Artigo de método

Perfil eletrofisiológico acordado do córtex pré-frontal ventromedial em um modelo murino de depressão e doença de Parkinson

DOI:

10.3791/69366

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30 de dezembro de 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC), 2August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute (IDIBAPS), 3Biomedical Research Networking Center for Mental Health (CIBERSAM), ISCIII, 4Human Anatomy and Embryology Department, Faculty of Medicine, University of Valencia

Neste artigo

Resumo

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Utilizando um modelo de camundongo semelhante à doença de Parkinson (DP), que superexpressa a forma mutante A53T da alfa-sinucleína humana (h-α-Syn) no núcleo do rafe dorsal (DR), desenvolvemos um método de registro eletrofisiológico para investigar o papel do circuito do córtex pré-frontal ventromedial (vmPFC)-DR nos transtornos depressivos/ansiosos da DP.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embora a doença de Parkinson (DP) seja principalmente conhecida como um distúrbio motor, sintomas não motores frequentemente surgem antes dos déficits motores e impactam significativamente a progressão da doença, sendo cruciais em todos os estágios da doença. Entre esses, depressão e ansiedade são os sintomas mais prevalentes e causam uma maior carga sintomática em mulheres do que em homens. Alterações no sistema serotoninérgico (5-HT) estão frequentemente associadas a distúrbios de humor, e acumulações de α-sinucleína (α-Syn) foram observadas nos núcleos 5-HT do rafo (RN) de pacientes com doença de Parkinson (DP) e depressão. Compreender os circuitos neurais subjacentes a esses sintomas não motores é, portanto, fundamental.

Aqui, apresentamos um protocolo aprimorado para investigar o papel do córtex pré-frontal ventromedial (vmPFC)-núcleo do rafe dorsal (DR) em transtornos de humor associados à DP, utilizando um modelo de camundongo feminino que superexpressa a forma mutante A53T da α-syn humana (h-α-syn) na DR. Nosso método permite avaliação de alta resolução da atividade neuronal nos córtices infralímbico (IL) e pré-límbico (PL) tanto sob condições basais quanto durante condicionamento aversivo e extinção. Utilizando um paradigma de condicionamento sensorial tom-luz em camundongos acordados e com a cabeça fixa, empregamos sondas eletrofisiológicas multicanal para registrar respostas neuronais. Experimentos foram realizados em corredores de realidade virtual, combinando uma esteira cilíndrica com uma tela visual de tela dupla para manter o engajamento comportamental, garantindo controle preciso dos estímulos sensoriais e estabilidade de gravação.

Esse protocolo se baseia no envolvimento estabelecido dos córtices IL e PL no condicionamento do medo e extinção, e fornece uma estrutura robusta para examinar a atividade neural dinâmica em circuitos implicados em comportamentos depressivos e semelhantes à ansiedade em DP. Ao permitir medições comportamentais e eletrofisiológicas simultâneas sob condições controladas, essa abordagem oferece uma ferramenta poderosa para elucidar os mecanismos neurobiológicos dos sintomas não motores na DP e para testar intervenções potenciais.

Introdução

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A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio motor, mas sabe-se que sintomas não motores precedem as manifestações motoras e são críticos em todos os estágios da doença1, 2, 3 e 4. Entre eles, depressão e ansiedade são os sintomas neuropsiquiátricos mais prevalentes, afetando gravemente a qualidade de vida dos pacientes com DP e causando uma maior carga sintomática nas mulheres do que noshomens. Apesar disso, eles frequentemente são subdiagnosticados e tratados de formainadequada. Por todas essas razões, é essencial compreender a neurobiologia e os circuitos envolvidos nos sintomas neuropsiquiátricos da DP para estratificar os pacientes e oferecer um cuidado mais personalizado.

Embora a etiologia da DP permaneça parcialmente incerta, várias características neuropatológicas importantes foram identificadas. A doença é caracterizada pela degeneração progressiva e perda de neurônios e fibras dopaminérgicas (DA) no sistema nigrostriatal, levando aos déficits motores prototípicos associados à PD 7,8. Outra marca da DP é a presença de corpos de Lewy (LB) e neuritos de Lewy — inclusões intracelulares formadas por agregados proteicos fibrilares — compostos predominantemente pela proteína α-sinucleína (α-Syn)9,10. Estudos de neuroimagem também revelam que outros sistemas de neurotransmissores são afetados — mesmo antes do envolvimento da DA — entre eles, o sistema serotoninérgico(5-HT) 11,12,13. Alterações no sistema serotoninérgico (5-HT) são comumente associadas a distúrbios de humor, e depósitos de α-sinucleína (α-Syn) foram detectados nos núcleos 5-HT do rafe (RN) de indivíduos diagnosticados com doença de Parkinson (DP) edepressão 14.

Os núcleos do rafe dorsal (DR) são o maior núcleo 5-HT do RN15, desempenhando um papel fundamental na regulação emocional, percepção, recompensa, agressividade e interações sociais. Consequentemente, a disfunção na RD está associada a transtornos neuropsiquiátricos como estresse, ansiedade edepressão 15,16. Neste ponto, é importante enfatizar a forte conexão funcional e anatômica bidirecional entre a DR e o córtex pré-frontal (CPF), uma região cerebral essencial para funções cerebrais de ordem superior. Enquanto as regiões mais dorsais da CPF estão relacionadas às funções cognitivas, as áreas mais ventromediais (vmPFC) desempenham um papel fundamental na regulação emocional, controle de ações, memória e tomada dedecisão 17,18. Portanto, a vmPFC e a DR juntas influenciam significativamente o humor, e a atividade alterada nesse circuito está associada a sintomasdepressivos 18. Além disso, o acúmulo de formas agregadas de α-Syn em neurônios 5-HT no RN demonstrou induzir fenótipos de ansiedade edepressivos semelhantes 19,20,21.

Utilizando um modelo de camundongo feminino com DP e fenótipo depressivo que superexpressa a forma mutante A53T da α-syn humana (h-α-Syn) na DR por meio de um vetor viral adenoassociado (AAV), desenvolvemos um método de registro eletrofisiológico. Esse método visa investigar o papel do circuito vmPFC-DR em transtornos depressivos/ansiosos em DP. Essa abordagem envolve a avaliação da atividade neuronal dos córtices infralímbico (IL) e pré-límbico (PL) em camundongos acordados por meio de registros de potenciais de campo local e de unidade única (LFPs). Isso é feito usando uma sonda multicanal em conjunto com um runner de realidade virtual. Reconhecendo o envolvimento dos córtices PL e IL no condicionamento aversivo, também medimos sua atividade durante esse paradigma para avaliar sua função em situações de estresse. É crucial entender que o PL impulsiona principalmente respostas condicionadas, enquanto o córtex IL desempenha um papel fundamental na extinção dessasrespostas 22,23.

O protocolo a seguir descreve os passos para implantar uma barra de cabeça e registrar agudamente a atividade elétrica dos córtices PL e IL in vivo. Conseguimos isso usando um corredor de realidade virtual, que combina uma esteira cilíndrica para mouses fixos com cabeça com uma tela visual dupla. O protocolo é estruturado em quatro etapas principais: (1) cirurgia de implantação de barra de cabeça, (2) habituação, (3) registro e aquisição de sinais, e (4) análise de dados: ordenação de picos e pré-processamento de dados.

Três semanas após induzir a superexpressão de h-α-syn no sistema 5-HT cerebral, os camundongos passam pela cirurgia de implantação da barra na cabeça, que possibilita a fixação subsequente da cabeça. Após um período de recuperação de 1 semana, os camundongos são habituados por 4 dias tanto ao experimentador quanto ao sistema de esteira e fixação da cabeça. No dia da gravação, essa configuração é usada para registrar a atividade neural dos córtices PL e IL sob condições de base e durante o condicionamento aversivo. Os dados neurais brutos são processados por meio de ordenação automática de picos com Kilosort4, seguida de curadoria manual em Phy2, a fim de extrair clusters de unidade única de alta qualidade para análise posterior (Figura 1).

O protocolo proposto de gravação vmPFC multicanal acordado e fixo oferece várias vantagens em comparação com alternativas clássicas, como preparações anestesiadas ou ex vivo e gravações sem fio em animais em movimento livre. Ao contrário das abordagens anestesiadas ou ex vivo, esse método permite a avaliação da atividade das vmPFC sob estimulação visual e auditiva controlada em um ambiente de realidade virtual, o que é essencial para implementar paradigmas de condicionamentoaversivo 24,25. Em contraste com gravações em movimento livre, a configuração fixa com cabeça oferece controle experimental preciso sobre entradas sensoriais e contingências de tarefas, reduzindo assim a variabilidade e possibilitando estruturas consistentes de ensaios. Além disso, a fixação da cabeça reduz o risco de desengajamento de tarefa observado em paradigmas em movimento livre, especialmente sob estimulação aversiva, ao mesmo tempo em que permite gravações multicanal estáveis e de altorendimento 26.

Do ponto de vista prático, esse protocolo exige que os animais estejam habituados à fixação da cabeça e à corrida na esteira, mas se beneficia de sistemas comerciais de fixação relativamente acessíveis que incorporam esteiras cilíndricas. Isso torna a abordagem acessível a laboratórios menores, já que as sondas podem ser reutilizadas várias vezes (até ~10 inserções), reduzindo substancialmente os custos em comparação com implantes crônicos de movimento livre. Consequentemente, esse método fornece um equilíbrio entre controle experimental, relevância comportamental e custo-efetividade. Outro fator a considerar é a implementação do paradigma de condicionamento aversivo. Neste estudo, empregamos um desenho experimental baseado na aversão natural dos roedores à luz: 10 tons auditivos (estímulos condicionados) foram seguidos por uma breve exposição à luz intensa (estímulo incondicionado). Embora esse padrão seja menos estressante do que outros métodos clássicos de condicionamento, como aqueles que envolvem choques elétricos, ele constitui um estressor mais semelhante no mundo real.

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Protocolo

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Todos os experimentos foram realizados com controles de faixa etária correspondente, e os procedimentos em animais foram desenhados de acordo com as regras dos 3R; conduzido de acordo com as diretrizes éticas previstas na Diretiva da UE 2010/63 (22 de setembro de 2010), na legislação espanhola (RD 1201/2005, L.32/2007 e L.6/2013) e aprovada pela Generalitat Valenciana (ES462500001003; ref. 2023-VSC-PA-0073), e pelo Comitê local de Bioética da Universidade de Valência (ref. A20230214153605).

NOTA: Para garantir a segurança e evitar contaminação, durante todo o procedimento, use equipamentos de proteção individual, incluindo luvas e botinhas descartáveis, jaleco, máscara e rede para cabelo. Utilize sistemas veterinários de retomada de medicamentos para o descarte de resíduos resultantes de seu uso, de acordo com as regulamentações locais e os programas nacionais de retomada aplicáveis.

1. Geração de modelos de camundongos

NOTA: Fêmeas adultas de camundongos C57BL/6J (9 semanas) foram alojadas sob condições ambientais controladas (22 ± 1 °C; ciclo de 12 horas luz/escuro) com acesso ad libitum a comida e água.

  1. Sob anestesia isoflurana (4% para indução, 2% para manutenção) na câmara de anestesia do camundongo, designa aleatoriamente os camundongos para receber microinjeções estereotáxicas na DR (coordenadas relativas ao bregma: anteroposterior [AP] −4,5 mm, mediolateral [ML] −1,0 mm, dorsoventral [DV] −3,2 mm; ângulo de injeção: 20°) usando um microinjetor automatizado com vazão de 0,4 μL/min, como descritoanteriormente 19, 27, 28.
  2. Garantir que cada camundongo receba um volume total de 0,6 μL de um viral viral recombinante associado ao adeno-tipo 1/2 (AAV1/2; concentração: 5,16 × 1012 gp/mL) codificando a forma mutante A53T do h-α-Syn humano, para induzir superexpressão em neurônios 5-HT da DR (n = 4) ou um vetor vazio AAV1/2 contendo DNA empacotador não codificante (AAV-EV), usado como grupo de controle (n=5).
  3. Para evitar refluxo, mantenha a agulha no lugar por mais 8 minutos antes de retirá-la lentamente a uma taxa de 320-400 μm/min.
    NOTA: Por segurança, certifique-se de que os sistemas de saqueação estejam funcionando corretamente para capturar os vapores anestésicos antes de qualquer cirurgia estereotáxica (seções 1 e 2). Em caso de derramamento de isoflurano ao reabastecer o vaporizador, limpe-o imediatamente usando um material inerte e absorvente, como serragem. Use sistemas veterinários de retomada de medicamentos para descarte de filtros de isoflurano e quaisquer resíduos resultantes do seu uso, de acordo com as regulamentações locais.

2. Cirurgia de implante de barra de cabeça

NOTA: Realize a cirurgia de implantação da barra de cabeça seguindo os passos abaixo, 3 semanas após gerar o modelo do camundongo.

  1. Preparação pré-cirúrgica e anestesia
    1. Anestesie o animal com isoflurano (4% para indução, 1,5-2% para manutenção) administrado por meio de um vaporizador de isoflurano.
    2. Posicione o rato dentro do aparelho estereotáxico, em uma almofada térmica, para manter a temperatura corporal durante todo o procedimento.
    3. Abra delicadamente a boca do rato para colocar os dentes na barra de mordida e prenda a máscara conectada a um aparelho estereotáxico, garantindo a entrega contínua de isoflurano para manutenção da anestesia.
    4. Aplique colírios para prevenir ulceração ocular.
    5. Administrar analgesia pelo menos 10 minutos antes da incisão pelo bisturi por meio de injeção subcutânea de butorfanol (5 mg/kg em solução salina).
    6. Aplique lidocaína regional (0,03 mL em cada ouvido, 4 mg/kg, não exceda doses máximas de 7 mg/kg ou creme de lidocaína/prilocaína [25 mg/g de lidocaína e 25 mg/g de prilocaína]) no ouvido interno para reduzir o desconforto causado pelas barras auriculares.
  2. Posicionamento estereotáxico e preparação do crânio
    1. Posicione as barras auriculares para segurar a cabeça com segurança, garantindo simetria e movimento mínimo.
    2. Ajuste a barra incisiva para trazer bregma e lambda ao mesmo nível horizontal, certificando-se de que estejam na linha média.
    3. Confirme a indução da anestesia verificando perda de retirada do pedal, reflexos palpebrais, diminuição da frequência respiratória e ausência de movimento dos bigodes.
    4. Certifique-se de que o mouse esteja corretamente posicionado no quadro estereotáxico, com as barras auriculares cuidadosamente ajustadas.
    5. Raspe a área cirúrgica e desinfete-a usando uma solução antisséptica (povidona-iodo seguida de etanol 70%) para minimizar o risco de infecção.
    6. Faça uma incisão no couro cabeludo na linha média e retraia suavemente os tecidos subjacentes para expor o crânio enquanto mantém a hemostasia. Certifique-se de que a pele esteja suficientemente aberta para visualizar as cristas parietotemporais. Para isso, coloque quatro finas pinças bulldog na fáscia sob a pele para maximizar a exposição.
    7. Limpe e seque completamente o crânio exposto para uma visão clara dos pontos de referência anatômicos (bregma e lambda).
    8. Nivelando o crânio no eixo anteroposterior alinhando o bregma e a lambda no mesmo plano horizontal.
    9. Nivele o crânio no eixo mediolateral igualando a profundidade de ambas as cristas parietotemporais.
  3. Perfuração e colocação de implantes
    1. Perfure um furo de 1 mm de diâmetro acima do vmPFC nas coordenadas AP: +1,75; ML: −0,4; DV: +3,1 (Figura 2). Use o braço estereotáxico para marcar os quatro vértices com tinta e guiar a inserção da sonda de silício no dia da gravação. Além disso, desenhe uma cruz conectando os pontos descritos anteriormente com um bisturi e aplicando uma quantidade abundante de tinta para que penetre nas incisões, garantindo que as marcas permaneçam estáveis. Remova qualquer excesso de tinta com um cotonete umedecido com álcool 70%.
    2. Fure dois furos adicionais na região posterior do crânio acima do cerebelo. Insira um fio manualmente em cada furo para referência futura e aterramento (Figura 2), respectivamente.
      1. Alternativamente, use parafusos de aço inoxidável (aço inoxidável A2, M1 × tamanho 2, ou aço inoxidável 18-8, diâmetro 0,061" ×comprimento 3/16") ou puestas macho de aço inoxidável. Independentemente da escolha, certifique-se de que o elemento que fornece contato elétrico permaneça em contato direto com a superfície cerebral sem exercer pressão para evitar danos tecidos, comprometer o bem-estar animal ou afetar negativamente a qualidade da gravação.
    3. Faça sulcos rasos no crânio exposto com um bisturi para aumentar a área de superfície e melhorar a adesão do implante.
    4. Aplique uma resina adesiva dental intermediária ao crânio limpo e seco em duas camadas sequenciais: primeiro com a mistura base-catalisador, permitindo que seque completamente, e depois com a mistura contendo pó, garantindo cobertura de toda a superfície e das bordas do crânio. Verifique com uma pinça que a ligação adesiva entre o crânio e o futuro cimento implante esteja totalmente solidificada antes de prosseguir.
    5. Coloque uma barra de cabeça de aço inoxidável entre o furo de gravação do PFC e os furos de referência/terra (Figura 2). Alinhe a barra da cabeça com o braço estereotáxico para garantir que fique completamente nivelada com o crânio, mantendo assim coordenadas estereotáxicas precisas durante a fixação da cabeça e a subsequente inserção da sonda de silício.
    6. Anexe todos os componentes metálicos ao crânio usando cimento dentário, evitando cuidadosamente qualquer entrada de cimento no furo de gravação.
    7. Cubra a craniotomia usando um silicone cirúrgico bicomponente.
      NOTA: Se todos os passos forem seguidos cuidadosamente, espera-se que a implantação e a funcionalidade subsequente da barra de cabeça ocorram sem complicações, com uma taxa estimada de sucesso superior a 95%.
  4. Cuidados pós-operatórios
    1. Monitore cuidadosamente a recuperação do camundongo após a cirurgia cerebral, garantindo que o animal recupere a consciência, mantenha a temperatura corporal e experimente alívio da dor.
    2. Os camundongos de casa individualmente em gaiolas e os monitorem até a recuperação total.
    3. Administrar butorfanol subcutâneo (5 mg/kg em solução salina) a cada 12 horas durante 3 dias após a cirurgia.
      NOTA: (CRÍTICO) Durante todo o procedimento cirúrgico, monitore continuamente os sinais vitais (frequência cardíaca e respiratória, saturação de oxigênio e pressão arterial). Aplique colírios conforme necessário para evitar ressecamento ou dano na córnea.

3. Habituação

NOTA: Assim que os camundongos recuperam seu peso pré-cirúrgico (aproximadamente 5 a 7 dias após a cirurgia), inicie um protocolo de habituação de 4 dias para se acostumar gradualmente ao ambiente experimental.

  1. Dia 1: Realize duas sessões de manuseio de 10 minutos cada, com um período de descanso de 1 hora entre as sessões para familiarizar os camundongos com o experimentador. Toque suavemente o mouse enquanto ele está no antebraço para familiarizá-lo com o experimentador.
  2. Dia 2: Realize duas sessões de manuseio de 5 minutos. Após cada sessão, segure suavemente os camundongos pela barra de cabeça em intervalos de 10 segundos, totalizando 5 minutos.
  3. Dia 3: Após uma breve sessão de manuseio, deixe os ratos correrem livremente na esteira por 7 minutos. Depois, fixe a cabeça e mantenha os ratos na posição fixa por 5 minutos.
  4. Dia 4: Realize uma corrida de 15 minutos com a cabeça fixa na esteira.
    NOTA: (CRÍTICO) Animais que apresentam perda de peso excessiva, barbearia, diminuição do comportamento exploratório ou motilidade reduzida, de acordo com as diretrizes estabelecidas de bem-estar animal, devem ser retirados do estudo. O implante deve permanecer completamente estável. Qualquer deslocamento requer a exclusão do animal do estudo, pois pode danificar a sonda multicanal durante a gravação e/ou resultar em sinais instáveis e ruidosos.

4. Preparação da sonda

NOTA: Para conectar a sonda aos adaptadores (Figura 3A), siga estes passos:

  1. Conecte o adaptador/conector da sonda ao adaptador do braço estereotáxico.
  2. Acople 2 adaptadores de estágio de cabeça (cada um Om32) ao adaptador de sonda (Figura 3A), garantindo que a orientação coincida e evitando força excessiva.
  3. Conecte a sonda ao adaptador (Figura 3B). Para permitir gravações simultâneas das regiões IL e PL em 64 profundidades distintas, use uma sonda de silício de 64 canais de um haste (comprimento do haste: 8 mm; Espessura do eixo: 15 μm) (Figura 4A).
  4. Para facilitar a localização subsequente da sonda, revestir a sonda com um corante fluorescente histologicamente compatível ou partículas ferromagnéticas, permitindo a verificação post hoc do local de registro.
  5. Aplique o corante por um dos seguintes métodos:
    1. Mergulhe toda a haste na solução.
    2. Solte uma pequena gota da solução de uma micropipeta sobre a sonda e espalhe ao longo da fala.
    3. Use um pincel fino mergulhado na solução para pintar a parte de trás da sonda.
    4. Para os passos 4.5.2 e 4.5.3, aplique pelo menos três traços para garantir o revestimento adequado da haste.
      NOTA: Os passos 4.1 a 4.3 são necessários apenas na primeira vez que a sonda é usada, pois pode ser reutilizada em múltiplas sessões de gravação. Após as gravações, desconecte os cabos da interface periférica serial (SPI) mantendo a sonda conectada ao adaptador e os adaptadores montados no adaptador do braço esteretáxico.

5. Gravação e aquisição de sinais

  1. Monitore o ciclo estroso, utilizando um protocolo não invasivo baseado na tipologia celular em esframaxios vaginais para garantir que as fêmeas estejam na fasediestrus 29,30.
  2. Prenda o animal em uma posição fixa com a cabeça em uma esteira cilíndrica integrada a uma estrutura estereotáxica (Figura 4B). Certifique-se de que a esteira e a estrutura estejam devidamente alinhadas para proporcionar estabilidade e comparabilidade entre os sujeitos.
  3. Para gravar e adquirir sinais, siga os passos 5.3.1-5.3.15.
    1. Use uma lente de aumento para garantir que o implante permaneça completamente imóvel.
    2. Monte o conjunto da sonda — composto pela sonda, adaptadores e adaptadores headstage — no braço adaptador do quadro estereotáxico.
    3. Conecte os cabos SPI, anteriormente conectados à placa de aquisição, aos estágios principais (Figura 3B). Mantenha um registro de qual cabo SPI está conectado a cada headstage, pois essa correspondência é essencial para preservar o layout dos eletrodos durante a subsequente separação automática de picos.
    4. Conecte o fio terra do adaptador da sonda à ponte macho ipsilateral ao hemisfério registrado, e o fio de referência ao lado contralateral. Aplique uma pequena quantidade de estanho de solda no fio embutido no cérebro, depois aplique calor brevemente para fixar a conexão. Evite calor excessivo para evitar danos ao tecido subjacente ou à eletrônica adaptadora.
    5. Posicione uma lente de aumento para visualizar o orifício feito para a inserção da sonda nos córtices PL e IL. Certifique-se de que os pontos de referência da tinta permaneçam claramente visíveis o tempo todo para manter coordenadas estereotáxicas precisas durante o procedimento.
    6. Guie a sonda até o centro do buraco do VMPF usando o braço estereotáxico e os pontos de referência pré-marcados.
    7. Posicione cuidadosamente a sonda no centro da craniotomia e toque suavemente a superfície do cérebro. Aplique soro salino morno no tecido exposto para evitar ressecamento.
    8. Comece a abaixar a sonda a uma taxa de 50 μm/min por 4-5 minutos para minimizar a inflamação dos tecidos. Certifique-se de que a haste da sonda não dobre durante essa inserção inicial.
    9. Meça a impedância dos locais de gravação e compare os valores com os fornecidos pelo fabricante. Essa avaliação inicial garante que os primeiros canais que acessam o cérebro não foram danificados ou bloqueados durante a inserção.
      NOTA: (CRÍTICO) As impedâncias dos eletrodos devem ser comparadas com os valores de referência do fabricante. Desvios de até ~30% geralmente são aceitáveis e não comprometem as gravações. Aumentos entre 30-100% ainda podem ser utilizáveis, mas exigem cautela e monitoramento mais rigoroso. Mudanças acima de 100% frequentemente indicam danos ou bloqueios, e os locais afetados devem ser considerados pouco confiáveis. Nesses casos, a sonda deve ser limpa para reduzir a impedância conforme descrito anteriormente. Se impedâncias não puderem ser restauradas a uma faixa aceitável, a sonda deve ser descartada. No entanto, cabe ao experimentador quantos canais não confiáveis podem ser tolerados antes de descartar a sonda; Um padrão comumente aplicado é que não mais que ~10% dos canais devem ser comprometidos.
    10. Continue abaixando a sonda a uma taxa de 50 μm/min enquanto monitora o sinal ao vivo dos canais que entram no cérebro. Verifique se esses sinais se assemelham aos dos canais previamente avaliados para confirmar a inserção correta.
    11. Avance a sonda até atingir uma profundidade de +3,1 mm DV, mantendo a craniotomia hidratada aplicando soro fisiológico morno durante a descida.
    12. Remova a lupa e elimine quaisquer outras fontes de ruído elétrico do ambiente.
    13. Remeça a impedância para verificar se nenhum local de gravação ficou bloqueado durante a redução da sonda.
    14. Monitore o sinal de 4-5 canais consecutivos como referência e espere de 90 a 120 minutos pela estabilização do sinal da sonda. Após esse período de estabilização, verifique se a deriva do sinal é mínima para garantir que a subsequente ordenação automática de picos possa isolar de forma confiável clusters de unidade única.
    15. Remeça a impedância antes de iniciar a aquisição de dados para confirmar as condições adequadas do local de gravação e estabelecer uma medição de impedância de referência. Aplique soro salino morno regularmente para evitar que o tecido ressece. Salve a gravação como um arquivo binário (por exemplo, .dat ou .bin) para facilitar o pré-processamento subsequente dos dados.
  4. Uma vez estável, siga os passos 5.4.1-5.4.6.
    1. Registre a atividade neural de base por 30 minutos (Figura 4C).
    2. Inicie o protocolo de condicionamento aversivo usando Arduino, 30 minutos após a gravação inicial. Consiste em 10 tons auditivos (10 s/ton), executados uma vez por minuto durante 10 minutos. Cada tom é imediatamente seguido por um estímulo luminoso de 10 segundos apresentado pelas telas de realidade virtual (Figura 4C).
    3. Registre a atividade neural por 10 minutos sem nenhum estímulo condicionador.
    4. Registre a atividade cortical PL e IL durante o protocolo de extinção, no qual 10 tons auditivos são apresentados sem o estímulo luminoso subsequente.
    5. Registre a atividade neural por mais 10 minutos na ausência de qualquer estímulo.
    6. Pare a gravação.
  5. Procedimentos pós-gravação: Após concluir a sessão de gravação, siga o passo 5.5.1.
    1. Retirada da sonda: Aplique soro salino morno e retire cuidadosamente a sonda a uma taxa de 100-150 μm/min enquanto monitora continuamente os sinais dos eletrodos para evitar danos mecânicos à sonda e alongamento do tecido, que podem comprometer a reconstrução histológica subsequente.
    2. Depois que a sonda for retirada do cérebro, deixe imediatamente a haste de molho em água destilada por 10 minutos para evitar que o tecido aderido ressece.
    3. Anestesie o animal com pentobarbital de sódio (100 mg/kg). Depois, dentro de uma capucha química, perfunde o camundongo transcardicalmente com 80 mL de solução salina (0,9%), seguido por 80 mL de paraformaldeído diluído 4% em PB (0,1 M, pH 7,6).
      1. Para evitar paraformaldeído, contato e inalação, use equipamentos de proteção ocular/facial, luvas quimicamente protetoras e máscara contra poeira. Ao final da perfusão, deposite o paraformaldeído restante em um recipiente para solventes não halogenados.
      2. Em caso de derramamento, umedeça o material para evitar a dispersão de poeira e coloque-o em recipientes selados. Limpe as áreas contaminadas e as superfícies de trabalho com água sanitária para neutralizar o paraformaldeído.
    4. Remova o cérebro, fixe a post-fixação durante a noite a 4 °C e armazene 30% de sacarose em PB (0,1 M, pH 7,6) a 4 °C para crioproteção. Obtenha seções coronais de 30 μm usando um micrótomo congelante e monte as fatias em lâminas de vidro gelatinizado.
      NOTA: Essas seções serão usadas para confirmar a superexpressão da α-Syn da DR por imunohistoquímica como anteriormente19, 20, 21 e localização da sonda.
    5. Limpeza da sonda: Submerga a região implantável da sonda em uma solução enzimática de detergente a 1% em água destilada por 1 hora.
    6. Deixe a haste da sonda de molho em água destilada por mais 10 minutos para remover resíduos de detergente.
    7. Secar por 20-30 minutos em posição ereta. Após a secagem, inspecione a sonda ao microscópio para confirmar que não há tecido ou detritos nos locais de gravação. Se a sonda estiver completamente limpa, mergulhe-a em álcool isopropílico de alta qualidade por 1 minuto e armazene-a em sua caixa antiestática original.

6. Análise de dados: Ordenação de picos e pré-processamento de dados

NOTA: Para analisar registros neurais extracelulares e atribuir picos individuais a neurônios específicos, utilize o algoritmo de separação de espinhos Kilosort431 .

  1. Realize a triagem automática de picos usando o Kilosort431. Na interface gráfica do Kilosort4, selecione o arquivo binário de gravação e especifique o layout da sonda de acordo com a folha de configuração do fabricante. Execute a ordenação de picos usando os parâmetros padrão, que são ideais para capturar as formas de onda gravadas nos córtices IL e PL sem ajustes adicionais.
  2. Inspecione a saída do Kilosort usando Phy2 (kwikteam/phy) para curadoria manual adicional. Incorpore plugins desenvolvidos pela comunidade (petersenpeter/phy2-plugins; jiumao2/PhyWaveformPlugin) para adicionar funcionalidades extras ao Phy2 e melhorar a qualidade dos dados curados.
  3. Rotule como ruído e descarte quaisquer clusters com frequência <0,05 Hz ou contendo menos de 500 picos.
  4. Além disso, marque os seguintes agrupamentos como ruído:
    1. Marque aqueles que exibem auto-correlogramas triangulares como ruído.
    2. Marque aqueles com formas de onda que não se assemelham a picos como ruído.
    3. Marque aqueles detectados em um único canal de gravação ou em todos os canais com amplitude variável como ruído.
    4. Marque aqueles que apresentam forte periodicidade em seus autocorrelogramas como ruído.
  5. Selecione apenas agrupamentos que exibam formas de onda fisiologicamente apropriadas, evidências de um vale refratário no autocorrelograma, variações plausíveis de amplitude e componentes principais claramente separados.
  6. Limpe manualmente cada cluster aplicando a remoção de outliers baseada na distância de Mahalanobis.
  7. Continue revisando as formas de onda e as variações de amplitude como indicadores-chave da validade da limpeza manual.
    NOTA: Uma vez concluída a separação de picos, os padrões de atividade neuronal do vmPFC podem ser analisados usando as rotinas implementadas em Python.

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Resultados

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Os registros recentes da atividade cortical de PL e IL, utilizando o protocolo experimental detalhado, revelam achados significativos: a superexpressão de h-α-Syn na DR, que induz um fenótipo semelhante à ansiedade em camundongos fêmeas, também altera a atividade vmPFC ventromedial. Por meio de análises baseadas em Python, demonstramos que a superexpressão de α-Syn em neurônios 5-HT do núcleo DR alterava a dinâmica de disparo e a organização funcional do circuito vmPFC-DR, reduzindo a distinção eletrofisiológica entre su...

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Discussão

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Este protocolo apresenta uma metodologia robusta para avaliação eletrofisiológica in vivo dos córtices PL e IL em camundongos acordados e com a cabeça fixa, utilizando um sistema de corredor de realidade virtual. A importância desse método está em sua capacidade de investigar o circuito vmPFC-DR diretamente em camundongos acordados e comportando-se dentro de um modelo de DP. Mesmo que a fixação da cabeça restrinja os movimentos dos animais e possa ser estressante, ela oferece co...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Bolsa BBRF Young Investigator Grant 31547 (MSA) de 2023, pela bolsa MCIU/AEI/FEDER UE PID2022-141700OB-I00, MCIN/AEI/10. 13039/501100011033 (AB), AGAUR 2021-SGR-01358, Governo da Catalunha (AB), e PID2022-141733NB-I00 (VT). Também gostaríamos de agradecer à Rede Espanhola para Pesquisa em Estresse, MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e CB/07/09/0034 Centro de Pesquisa Biomédica em Saúde Mental (CIBERSAM). A MSA possui uma Bolsa Margarita Salas (MS21-132) da Universidade de Valência (reclassificação do Sistema Universitário Espanhol do Ministério das Universidades do Governo da Espanha, financiada pela União Europeia, Next Generation UE).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AAV1/2-CMV/CBA-Humano A53T aSyn-WPRE-BGH-polyARio CharlesGD1001-RVHumano A53T aSyn
AAV1/2-CMV/CBA-Nulo/Vazia-WPRE-BGH-polyARio CharlesGD1004-RVControle de Vetores Vazios
ADPT A64-Om32x2Cambridge NeuroTechOmnetics 2228Adaptador
silicone cirúrgico bicomponente  Instrumentos de Precisão MundialKWIK-SIL
Butorphanol Torbugesic vet / cymit quí Mica67753-31-5
DuraLayReliance Dental Manufacturing / Kalma43640cimento dentário  
Sonda multicanal H9Cambridge NeuroTechASSY-77 H9
Creme EMLA (Lidocaína / pricolaína) Lirios Vañ ó Farmácia Sempere679290
microinjetor Instrumento de Precisão MundialKDS-310-PLUS
MSS Isoflurane Vaporizer  Suprimentos e Serviços Médicos, Reino UnidoMSSVAP02 
Conselho de Aquisição da Open EphysOpen EphysOEPS-9029Conselho de aquisições; O Open Ephys Acquisition Board pode transmitir até 512 canais de dados neurais para um computador via USB
C& B MetaBond ParkellS380-RDCimento adesivo rápido
Pentobarbital Vetoquinol Dolethal / Merck Life Science, S.L.U.P-010-1MLBarbitúricos
RHD 32-canal   HeadstageTecnologias Intan#C3314adaptador de estágio principal  
SiccafluidThea S.A. Laboratories / Lirios Vañ ó Farmácia Sempere6515167Gel oftalmológico & nbsp;
Aparelho Estereotáxico Stoelting51730U
Quadro estereotáxicoNarishigeSR-6N/SM-15R
Terg-a-zimaSigma AldrichZ273287Solução de limpeza da sonda

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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