparáveis entre réplicas, reforçando ainda mais a robustez do modelo de ligação de Langmuir 1:1 aplicado na análise. Em concentrações mais altas de ligantes (≥50 μM), foram observados valores ligeiramente aumentadosde k em e KD , o que pode refletir pequenos efeitos de transporte de massa ou heterogeneidade local na superfície, em vez de verdadeiras mudanças de afinidade. A consistência cinética entre múltiplas réplicas e posições das sondas é ainda mais ilustrada na Figura Suplementar S9.

Os perfis cinéticos demonstram que GsMTx4 interage de forma específica e estável com TMEM120A M207A, formando complexos relativamente estáveis caracterizados por dissociação lenta e afinidade de ligação micromolar.

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Figura 1: Fluxo de trabalho de purificação de TMEM120A mutante M207A expresso em células de suspensão HEK293SF-17. Visão geral esquemática do procedimento de purificação de proteínas. TMEM120A M207A foi expressa a partir de plasmídeos pCDNA3.1 em células HEK293SF-17. As células foram solubilizadas em LMNG 0,5%, seguidas por purificação de afinidade usando resina anti-FLAG M2. A resina foi lavada com tampão contendo 0,01% de LMNG para remover proteínas não ligadas especificamente. TMEM120A M207A foi eluído em um tampão contendo 0,001% LMNG. O eluato foi concentrado usando filtros de corte de peso molecular de 100 kDa ou 30 kDa e ainda purificado por cromatografia de exclusão de tamanho em um tampão contendo 0,00015% LMNG. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Cromatografia de exclusão de tamanho e PÁGINA SDS de TMEM120A purificado M207A Em detergente LMNG (A) SDS-PAGE de TMEM120A M207A marcado com FLAG purificado por cromatografia de exclusão de tamanho. A faixa proteica aparece em ~50 kDa na pista 1, correspondendo ao monômero esperado. (B) Perfil SEC de TMEM120A purificado M207A em uma coluna SEC no buffer SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG, pH 7,8). A elução proteica indica uma espécie monodispersa predominante, adequada para ensaios biofísicos a jusante. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Fluorimetria diferencial de varredura de TMEM120A purificado M207A em LMNG. A DSF revela um ponto de inflexão termodinâmica a 46 °C, indicando a estabilidade térmica da proteína sob as condições de tampão testadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: caracterização de TMEM120A purificado M207A em detergente LMNG usando técnica de fotometria de massa. (A,B) Fotometria de massa do tampão SEC com concentrações variáveis de LMNG. Com 0,001% de LMNG (acima da concentração crítica de micelas, CMC), o peso molecular aparente é de ~69 kDa, correspondendo principalmente às micelas LMNG. Com 0,0001% LMNG (dez vezes abaixo do CMC), o pico aparece em ~48 kDa. (C) Análise por fotometria de massa dos efeitos dependentes da concentração da GNLM na oligomerização TMEM120A. TMEM120A em 0,00001% LMNG (~20x abaixo do CMC, magenta) apresenta uma população principal de aproximadamente 42 kDa (monômero). Em 0,00015% LMNG (~10x abaixo da CMC, azul), observa-se uma população de ~86 kDa, consistente com o dímero. Em 0,001% LMNG (~2x acima da CMC, laranja), uma espécie principal com ~150 kDa corresponde a complexos proteína-detergente. Em LMNG de 0,002% (~4x acima da CMC, verde), uma distribuição ampla centrada em ~180 kDa indica conjuntos associados a micela maiores ou oligômeros de ordem superior. Esses resultados demonstram que a concentração de LMNG influencia fortemente o estado oligomérico aparente da TMEM120A, com o equilíbrio monômero-dímero observado abaixo da CMC e a formação do complexo proteína-detergente predominando acima da CMC. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 5: Dados brutos de software mostrando TMEM120A interações M207A-GsMTx4. A interferometria da biocamada demonstra que TMEM120A (M207A) se liga ao inibidor do canal mecanossensível GsMTx4 com afinidade micromolar. A figura mostra os dados brutos de resposta do BLI obtidos do software Gator Prime, delineando as cinco fases-chave do ensaio: (1) Linha de base inicial, durante a qual o sinal permaneceu estável; (2) Imobilização de proteínas (carga), resultando em um aumento de aproximadamente 1,5 nm no deslocamento do comprimento de onda; (3) Segunda linha de base, permitindo a remoção de proteínas não ligadas ou frouxamente associadas; (4) Fase de associação (ligação de ligantes), onde o aumento das concentrações de GsMTx4 produziu uma resposta que subiu até ~5,5 nm em 300 s; e (5) fase de dissociação (liberação de ligante), mostrando decaimento gradual do sinal ao longo de 600 s. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Cinética de ligação de TMEM120A M207A com peptídeo GsMTx4. (A) Sensorgramas de associação e dissociação de TMEM120A M207A interagindo com GsMTx4 em cinco concentrações: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM e 100 μM. O conjunto de dados de 10 μM foi excluído do ajuste devido à sobreposição com a curva de 5 μM, o que melhorou o ajuste geral do modelo. Linhas verticais tracejadas em vermelho indicam o início e o fim da fase de dissociação. (B) O ajuste dos sensorgramas foi realizado usando um modelo de associação e dissociação 1:1 de Langmuir Local Full fitting. Curvas vermelhas representam o modelo ajustado, enquanto traços experimentais correspondem aos dados medidos de associação e dissociação para cada concentração de GsMTx4 (duas réplicas por condição). (C) Gráficos residuais mostrando a diferença entre os dados experimentais e o modelo ajustado tanto para as fases de associação quanto para a de dissociação, confirmando a qualidade do ajuste. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 7: Gráficos residuais correspondentes às curvas de ligação ajustadas mostradas. Cada gráfico representa os resíduos (diferença entre os dados experimentais e o modelo ajustado) para uma única concentração de GsMTx4: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM e 100 μM. Os resíduos são exibidos como desvio de deslocamento (nm) versus tempo(s), mostrando distribuição aleatória em torno de zero tanto nas fases de associação quanto na de dissociação. A ausência de desvio sistemático indica um bom ajuste do modelo Langmuir Local Full Fitting 1:1 para TMEM120A M207A em todas as concentrações testadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Resumo dos parâmetros cinéticos para TMEM120A ligação de M207A ao GsMTx4. Parâmetros cinéticos foram obtidos a partir do ajuste Local Full usando um modelo de ligação Langmuir 1:1. Associações (k ligadas), dissociação (k desligadas), constantes de taxa observadas (kobs) e constantes de dissociação de equilíbrio (KD) são relatadas para cada concentração de GsMTx4 e replicam. A qualidade do ajuste foi avaliada usando valores de R² e χ² para as fases completa, de associação e dissociação. Em todas as concentrações, os ajustes apresentaram altos coeficientes de correlação (R² > 0,99) e baixos valores relativos de χ², indicando desempenho confiável do modelo. Notas: M Conc. indica a concentração de GsMTx4 (μM). kobs representa a constante de taxa observada refletindo processos combinados de associação e dissociação. Erros relatados para kobs,k on e koff refletem incerteza de ajuste. Valores R² indicam adequação para fases plena, de associação e dissociação. Valores relativos de χ² representam métricas normalizadas de boa desajuste, enquanto valores absolutos de χ² indicam desvio residual entre dados observados e ajustados. Abreviações: kon = constante de taxa de associação (1/M·s); koff, = constante de taxa de dissociação (1/s); kobs = constante de taxa observada (1/s); KD = constante de dissociação de equilíbrio; Rmax = resposta máxima; Req = resposta de equilíbrio. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Parâmetros de processamento e resíduos do ajuste cinético. Parâmetros de processamento: início da associação, 0 s; fim da associação, 300 s; início de dissociação, 100 s; fim da dissociação, 300 s. Valor mínimo de R², 0,9; valor máximo de χ², 8. Passo de alinhamento: extremidade de um passo (índice = 1, média = 0). A correção entre passos foi aplicada durante a fase de associação. média da associação, 50; Média de dissociação, 0. O suavizamento Savitzky-Golay foi desativado. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura suplementar S1: Experimento de otimização para carregar diferentes concentrações da proteína TMEM120A M207A em sondas anti-FLAG com concentração fixa (100 nM) do peptídeo GsMTx4. (A) sensorgramas BLI brutos mostrando as cinco etapas da medição cinética: (1) linha de base no tampão SEC ou tampão de ensaio (25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (v/v) LMNG; 0,0005% (v/v) Tween-20); (2) carregamento de quatro concentrações diferentes de TMEM120A M207A na sonda FLAG, com a sonda de referência (laranja) usada como controle negativo para confirmar a ausência de ligação não específica; (3) no segundo passo de base; (4) a fase de associação e (5) a fase de dissociação. (B) Modelo global de ligação 1:1 ajusta para as quatro concentrações TMEM120A de M207A que interagem com o peptídeo GsMTx4 de 100 nM. (C) Gráficos residuais tanto para as fases de associação quanto de dissociação, mostrando desvios mínimos do modelo ajustado (<0,05 nm). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S2: Configuração da placa e configuração do ensaio. (A) Projeto de placa para uma placa de 384 poços, onde diferentes parâmetros podem ser atribuídos. As amostras correspondem ao ligante (GsMTx4) em várias concentrações. Poços laranja indicam TMEM120 proteína M207A a 250 nM. Poços representam réplicas proteicas a 250 nM, e o mesmo tampão foi usado para etapas de base, associação e dissociação. (B) Vista da placa máxima mostrando quatro sondas biossensoras anti-FLAG: uma sonda de referência e três sondas para réplicas de proteínas. Todas as sondas foram pré-umezidas no buffer de ensaio, regeneradas no buffer Q e neutralizadas no buffer de ensaio. O mesmo buffer foi usado em todas as etapas de baseline, associação e dissociação. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S3: Ciclos de configuração do ensaio, incluindo linha base, carregamento proteico, segundo base, associação e dissociação. Abreviações: B = buffer; L = carga; 0, 5, 10, 20, 30, 50 e 100 = concentrações de GsMTx4 em μM. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S4: Novo fluxo de trabalho de análise cinética (K). Selecione o ícone Experimento , que oferece uma visão geral de todos os ensaios realizados em um único experimento. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S5: Novo fluxo de trabalho de análise cinética (K).Ícone Alinhar e Filtrar , onde os dados brutos tanto das fases de associação quanto da dissociação podem ser revisados e analisados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S6: Novo fluxo de trabalho de análise de cinética (K).Ícone de Referência de Definição , usado para selecionar o sensor de referência apropriado para subtração de fundo e interpretação precisa dos dados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S7: Etapas de ajuste de ligação no fluxo de trabalho de análise cinética. Configurações dos parâmetros de ajuste cinético usadas para analisar dados de interação de ligação. O modelo assume uma interação 1:1 com um único local de ligação ao ligante. O tipo de ajuste é definido como Local, ajustando cada curva de concentração independentemente em vez de globalmente. A opção Full Fitting com Full Stitch ativado inclui toda a associação contínua e curvas de dissociação. Janelas de tempo para as fases de associação e dissociação são definidas de 0 a 300 s e de 0 a 200 s, respectivamente. Em contexto, o gráfico de ajuste de ligação, o gráfico residual e as curvas individuais do ensaio ilustram a qualidade do ajuste e a variabilidade experimental. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S8: Etapas de ajuste de binding no fluxo de trabalho de análise cinética. Gráfico de ajuste de ligação mostrando as fases de associação e dissociação entre múltiplas réplicas do ensaio e posições da sonda (C1 e D1). O gráfico residual abaixo avalia a qualidade do ajuste, com resíduos indicando diferenças entre os dados experimentais e o modelo ajustado; valores próximos de zero refletem um bom encaixe. A tabela anexa resume estatísticas de ajuste, incluindo valores de R² completo, associação R², dissociação R² e Qui-quadrado (X²) para cada réplica. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S9: Etapas de ajuste de ligação no fluxo de trabalho de análise cinética. Análise cinética das interações de ligação de múltiplos replicados e posições das sondas (C1 e D1). O deslocamento da resposta do sensor (nm) ao longo do tempo(s) exibe as fases de associação e dissociação, com cada curva codificada por cores pelo ensaio e pela posição da sonda. A linha vermelha tracejada vertical marca a transição entre as fases de associação (0-300 s) e dissociação. Abaixo, a tabela apresenta parâmetros cinéticos derivados do ajuste 1:1 do modelo de ligação, incluindo concentração do analito (M Conc.), constante de taxa de associação (kligado), constante de taxa de dissociação (koff), erros e a constante de dissociação de equilíbrio (KD). A qualidade consistente do ajuste apoia a robustez das medições cinéticas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S1: Tabela ilustrando os símbolos usados tanto na placa de 384 poços quanto na Max Plate. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S2: Parâmetros cinéticos obtidos para as quatro concentrações de TMEM120A M207A carregadas nos biossensores FLAG interagindo com peptídeos GsMTx4 de 100 nM, usando valores fixos de kon e koff. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Caracterizar as interações entre proteínas de membrana continua sendo desafiador devido à necessidade de purificação meticulosa de proteínas, otimização cuidadosa da concentração de detergente e design preciso do ensaio. Este estudo apresenta um fluxo de trabalho detalhado para TMEM120A M207A, ilustrando tanto a purificação quanto a análise cinética usando GsMTx4 com interferometria de biocamada (BLI).

Passos críticos e otimização:
Um dos passos críticos importantes foi a concentração de detergente, que foi identificada como um dos principais determinantes da estabilidade das proteínas. O processo de purificação envolveu solubilização celular com um tampão contendo 0,5% de LMNG, seguida de lavagem sequencial com 0,005% de LMNG, elução com 0,001% de LMNG e cromatografia final por exclusão de tamanho (SEC) em um tampão contendo 0,00015% de LMNG. Essa estratégia de detergente, baseada na baixa concentração crítica de micelas (CMC) e na taxa de desaceleração do LMNG, proporcionou maior estabilidade da proteína nas micelles durante a purificação. O tampão SEC continha detergente em uma concentração 10 vezes abaixo da CMC do LMNG (0,001%), minimizando efetivamente seu impacto nos ensaios biofísicos posteriores. A homogeneidade proteica e a ausência de agregação foram confirmadas por meio de espectrometria de massa e análise de estabilidade térmica. As Figuras 2, 3 e 4 ilustram a otimização bem-sucedida da purificação e estabilização de proteínas em concentrações sub-CMC de detergente.

A imobilização de proteínas no biossensor foi cuidadosamente controlada para alcançar 50-80% de saturação da sonda. Um nível de carga de 50-80% pode introduzir algum grau de limitação no transporte em massa; no entanto, essa faixa foi selecionada para fornecer força de sinal adequada no sistema BLI, onde as sondas se moviam entre os poços durante o ensaio. Alcançar esse nível de imobilização de ligantes ajudou a manter a qualidade consistente do sinal, embora tais níveis de carga tenham tanto vantagens quanto potenciais limitações. Incluir uma sonda de referência era fundamental para experimentos do BLI.

Um experimento de controle adicional no qual quatro níveis diferentes de TMEM120A imobilizados foram testados com uma única concentração peptídica (100 nM). Esses dados agora estão incluídos no manuscrito revisado (Figura Suplementar S1). Aumentar a quantidade de proteína imobilizada produziu sinais de carga mais altos, mas em todos os casos, o deslocamento permaneceu abaixo de 1 nm em relação à linha de base (Figura Suplementar S1A). Relatamos as curvas de associação ajustada e dissociação usando um modelo global de ligação 1:1, e também incluímos os gráficos residuais, que mostram pequenas diferenças não significativas entre os dados ajustados e experimentais.

Nos principais ensaios cinéticos (5-100 μM analito), as constantes de taxa ajustadas mostraram as tendências dependentes da concentração esperadas. Os valores dek off variavam de aproximadamente 1,48 × 10⁻⁴ a 1,43× 10⁻³ s⁻¹, enquanto os valores k variavam de 1,12 × 10² a 1,26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹. Essas mudanças graduais ao longo da série de concentrações são consistentes com a associação normal dependente do analito e o comportamento de dissociação.

No experimento controle, onde diferentes níveis de carga da sonda foram testados em uma única concentração de analito (100 nM), todos os quatro traços apresentaram constantes cinéticas muito semelhantes. Os valores dek off foram consistentemente 1,42 × 10⁻¹ s⁻¹, e os valores kem s⁻¹ foram consistentemente 2,76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ em todos os níveis de carga. Essa ausência de variação sugere que nem as fases de associação nem de dissociação foram afetadas pela densidade da sonda, limitações de transporte de massa ou religação de analitos.

Também se espera que a dissociação a 100 nM apareça mais rápida no experimento controle. A concentração de analitos de 100 nM está aproximadamente uma ordem de magnitude abaixo do KD, e em concentrações bemabaixo de K D o complexo é menos estável, e a ocupação efetiva é baixa. Nessas condições, a dissociação ocorre mais rapidamente porque a afinidade de ligação é mais fraca em baixas concentrações de analito, e a reassociação durante a fase de dissociação é mínima. Esse comportamento está alinhado com o que normalmente se observa quando a concentração do analito é substancialmente menor que KD.

Em conjunto, a consistência dos parâmetros cinéticos entre as cargas da sonda e o comportamento esperado em baixas concentrações de analitos apoiam a noção de que as constantes de taxa observadas refletem propriedades genuínas de ligação, e não artefatos de carga superficial ou efeitos de transporte de massa.

Cinética e interpretação da ligação:
A análise cinética foi realizada usando um modelo de associação e dissociação de Langmuir 1:1 com uma estratégia local de ajuste completo, na qual as concentrações individuais dos analitos foram ajustadas independentemente dentro de uma estrutura cinética compartilhada (Figura 6B). Essa abordagem foi escolhida em vez do ajuste global tradicional porque certos conjuntos de dados, especialmente em concentrações de ligantes mais baixas, apresentavam pequenas sobreposições ou desvios de fase inicial provavelmente causados por limitações de transporte de massa e efeitos das micelas do detergente na difusão de proteínas. O ajuste global assume que todos os traços seguem estritamente o mesmo comportamento cinético, que pode ser comprometido quando a acessibilidade superficial ou o microambiente local diferem levemente entre concentrações. O ajuste completo local permitiu que cada concentração de analito fosse modelada independentemente enquanto mantinha uma estrutura cinética consistente, garantindo que os parâmetros derivados refletissem com precisão o comportamento em cada concentração. As curvas ajustadas (vermelho) corresponderam de perto aos traços experimentais, resultando em uma constante de dissociação estimada (KD) na faixa dos micromolares baixos. A análise residual (Figura 6C) não revelou desvios sistemáticos significativos, apoiando a adequação do modelo para essas interações proteicas de membrana solubilizadas em detergente.

TMEM120A M207A e GsMTx4 apresentaram valores de KD na faixa micromolar baixa (∼0,8-3,3 μM). A taxa de associação (kon) aumentou modestamente com a concentração de ligantes, enquanto a taxa de dissociação (koff) permaneceu muito lenta, indicando formação estável de complexos. O decaimento rápido inicial do sinal durante os primeiros 5-10 segundos de dissociação provavelmente refletiu locais de ligação facilmente acessíveis, enquanto a fase mais lenta representou interações mais estáveis (Figura 6A). Essas observações destacam a importância de selecionar cuidadosamente as janelas de dissociação e considerar as limitações do transporte de massa ao analisar proteínas de membrana solubilizadas em detergente (Tabela 2).

Limitações e solução de problemas:
Várias limitações devem ser consideradas para proteínas de membrana solubilizadas em detergente, como TMEM120A M207A. Efeitos de transporte de massa podem ocorrer durante a fase inicial de associação, pois a proteína pode difundir lentamente para a superfície do biossensor, o que pode distorcer levemente as medições cinéticas. A sobrecarga do sensor é possível se a saturação da sonda exceder a faixa recomendada de 50-80%, potencialmente limitando a precisão da análise cinética global e afetando os valores de kon e koff. Efeitos dependentes do detergente podem influenciar a estabilidade da proteína, o estado oligomérico ou a acessibilidade à superfície, especialmente em concentrações acima ou próximas à CMC. Fatores adicionais incluem deriva menor da linha de base, ligação inespecífica e desafios na captura da cinética de dissociação muito lenta.

Muitos desses problemas podem ser mitigados por ajustes simples: reduzir a carga de proteínas para evitar supersaturação, otimizar a composição do tampão e incluir sondas de referência para corrigir deriva de linha de base ou sinais inespecíficos. Neste estudo, o tampão SEC contendo 0,00015% de LMNG e baixas concentrações de Tween-20 minimizou efetivamente a ligação inespecífica, mantendo a estabilidade proteica. Selecionar cuidadosamente a janela de dissociação para o ajuste cinético, juntamente com medições de replicação e análise de resíduos, também foi importante para confirmar a confiabilidade dos parâmetros cinéticos. Essas estratégias geralmente aumentam a reprodutibilidade e ajudam a gerar dados mais robustos e interpretáveis. O ajuste completo local foi empregado no lugar do ajuste global para levar em conta pequenas diferenças entre traços em concentrações individuais de ligandos, garantindo que os parâmetros cinéticos refletissem com precisão o comportamento de cada conjunto de dados.

BLI e outras técnicas biofísicas:
Comparada à ressonância de plasmons de superfície (SPR) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC), a interferometria de biocamada (BLI) oferece várias vantagens práticas para analisar as interações membrana-proteína e ligando. Assim como SPR e ITC, o BLI pode fornecer insights detalhados sobre interações de ligação, incluindo taxas de associação (kon), taxas de dissociação (koff) e constantes de dissociação de equilíbrio (KD), sem exigir sistemas microfluídicos complexos ou alta concentração de proteínas14. O formato de poço aberto, mergulho e leitura, permite troca rápida de buffers e processamento paralelo de múltiplas amostras, suportando maior taxa de transferência experimental. Ao contrário da ITC, que requer grandes quantidades de proteína altamente pura e fornece dados termodinâmicos, o BLI pode medir tanto as taxas de formação de complexos quanto de dissociação a partir da concentração mínima da amostra em nanomolar. O BLI também é compatível com tampões contendo detergente ou lipídio, tornando-o adequado para proteínas de membrana de baixo rendimento ou instáveis que são desafiadoras de estudar com outros métodos biofísicos. Apesar dessas vantagens, técnicas complementares como SPR ou ITC continuam úteis para confirmar a consistência termodinâmica e verificar os parâmetros de ligação em condições sem detergente e em condições de detergente, mas exigem alta concentração deproteína 3.

Direções futuras:
Esse fluxo de trabalho pode ser estendido para estudar outras proteínas de membrana, interações proteína-lipídico ou triagem de moduladores de pequenas moléculas. Combinar BLI com abordagens ortogonais, como fotometria de massa, caracterização estrutural ou crio-EM, pode fornecer insights mais detalhados sobre oligomerização, estequiometria e mecanismos de ligação. Otimizações adicionais também podem permitir a análise de ligantes de alta afinidade, interações multivalentes ou complexos em ambientes lipídicos mais nativos.

Em conclusão, o controle cuidadoso da imobilização proteica, concentração de detergente e condições de tampão permite que o BLI gere dados cinéticos confiáveis e reprodutíveis para TMEM120A M207A e proteínas membranares desafiadoras similares. Embora existam limitações inerentes, o método oferece uma plataforma robusta para estudar interações específicas, de afinidade moderada entre proteína, e ligando, sob condições experimentais bem definidas.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente à plataforma de pesquisa da Universidade de Melbourne, a Melbourne Protein Characterisation (MPC) Facility, pelo apoio na purificação e caracterização de proteínas. A pesquisa foi apoiada pela Bolsa de Ideias do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC) (2020/GNT2000934 para I.R.) e pelo Conselho Australiano de Pesquisa (Centros de Treinamento em Transformação Industrial, IC200100052 para I.R. e M.M.).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008Purification
Anti-FLAG probeGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220-10MLPurification
BioRenderBioRenderhttps://biorender.comFigure 1 creation 
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich9048-46-8Mass photometry
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019Cell culture
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High PerformanceEppendorfNAPurification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMerck11836170001Purification
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-Aldrich9003-98-9Purification
ExpiFectamine 293 Transfection KitThermofisherA14524Transfection
Gator Bio softwareGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061Cell culture
GsMTx4 trifluoroacetateSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growthATCCATCC CRL11268Cell culture
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)ThermofisherA50940Purification
Max PlateGator Bio130062BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001Purification
Prometheus High Sensitivity CapillariesNano TemperPR-C006Thermodynamic stability
Prometheus PantaNano TemperNAThermodynamic stability
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell DisrupterQsonicaNAPurification
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44Purification
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-LinkerGenScript BiotechNAPlasmid
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNAMass photometry

Referências

  1. Rong, Y., et al. TMEM120A contains a specific coenzyme A-binding site and might not mediate poking- or stretch-induced channel activities in cells. eLife. 10, e71474(2021).
  2. Livnat-Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real-time measurements of membrane protein-receptor interactions using surface plasmon resonance (SPR). J Vis Exp. (93), e51937(2014).
  3. Kovachka, S., Soule, P., Mus-Veteau, I. Microscale thermophoresis to evaluate the functionality of heterologously overexpressed membrane proteins in membrane preparations. Methods Mol Biol. 2507, 445-461 (2022).
  4. Ciesielski, G. L., Hytönen, V. P., Kaguni, L. S. Biolayer interferometry: a novel method to elucidate protein-protein and protein-DNA interactions in the mitochondrial DNA replisome. Methods Mol Biol. 1351, 223-231 (2016).
  5. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12, 791-800 (2009).
  6. Apiyo, D. O. Biolayer interferometry (Octet) for label-free biomolecular interaction sensing. Handbook of Surface Plasmon Resonance. Schasfoort, R. B. N. , 2nd edn, Royal Society of Chemistry. 356-397 (2017).
  7. Egan, D., Slaybaugh, C., Wang, R. Getting started: kinetics assay using bio-layer interferometry. Gator Bio Technical Note. , (2023).
  8. Beaulieu-Laroche, L., et al. TACAN is an ion channel involved in sensing mechanical pain. Cell. 180 (5), 956-967.e17 (2020).
  9. Niu, Y., et al. Analysis of the mechanosensor channel functionality of TACAN. eLife. 10, (2021).
  10. Xue, J., et al. TMEM120A is a coenzyme A-binding membrane protein with structural similarities to ELOVL fatty acid elongase. eLife. 10, e71220(2021).
  11. Chen, X., et al. Cryo-EM structure of the human TACAN in a closed state. Cell Rep. 38, 110445(2022).
  12. Suchyna, T. M. Piezo channels and GsMTx4: two milestones in our understanding of excitatory mechanosensitive channels and their role in pathology. Prog Biophys Mol Biol. 130, 244-253 (2017).
  13. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  14. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic surface plasmon resonance sensors: from principles to point-of-care applications. Sensors (Basel). 16 (8), 1175(2016).

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