Artigo de método

Geração Eficiente e Rápida de Células Assassinas Induzidas por CAR-T e Citocinas em Dispositivos Escaláveis por GMP

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DOI:

10.3791/69369

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5 de dezembro de 2025

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1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método escalável para a expansão de produtos de Terapias Celulares Adotivas (ACT), nomeadamente células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)-T e células Killer Induzidas por Citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansão rápida permeável a gases (G-Rex), demonstrando crescimento eficiente e robusto em um ambiente clinicamente relevante.

Resumo

As terapias celulares adotivas (ACT) avançaram rapidamente nos últimos anos, desempenhando um papel fundamental na imunoterapia contra o câncer e influenciando significativamente os resultados do tratamento. Uma etapa crítica no desenvolvimento da terapia celular, tanto em estágio pré-clínico quanto clínico, é o processo de fabricação. Métodos convencionais de cultura estática exigem manipulação celular frequente e frequentemente são limitados pela redução da troca gasosa e do fornecimento de nutrientes, o que pode comprometer o rendimento celular e o fenótipo. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo, reproduzível e escalável para a expansão ex vivo de dois produtos ACT, a saber, células do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)-T e células Cytokined Induced Killer (CIK), utilizando dispositivos de expansão rápida permeável a gases (G-Rex). Os dispositivos G-Rex são especificamente projetados para melhorar a troca de nutrientes e apoiar culturas de alta densidade com intervenção mínima do usuário. Entre as várias abordagens do ACT, as células CAR-T demonstraram notável sucesso no tratamento de malignidades hematológicas, facilitando um avanço rápido da pesquisa experimental para aplicações clínicas. Além das células CAR-T, as células CIK também têm sido amplamente aplicadas em ensaios clínicos devido ao seu fenótipo característico e à ausência de eventos adversos relacionados ao tratamento e da Doença Enxerto contra Hospedeiro (GvHD). Este protocolo descreve os principais passos técnicos para ambos os tipos celulares, começando pelo isolamento e semeamento das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Brevemente, os PBMCs são estimulados com anticorpos anti-CD3/CD28, seguidos por transdução lentiviral para expandir as células CAR-T, ou com Interferon-γ (IFN-γ), anticorpo anti-CD3 e Interleucina 2 (IL-2) para obter células CIK. A citometria de fluxo é empregada para monitorar a viabilidade e o fenótipo das células, e ensaios funcionais são realizados para confirmar o potencial terapêutico do produto celular e validar a escalabilidade da abordagem. No geral, esse protocolo oferece uma solução prática para produzir um grande número de células efetoras em um ambiente pré-clínico, facilitando a aplicação clínica em várias populações de células imunes. Por fim, oferece uma solução escalável para a fabricação de células efetoras de alto rendimento.

Introdução

A terapia celular adotiva (ACT) tornou-se um pilar importante das terapias avançadas para o tratamento do câncer. Essa abordagem é baseada na administração ex vivo de produtos celulares expandidos para alcançar eficácia antitumoral1. Até o momento, muitos tipos celulares foram usados no ACT, variando desde abordagens antigênicos-específicas, por exemplo, natural killer (NK)2, assassino induzido por citocinas (CIK)3,4, natural killer T (NKT)5 ou células Tγδ 6, até células altamente específicas e personalizadas, como linfócitos infiltradores de tumores (TILs)7 e terapias celulares engenheiradas, por exemplo, receptor de antígeno quimérico (CAR)1. 8 e células receptoras de células T (TCR) 9,10.

As células CAR-T são células T geneticamente modificadas geradas por transdução viral ex vivo para expressar um receptor imunológico sintético projetado para reconhecer um alvo molecular específico. A estrutura CAR consiste em um anticorpo Fragmento variável de cadeia única (scFv) específico para antígeno, combinado com domínios de sinalização intracelular, incluindo a cadeia TCRζ e moléculas coestimuladoras. Após o engajamento do antígeno, o domínio intracelular fornece sinais de ativação que promovem a proliferação das células T e a atividadeantitumoral 11.

As células CIK são uma população heterogênea de linfócitos T ativados que adquirem expressão de CD56 durante a expansão ex vivo a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou do sangue do cordão umbilical (UCB)12. Essa expansão envolve estimulação com Interferon-γ (IFN-γ), anticorpo monoclonal anti-CD3 e Interleucina-2 (IL-2), seguida de cultura em IL-2 por 14 dias. As células CIK funcionalmente se assemelham tanto às células NK quanto às células T, exercendo atividade antitumoral por meio de mecanismos independentes e dependentes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e dependentes 13,14,15,16. Essas propriedades permitem que as células CIK sejam usadas tanto em ambientes terapêuticos alogênicos quanto autólogos, com risco mínimo de doença enxerto-versus-hospedeiro (GvHD) 17.

Na prática clínica, tanto as terapias celulares CAR-T quanto CIK exigem a administração de grandes quantidades de células. As células CAR-T são infundidas em 50 a 200 milhões de doses porpaciente 18. De forma semelhante, as células CIK são tipicamente administradas em doses de até 10 bilhões de células por infusão, com pacientes frequentemente recebendo múltiplas infusões dependendo do protocolode tratamento 19. Métodos tradicionais de cultura celular usando frascos ou placas são ineficientes, demorados e exigem passagem frequente, tornando a expansão em larga escala inviável e aumentando o risco de contaminação. Sistemas automatizados ou semi-automatizados usando culturas em sacos ou biorreatores permitem expansão em larga escala, mas apresentam limitações, ou seja, tensão de cisalhamento ou necessidade de ajustes de densidade e perfusão frequente de meio20,21, além do manuseio de um lote por vez, levando a altos custos tanto em contextos acadêmicos quanto industriais. Nessa situação desafiadora, uma alternativa é representada pelo dispositivo de expansão rápida permeável a gases (G-Rex), um método de cultura estática com membrana de silício no fundo do poço, que garante uma troca eficiente de oxigênio e maior altura dos vasos, permitindo a capacidade de médios de alto volume. Assim, o sistema suporta o crescimento celular sem substituição do meio ou ajustede densidade 22,23. Os sistemas G-Rex-M demonstraram escalabilidade de até 5000 mL e são compatíveis com sistemas automatizados de colheita, fornecendo uma plataforma de cultura fechada e livre de contaminação, facilmente transferível de ambientes acadêmicos para clínicos para o desenvolvimento de produtos medicinais de terapia avançada (ATMPs)24.

No procedimento descrito, aproveitamos as vantagens e características dos dispositivos G-Rex para otimizar o protocolo de expansão tanto das células CAR-T quanto CIK. Demonstramos que ambos os tipos celulares podem ser expandidos e ampliados de forma eficiente, mantendo um fenótipo e perfil funcional consistentes entre diferentes sistemas de cultura. Uma visão geral esquemática do protocolo de expansão tanto para células CIK quanto CAR-T é mostrada na Figura 1.

Figura 1
Figura 1: Visão geral dos protocolos de expansão celular CAR-T e CIK usando dispositivos de cultura G-24 ou G-6M. As células CAR-T e CIK são expandidas a partir de PBMCs isolados a partir do Dia 0. Para a expansão das células CAR-T, as PBMCs são estimuladas no dia 1 com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, geneticamente modificadas no dia 2 e, posteriormente, cultivadas com suplementação de hIL-7 e hIL-15 a cada 3-4 dias, com colheita final para ensaios funcionais no dia 9. No formato G-6M, a suplementação com citocinas é limitada ao segundo dia, sem necessidade de alimentação adicional de citocinas durante todo o período de cultivo. Para a expansão das células CIK, as PBMCs são estimuladas no dia 1 com rhIFN-γ e no dia 2 com anticorpos anti-CD3 e rhIL-2, que são então administradas a cada 3-4 dias. No G-24, uma mudança de médio é necessária simultaneamente com o suplemento de citocinas. As células CIK são coletadas no Dia 14 para ensaios funcionais posteriores. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocolo

Casacos buffy anonimizados de doadores saudáveis previamente testados para ausência de contaminação por patógenos (por exemplo, HIV, HCV, HBV, sífilis) foram obtidos no Banco de Sangue do Hospital de Pádua antes de consentimento escrito e informado. Amostras de sangue foram manipuladas dentro de armários certificados de biossegurança, e o pessoal usou o Equipamento de Proteção Individual (EPI) apropriado.

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo vetores lentivirais foram realizados sob condições de Nível de BioSegurança 2 (BSL-2), conforme as diretrizes institucionais. O manuseio do vetor lentiviral requer precauções adicionais, incluindo dupla luva. Resíduos bioperigosos (incluindo materiais virais, células transduzidas e amostras derivadas de humanos) eram autoclavados antes da eliminação, enquanto resíduos químicos (incluindo corantes fluorescentes e reagentes) exigiam segregação de acordo com protocolos institucionais de resíduos perigosos. Note que os requisitos específicos de biossegurança podem variar entre as instituições e devem ser verificados antes da implementação do protocolo.

1. Isolamento dos PBMCs

  1. Isole PBMCs de pelagem buffy saudável de doador ou amostras de sangue periférico por centrifugação com gradiente de densidade. Dilua a camada buffy com um volume igual de soro tampão de fosfato estéril 1x (PBS) e cuidadosamente sobreponha o sangue diluído sobre o mesmo volume de Lymphoprep em um tubo cônico de 50 mL. Diluição com 1x PBS não é necessária para sangue periférico. Centrifuge a 400 x g por 20 minutos em temperatura ambiente, sem freio.
  2. Após a centrifugação, recolha a camada de PBMCs na interface plasma-Lymphoprep e lave-a com PBS 1x estéril. Centrifugar e ressuspender PBMCs em meio de cultura celular hematopoiética (CM) suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina (doravante cCM). Avalie a contagem e a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão Trypan Blue.

2. Expansão das células CAR-T a partir de PBMCs em vasos de cultura G-24

  1. Ativação dos PBMCs (Dia 0)
    1. Ressuspender 2 x 106 PBMCs recém-isolados em 2 mL de cCM suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) (doravante cCM-F), resultando em uma densidade final de semeadura de 1 x 106 PBMCs/cm2/mL, e transferência para um poço de um vaso de cultura G-Rex (G-24) com 24 poços. Semeie o maior número possível de poços quantas as diferentes condições de transdução devem ser realizadas no Dia 1 (Passo 2.2 - Dia 1).
    2. Adicione 4 μl de anticorpos anti-CD3 (grau funcional puro, concentração final: 0,2 μg/mL) e 20 μl de anti-CD28 (grau funcional puro, concentração final: 1 μg/mL) diretamente em cada poço para ativar células T. Cultivar células em incubadora umidificada mantidas a 37 °C, 5% de CO2.
  2. Transdução de células T com vetores lentivirais (Dia 1)
    1. Após a estimulação durante a noite, colhe e conte as células T ativadas usando o ensaio de exclusão Trypan Blue para avaliar a viabilidade. Calcule 1 x 106 de células ativadas viáveis para cada poço de G-24 (área do poço de 2cm 2), correspondendo a uma densidade de semeadura de 0,5 x 106 células/cm². Transfira as células em um tubo e centrifuge a 300 x g por 5 minutos.
    2. Prepare o meio de transdução para cada poço combinando o volume vetorial lentiviral apropriado, com base na concentração (TU/mL) da preparação do vetor lentiviral (aqui, lentivírus CD19-CAR-BBζ obtido do Hospital de Pesquisa InfantilSt. Jude 25; multiplicidade de infecção (MOI) 20), com 5 μl do potenciador de transdução protamina sulfato (solução de estoque de 8 mg/mL é obtida dissolvendo sulfato de protamina em 1x PBS e filtrada estéril usando filtro de 0,2 μm; concentração final de 50 μg/mL). Use meio CM suplementado com 5% de FBS sem a adição de penicilina/estreptomicina para atingir um volume final de 0,8 mL/poço (0,4 mL/cm²). Para o controle não transduzido (UTD), prepare o meio de transdução descrito evitando a adição do vetor lentiviral.
    3. Resuspenda as células em pellets (passo 2.2.1) em 0,8 mL/poço de meio de transdução e place-as em um novo poço G-24. Incube durante a noite a 37 °C, 5% de CO2.
      NOTA: Se a transdução de múltiplos poços com o mesmo vetor lentiviral estiver planejada, prepare uma mistura mestre do meio de transdução contendo o vírus e sulfato de protamina na concentração desejada. Misture bem para garantir homogeneidade. Depois, aliquota 0,8 mL dessa mistura master em cada tubo de células em pellets para garantir condições de transdução consistentes em todas as amostras.
  3. Cultura e expansão das células CAR-T (Dia 2 ao Dia 9)
    1. No segundo dia, aumente o volume de cultivo para um volume final de 8 mL/poço adicionando 7,2 mL de cCM-F fresco, suplementado com Interleucina-7 humana (hIL-7) e Interleucina-15 humana (hIL-15) a uma concentração final de 10 ng/mL cada (volume de citocinas calculado considerando um volume total de 8 mL por poço).
    2. No 5º dia, refresque o meio de cultivo removendo cuidadosamente 6 mL de meio condicionado de cada poço sem perturbar as células no fundo do poço e substituindo-os por 6 mL de cCM-F fresco suplementado com hIL-7 e hIL-15 (concentração final: 10 ng/mL calculada considerando um volume total de 8 mL por poço). Se estiver trabalhando com múltiplos poços, prepare uma mistura mestre de meios cCM-F suplementados com citocinas hIL-7 e hIL-15 para garantir uma distribuição uniforme das citocinas.
    3. No 9º dia, as células CAR-T são eficientemente expandidas e prontas para aplicações posteriores. Para coletar as células CAR-T, remova e descarte suavemente 5 mL de meio condicionado. Usando uma pipeta de 1000 μL, ressuspenda as células CAR-T nos 3 mL restantes de meio e mova-as para um tubo de 15 mL. Conte as células CAR-T e verifique sua viabilidade usando o ensaio de exclusão Trippan Blue. Normalmente, cerca de 3 x 10 célulasCAR-T 7 (3,24 ± 1,67 x10 células 7) são obtidas de cada poço G-24 (Tabela Suplementar 1).

3. Expansão CIK em vasos de cultura G-24

  1. Ativação dos PBMCs (Dia 0)
    1. Semente 1 x 106 PBMCs recém-isolados para cada poço de um vaso de cultura G-24, o que corresponde a uma densidade de 0,5 x 106/cm2, em 8 mL de cCM suplementado com Interferon-γ humano recombinante (rhIFN-γ, concentração final: 1000 IU/mL). Incube as células a 37 °C, 5% de CO2.
  2. Estimulação e expansão das células CIK (Dia 1 a Dia 14)
    1. No dia 1, 22-24 horas após a estimulação com rhIFNγ, adicione diretamente a cada poço 4 μL de anticorpo anti-CD3 (concentração final: 50 ng/mL) e 4 μL de interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2, concentração final: 500 IU/mL). Incube as células a 37 °C, 5% de CO2.
    2. A cada 3 a 4 dias (nos dias 5, 9 e 12 de cultura celular), substitua 6 mL de meio condicionado por cCM e rhIL-2 frescos (concentração final: 500 IU/mL), calculando a concentração final de rhIL-2 em relação ao volume total de 8 mL.
    3. No dia 14, colhe células CIK descartando 5 mL de meio condicionado e resuspendendo-as nos 3 mL restantes de meio condicionado. Transfira células para um tubo de 15 mL e avalie o número total de células e a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão Trypan Blue. Normalmente, cerca de 8 x 10 célulasCIK de 7 unidades (8,6 ± 4,58 x10 células 7) são obtidas de cada poço (Tabela Suplementar 2).
      NOTA: Durante as mudanças no meio, aspire cuidadosamente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a população da camada celular ou entrar em contato com a membrana permeável a gases. Danos à membrana podem prejudicar a troca gasosa e afetar negativamente a viabilidade celular.

4. Fabricação em grande escala de células CAR-T e CIK

NOTA: Os protocolos de expansão de células CAR-T e CIK descritos nas Seções 2 e 3 podem ser facilmente escalados para dispositivos maiores de cultura G-Rex, nomeadamente o formato G-6M. Ao transitar do formato G-24 (área de superfície: 2cm 2) para o dispositivo G-6M (área de superfície: 10cm 2), todas as concentrações e densidades são mantidas constantes, enquanto todos os volumes e quantidades absolutas são proporcionalmente aumentados por um fator de 5 vezes para corresponder ao aumento da área de superfície. Isso significa que a densidade de semeadura celular, as concentrações de suplementação de meio e as concentrações de citocinas permanecem inalteradas, mas os volumes totais de meio, o número de células semeadas e as quantidades absolutas de citocinas adicionadas serão escalados proporcionalmente. Essa característica de escalabilidade permite uma transição suave de protocolos de pesquisa em pequena escala para a fabricação pré-clínica ou clínica inicial, sem exigir modificações significativas no protocolo, mantendo assim características consistentes das células efetoras.

  1. Expansão das células CAR-T em dispositivos no formato G-6M
    1. Realize a ativação dos PBMCs no Dia 0 e a transdução lentiviral no Dia 1, conforme descrito na Seção 1, mantendo todas as concentrações e densidades enquanto aumenta volumes e quantidades absolutas por um fator de 5 vezes.
    2. No segundo dia, eleve o volume de cultura para um total de 100 mL usando meio cCM-F. Calcule e adicione hIL-7 e hIL-15 para alcançar a concentração final de 10 ng/mL de acordo.
      NOTA: Diferentemente do formato G-24, o design mais alto do dispositivo G-6M permite um volume médio maior, possibilitando um suprimento constante de nutrientes e citocinas durante todo o período de cultivo sem a necessidade de substituição do meio (abordagem "Preencher e Esquecer"). Portanto, não são necessárias citocinas adicionais no quinto dia.
    3. Para coletar células CAR-T no 9º dia, descarte cerca de 90 mL de meio de cada poço usando uma pipeta sorológica e ressuspenda as células nos restantes 10 mL. Transfira as células para um tubo de 15 mL e use-as para ensaios subsequentes.
  2. Expansão das células CIK em dispositivos do formato G-6M
    1. Realize a seed dos PBMCs no Dia 0 seguindo o protocolo descrito na Seção 3 e aumente todos os volumes e reagentes por um fator de 5 vezes para corresponder ao formato maior do dispositivo (G-6M).
    2. No Dia 1, ajuste o volume da cultura para um total de 100 mL com meio cCM. Adicione uma concentração final de 500 IU/mL rhIL-2 e 50 ng/mL anti-CD3 em cada poço.
    3. Suplemente 500 IU/mL de rhIL-2 a cada 3-4 dias (dias 5, 9 e 13) em cada poço sem trocar o médio.
    4. Colhe as células CIK no dia 14 removendo cerca de 90 mL de meio de cada poço com uma pipeta sorológica. Resuspenda as células dos 10 mL restantes, mova-as para um tubo de 15 mL e utilize-as para ensaios subsequentes.

5. Caracterização do fenótipo de células efetoras por citometria de fluxo

NOTA: Ao final do protocolo de expansão, a análise de marcadores de superfície por citometria de fluxo é realizada em células CAR-T e CIK para avaliar seu fenótipo, incluindo estados de diferenciação distintos, ou seja, Naïve (CD45RA+CD62L+), Memória Central (CM, CD45RA-CD62L+), Memória Efetora (EM, CD45RA-CD62L-) e Memória Efetora CD45RA-positiva (EMRA, CD45RA+CD62L-; Figura suplementar 1A-B).

  1. Colete 3 x 10 célulasde 5 para cada tubo de coloração. Lave as células em 1x PBS com 1% de FBS (PBS-F), centrifuge a 300 x g por 5 minutos e ressuspenda o pellet celular em 50 μL de solução de mistura de anticorpos preparada em tampão de coloração (1 parte de tampão Brilliant e 1 parte de PBS-F) de acordo com o painel de coloração desejado (Tabela 1 e Tabela 2).
  2. Incube as células por 20 minutos a 4 °C protegidas da luz, depois lave as células manchadas e faça a centrífuga. Se for necessário um segundo passo de coloração, realize-a com a mistura específica de anticorpos, conforme descrito anteriormente (passo 5.1).
  3. Por fim, lave as células e tinga com um corante de viabilidade, aqui Fixable Viability Stain 780 (FVS780), em 50 μL de 1x PBS, incubando por 15 minutos a 4 °C protegido da luz. Não é necessário um passo de lavagem após a coloração de viabilidade. Após a incubação, adicione 200 μL de 1x PBS a cada amostra e prossiga com a aquisição citométrica em fluxo. A estratégia detalhada de barragem é mostrada na Figura Suplementar 1A-B.
AlvoCloneFluorochromeConcentração/DiluiçãoPropósito
Primeira etapa de tingimentorhCD19-Ele//2 μg/mLDetecção de moléculas CAR
Incubação a 4 °C por 20 minutos
Etapa de lavagem
Segunda etapa de tingimentoDeleGG11-8F3.5.1PE1/50Detecção de moléculas CAR
CD3UCHT1BV5101/40Linhagem
CD4SK3BV6501/40Linhagem
CD8RPA-T8BV4211/20Linhagem
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Maturação
CD62LDREG-56FITC1/10Localização, ativação
Incubação a 4 °C por 20 minutos
Etapa de lavagem
Terceira etapa de coloraçãoFVS780//1/5000Discriminação entre células vivas/mortas
Incubação a 4 °C por 15 minutos

Tabela 1: Painel de anticorpos usado para coloração de células CAR-T. Painel de coloração usado para avaliar a expressão de CAR, fenótipo das células T e status de diferenciação. Clones de anticorpos, concentração e fluorocromo conjugado para cada alvo de interesse são relatados.

AlvoCloneFluorochromeDiluiçãoPropósito
Primeira etapa de tingimentoCD56HCD56PE1/40Linhagem
NKG2D1D11APC1/83Ativação
CD3UCHT1BV5101/40Linhagem
CD4SK3BV6501/40Linhagem
CD8RPA-T8BV4211/20Linhagem
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Maturação
CD62LDREG-56FITC1/10Localização, ativação
Incubação a 4 °C por 20 minutos
Etapa de lavagem
Segunda etapa de tingimentoFVS780//1/5000Discriminação entre células vivas/mortas
Incubação a 4 °C por 15 minutos

Tabela 2: Painel de anticorpos usado para coloração de células CIK. Painel de coloração usado para avaliar subpopulações CIK, fenótipo e status de diferenciação. Clones de anticorpos, concentração e fluorocromo conjugado para cada alvo de interesse são relatados.

6. Avaliação da atividade citotóxica específica das células CAR-T e CIK

NOTA: A atividade citotóxica das células CAR-T e CIK é medida co-cultivando-as com células-alvo na proporção desejada efetor-alvo (E:T). O tipo de ensaio depende do tipo de células-alvo, sejam elas derivadas de tumores sólidos ou malignidades hematológicas. Neste protocolo, descrevemos um ensaio de citometria de fluxo baseado em corantes fluorescentes para células em suspensão e um ensaio de Análise de Células em Tempo Real (RTCA) baseado em impedância para células aderentes.

  1. Ensaio de citometria de fluxo à base de corantes em células fluorescentes
    NOTA: A citotoxicidade específica de antígeno contra malignidades hematológicas pode ser avaliada usando um ensaio de citometria de fluxo baseado em corantes fluorescentes. Antes da co-cultura, as células-alvo são marcadas com um corante fluorescente para possibilitar sua identificação. Após a co-cultura com células efetoras, a morte celular alvo é avaliada por coloração com um corante de viabilidade. A análise citométrica em fluxo permite quantificar a morte específica do antígeno, com base na proporção de células fluorescentes positivas para corantes não viáveis.
    1. Para cada condição de cocultura, colete 2 x 10células-alvo de 5 e as ressuspenda em 400 μL de meio de cultura completo para alcançar uma concentração final de 5 x10 células de 5 células/mL. Adicione corante fluorescente em concentração final de 5 μM (aqui Cell Trace Violet dye, CTV). Incube por 30 minutos a 37 °C, protegido da luz. Após a incubação, lave as células uma vez com meio completo e ressuspenda o pellet em uma concentração final de 4 x 105 células/mL.
    2. Dispense 500 μL da suspensão da célula alvo corada (aqui 2 x 105 de células Raji como modelo de célula alvo de suspensão CD19+ ) em tubos limpos de 5 mL conforme a configuração experimental. Confirme a coloração bem-sucedida por citometria de fluxo identificando células-alvo como células positivas ao corante fluorescente (SSC-A versus CTV). Cerca de 98% das células fluorescentes positivas para corantes são recomendadas.
    3. Paralelamente, conte e prepare células efetoras (aqui 5 x 106 de células CAR-T CD19) para cada condição de cocultura. Lave as células e resuspenda-as em meio de cultura completo na concentração apropriada para igualar a relação efetor-alvo (E:T) desejada. Adicione 500 μL da suspensão da célula efetora a cada tubo correspondente contendo células-alvo.
      1. Para alcançar uma relação E:T de 25:1, adicione 5 células CAR-T CD19de 10 6 efetores a 2 células-alvode 5 Raji em cada tubo, e prepare tantos tubos quanto necessário pelo desenho experimental.
    4. Incube as coculturas por 6 horas a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Inclua uma condição controle contendo apenas células-alvo para medir a morte celular espontânea. Esse controle é importante para distinguir a morte de fundo da citotoxicidade específica da célula efetora.
    5. Lave as células co-cultivadas e as tinga com o corante vitalidade FVS780 diluído em 1x PBS (diluição final 1:5000). Incube por 15 minutos a 4 °C, protegido da luz. Lave as células e ressuspenda o último pellet celular em 600 μL de tampão PBS-F. Prossiga com a aquisição de citometria de fluxo para avaliar a citotoxicidade específica da célula efetora.
      1. Realize a estratégia de gate do citômetro de fluxo da seguinte forma: identificar células-alvo como células positivas para o corante fluorescente (SSC-A versus CTV) e, dentro dessa população, calcular a porcentagem de células-alvo mortas (SSC-A versus FVS780, Figura Suplementar 1C). Calcule a Lise Específica subtraindo a morte celular espontânea alvo (%FVS780+ dentro do CTV+ na condição apenas alvo) da citotoxicidade específica da célula efetora (%FVS780+ dentro do CTV+ na condição de cocultura efetor-alvo).
  2. Ensaio de análise celular em tempo real (RTCA)
    NOTA: O ensaio RTCA é um método para avaliar a atividade citotóxica das células efetoras contra células-alvoaderentes 26. A morte da célula alvo é detectada como uma diferença no sinal de impedância devido ao descolamento das células do poço da placa E engajadas no dispositivo xCELLigence. Realize o ensaio RTCA seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante para garantir desempenho e reprodutibilidade ideais do ensaio.
    1. Subcultura as células alvo um dia antes do ensaio (Dia -1) para garantir que atinjam 60%-80% de confluência até o Dia 0. Essa etapa é fundamental para manter as células em proliferação ativa no início do experimento. É preferível usar células-alvo entre as passagens 5-20, com um mínimo de 1 semana (3-4 passagens pós-descongelamento) para garantir o desempenho ideal das células.
    2. No Dia 0, adicione cuidadosamente 50 μL de meio de cultura a cada poço da E-Plate, engate a placa dentro do dispositivo e adquira o sinal de fundo. Depois, transfira a placa de volta para o capuz para a etapa de semeadura das células.
    3. Conte as células-alvo e transfira o número total necessário para um tubo limpo. Resuspenda as células em um volume apropriado de meio de cultivo para alcançar a concentração desejada para a semeadura na E-Plate, e transfira 100 μL de células-alvo para cada poço (aqui 4 x 104 de células MCF-7 como modelo de linha celular tumoral aderente). Mantenha a placa dentro do capô em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos para garantir a fixação uniforme das células-alvo. Engate a placa dentro do dispositivo a 37 °C em uma incubadora deCO2 e inicie a aquisição em tempo real (intervalo de aquisição de 15 min por 22 horas).
      NOTA: Realize a titulação da célula alvo antes de usar uma nova linhagem celular alvo, conforme sugerido pelo fabricante.
    4. No primeiro dia (cerca de 20-22 h após o semeadura da célula alvo), conte as células efetoras e resuspenda-as em meio de cultivo fresco, ajustando a concentração celular para alcançar a relação efetor-alvo (E:T) desejada. Por exemplo, para alcançar uma relação E:T de 10:1, adicione 4 células CIK de5 efetores a 4 células-alvo de 4 x 10de 4 MCF-7 para cada poço.
    5. Prepare cada condição de tratamento em duplicados técnicos usando uma placa estéril de fundo em U de 96 poços e equilibre-a por 15 minutos a 37°C. Dispense 50 μL da suspensão da célula efetora para cada condição usando uma pipeta multicanal. Coloque a placa E de volta no instrumento e continue a aquisição em tempo real (intervalo de aquisição de 15 min por 24 horas). Calcule a Lise Específica usando a seguinte equação:
      Equação 1

Resultados

O protocolo descrito aqui fornece um fluxo de trabalho eficiente e robusto para a expansão e engenharia ex vivo de células efetoras a partir de PBMCs isoladas, nomeadamente células CAR-T e CIK. Esse método requer manipulação celular mínima e aproveita a capacidade de troca gasosa dos dispositivos G-Rex, proporcionando uma disponibilidade de nutrientes e oxigenação superiores em comparação com sistemas convencionais de cultura estática23,24. Uma vantagem chave deste protocolo é sua escalabilidade inerente, desde dispositivos de pequena escala de 24 poços (G-24), adequados para estudos pré-clínicos, até dispositivos maiores de 6M (G-6M), compatíveis com necessidades de fabricação translacional ou clínica, sem exigir alterações no protocolo além da escalonamento proporcional.

Usando esse protocolo, tanto as células CAR-T quanto CIK foram expandidas com sucesso em paralelo a partir de PBMCs doadores saudáveis nos formatos G-24 e G-6M, conforme descrito nas Seções 2-4. Ao final do período de cultivo, ambos os tipos celulares apresentaram alta expansão de dobras e viabilidade, com proliferação comparável entre os dois formatos de dispositivos (Figura 2, Tabela Suplementar 1, Tabela Suplementar 2), destacando a reprodutibilidade do protocolo em diferentes escalas de cultura.

Para validar a escalabilidade dos dispositivos de cultura, células efetoras foram caracterizadas fenotipicamente e funcionalmente. Para as células CAR-T CD19, quantificamos a expressão de CAR e avaliamos os subconjuntos CD4+ e CD8+, observando a predominância das células T CD19 CAR+ CD8+ (Figura 3A-B, Tabela Suplementar 1). Para as células CIK, avaliamos a frequência das populações T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) e CIK (CD3+CD56+) (Figura 3D), bem como a expressão do receptor ativador NKG2D (Figura 3E, Tabela Suplementar 2). Além disso, observamos fenótipos e expressão globalmente comparáveis de marcadores populacionais específicos entre os formatos de cultura G-24 e G-6M tanto para células CAR-T quanto CIK. O status de diferenciação dos produtos celulares CD19 CAR-T e CIK foi analisado por coloração CD62L e CD45RA (Figura 3C-F, Tabela Suplementar 1, Tabela Suplementar 2), revelando fenótipos semelhantes de memória e efetores entre células cultivadas nos formatos G-24 e G-6M. Esses achados demonstram que ampliar o processo não compromete a integridade fenotípica ou o status de diferenciação das populações celulares efetoras expandidas.

Por fim, para avaliar a potência funcional, utilizamos ensaios de citotoxicidade específicos do alvo. Tanto as células CD19 CAR-T quanto CIK expandidas em qualquer um dos dispositivos apresentaram atividade citolítica potente, confirmando a manutenção das propriedades funcionais em toda a escala (Figura 4). No geral, esses resultados apoiam a adequação dos produtos expandidos para aplicações posteriores em modelos pré-clínicos e, potencialmente, para testes clínicos.

Figura 2
Figura 2: Proliferação e viabilidade das células CAR-T e CIK CD19. As células CAR-T (n = 5) e células CIK (n = 6) expandidas a partir de PBMCs nas placas G-24 e G-6M foram coletadas nos dias 9 e 14 de expansão, respectivamente, para realizar a contagem celular e avaliação do aumento de dobras (A-C) e do percentual (B-D) de células viáveis. Histogramas representam a expressão média ± desvio padrão (DS), e pontos indicam doadores únicos (veja a Tabela Suplementar 1 e a Tabela Suplementar 2 para valores individuais). Os dados foram analisados pelo teste t pareado múltiplo de duas caudas (A-C) ou pelo teste de classificação de pareamento de pareamento de Wilcoxon de duas caudas múltiplas (B-D), com correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas (*p < 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3
Figura 3: Avaliação do fenótipo das células CAR-T e CIK CD19 expandida em dispositivos G-24 e G-6M. A expressão das moléculas de CAR em células CAR-T CD19 (n = 5) foi analisada por citometria de fluxo para avaliar (A) a eficiência de transdução nos protocolos de expansão G-24 e G-6M, bem como a expressão de subpopulações (B) CD4+/CD8+ e (C) naïve/memória no subconjunto CD3+CAR+. O fenótipo das células CIK em massa (n = 6) foi analisado por citometria de fluxo para investigar (D) a porcentagem de CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) e T (CD3+CD56-), bem como a expressão de (E) NKG2D e (F) subpopulação naïve/memória no subconjunto CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). Naïve (CD45RA+CD62L+), Memória Central (CM, CD45RA-CD62L+), Memória Efetora (EM, CD45RA-CD62L-) e Memória Efetora CD45RA-positiva (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogramas representam a expressão média ± SD, e os pontos indicam doadores únicos (veja a Tabela Suplementar 1 e a Tabela Suplementar 2 para valores individuais). Os dados foram analisados pelo teste t pareado múltiplo de duas caudas (B-C-D-F) ou teste de rank pareado de Wilcoxon de duas caudas (A-E), com correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas (*p < 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4
Figura 4: Avaliação da citotoxicidade das células CAR-T e CIK CD19. (A) A lise específica das células CAR-T CD19 (laranja, n = 5) ou das células não transduzidas (UTD) (cinzas, n = 5) contra a linha celular Raji do linfoma de Burkitt (como modelo de linha celular em suspensão) foi realizada por ensaio de morte baseado em citometria de fluxo de 6 horas. Os resultados são mostrados como a lise específica média ± SD. (B) Citotoxicidade das células CIK cultivadas em G-24 (azul claro, n = 7) ou G-6M (azul escuro, n=6) contra a linha celular MCF-7 do câncer de mama (como modelo de linha celular aderente) foi monitorada a cada 15 minutos durante 24 horas usando um analisador celular em tempo real. Os resultados são apresentados como a lise específica média ± SEM. Os dados foram analisados pelo teste de Mann-Whitney, correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas (*p < 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Estratégia de gating usada para análises de citometria de fluxo. Gráficos representativos ilustrando as estratégias de acesso para (A) a caracterização fenotípica das células CAR-T e (B) células CIK, e (C) o ensaio de citotoxicidade baseado em corantes fluorescentes. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Crescimento, viabilidade e fenótipo de culturas de células CAR-T CD19 de doadores individuais. Número total de células, aumento de dobra, viabilidade e caracterização fenotípica das células T CD19-CAR colhidas no 9º dia de cultivo em dispositivos G-24 e G-6M são mostrados para cada doador. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Crescimento, viabilidade e fenótipo de culturas celulares CIK de doadores individuais. O número total de células, aumento de dobra, viabilidade e caracterização fenotípica das células CIK colhidas no 14º dia de cultivo em dispositivos G-24 e G-6M são mostrados para cada doador. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo descreve a implementação de uma plataforma eficiente e escalável para a geração de dois produtos ACT diferentes, a saber, células CAR-T e CIK, a partir de PBMCs usando sistemas de cultura G-Rex. Implementamos ensaios funcionais e fenotípicos de prova de conceito para validar a escalabilidade da abordagem. Mostramos que tanto o fenótipo quanto a atividade das células expandidas são mantidos durante a ampliação, garantindo a adequação do sistema para aplicações de pesquisa e tradução clínica direta. De fato, demonstramos com sucesso que tanto as células CAR-T quanto CIK podem ser expandidas de forma eficiente com alto rendimento celular, mantendo um fenótipo funcional do efetor e uma citotoxicidade específica de antígeno potente em diferentes dispositivos de cultura.

Combinado com a tecnologia de membrana permeável ao gás dos dispositivos de cultura, esse protocolo de expansão leva a uma cinética de expansão mais rápida, reduz o manuseio manual e permite rendimentos altos e consistentes entre doadores. Essas características tornam o protocolo altamente reprodutível e menos trabalhoso em comparação com os sistemas padrãode cultura 20,21, que frequentemente envolvem múltiplas trocas de meios e maior risco de perda e contaminação celular.

Além disso, esse protocolo permite uma transição fluida entre as escalas de fabricação: de sistemas abertos em pequena escala (G-24, adequado para pesquisa pré-clínica e triagem, por exemplo, de construções CAR, combinações de citocinas ou variabilidade do doador) para sistemas abertos em maior escala (G-6M, para validação pré-GMP) e, por fim, para sistemas fechados em maior escala (para produção de GMP). Como descrito neste estudo, a progressão de sistemas abertos em pequena escala para sistemas abertos em maior escala requer apenas ajustes proporcionais de volumes e entrada de células em relação ao tamanho do dispositivo, o que representa uma vantagem prática significativa. Da mesma forma, a única implementação necessária para a transição de sistemas abertos para fechados para fabricação GMP, e assim para adaptar o protocolo G-6M à produção em larga escala de GMP, é a utilização de reagentes GMP apropriados e dispositivos de sistema fechado (G-10M-CS com área de superfície de 10 cm2, correspondente a um único poço G-6M, ou G-100M-CS com área de superfície de 100 cm², correspondente ao equivalente aberto G-100M) sem qualquer modificação adicional do protocolo em si. Esses dispositivos fechados diferem de seus equivalentes abertos pela integração de conexões de tubos estéreis para manuseio automatizado de mídia, que funcionam em conjunto com uma bomba de manuseio de líquidos (GatheRex) para criar um ambiente totalmente fechado. Essa abordagem de sistema fechado elimina trocas manuais de mídia e reduz riscos de contaminação, tornando-a ideal para ambientes de manufatura em conformidade com GMP, onde esterilidade e reprodutibilidade são fundamentais. Notavelmente, a escalabilidade representa uma característica crítica para preencher a lacuna entre a descoberta em estágio inicial e a tradução clínica, especialmente em ambientes acadêmicos ou biotecnológicos iniciais com recursos limitados.

A implementação adicional deste protocolo rumo à plena conformidade com GMP deve considerar a transição de mídias contendo FBS para formulações livres de soro/xeno, alinhando-se às tendências regulatórias atuais da FDA e EMA, a fim de eliminar a variabilidade de lote para lote, eliminar potenciais riscos de contaminação xenogênica e aprimorar a conformidaderegulatória 27.

Além disso, a intervenção mínima exigida pelo sistema de expansão proposto fornece uma plataforma ideal para implementar o perfil fenotípicomultidimensional 28, reduzindo artefatos induzidos pelo procedimento que podem confundir a análise fenotípica durante os procedimentos de fabricação. Além disso, além das células CAR-T e CIK, o sistema poderia ser altamente adaptável a outras populações de linfócitos e células imunes modificadas, ampliando sua utilidade no desenvolvimento da imunoterapia29,30.

Embora o protocolo seja robusto e não exija modificações, alguns passos são particularmente críticos para o sucesso. Para a expansão das células CIK, o momento da adição de citocinas é essencial para garantir diferenciação e expansão ótimas. Para as células CAR-T, a transdução deve ocorrer 24 horas após a ativação para maximizar a eficiência, e as alíquotas lentivirais devem ser descongeladas apenas uma vez, pois ciclos repetidos de congelamento-descongelamento reduzem significativamente a eficiênciada transdução 31.

A variabilidade biológica entre preparações celulares primárias contribui naturalmente para diferenças nas taxas de expansão e na atividade funcional, refletindo a diversidade dos doadores. Essa variabilidade inevitável e intrínseca pode ser gerenciada de forma eficaz realizando expansões paralelas de múltiplos doadores, garantindo resultados robustos e reprodutíveis entre os experimentos.

Em conclusão, esse protocolo permite uma expansão rápida, escalável e confiável dos linfócitos efetores funcionais diretamente a partir dos PBMCs, oferecendo flexibilidade tanto para pesquisas em fases iniciais quanto para tradução clínica em larga escala. Esse sistema pode ser facilmente adaptado a vários tipos celulares e modificações genéticas, fornecendo uma plataforma versátil para o desenvolvimento da imunoterapia.

Agradecimentos

A construção CAR foi fornecida sob MTA pelo Hospital de Pesquisa Infantil St. Jude. Este trabalho foi apoiado pela ScaleReady G-Rex Grant 2025; Universidade de Pádua - SOMMAGGIO_BIRD24_01; Fundação AIRC sob o programa 5x1000 2019 - ID. 22759; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. Essa pesquisa recebeu financiamento "Ricerca Corrente" do Ministério da Saúde da Itália para cobrir os custos de publicação. As figuras foram criadas com o software GraphPad Prism 9 e BioRender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Brilhante Amortecedor de ManchaBD em Biociências566349
Anticorpo CD28, anti-humanoMiltenyi Biotech130-093-375Clone 15E8
Anticorpo CD3, anti-humanoMiltenyi Biotech130-093-387Clone OKT3
CD3 BV510BD em Biociências740147Clone UCHT1
CD314 APC (NKG2D)Biolenda320808Clone 1D11
CD4 BV650BD em Biociências563875Clone SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD em Biociências563429Clone HI100
CD56 PEBiolenda318306Clone HCD56
CD62L FITCBD em Biociências555543Clone FREG-56
CD8 BV450BD em Biociências562428Clone RPA-T8
Kit de Proliferação de Células Violetas CellTraceThermoFisher científicoC34557
Dimetil sulfóxido (DMSO)ThermoFisher científicoD2650
Dulbecco & prime; s Soro Tamponado com Fosfato (D-PBS)Sigma AldrichD5652
E-plate 16Agilent5469813001
Soro Bovino Fetal (FBS), ValorThermoFisher ScientificA5256701
Stain Viability Fixável 780 (FVS780)BD em Biociências565388
Placa de 24 Poços do G-Rex Wilson Wolf80192M
Placa de Poço G-Rex 6M  Wilson Wolf80660M
Solução de Buffer HEPESLonzaECM0180D
Seu AnticorpoMiltenyi Biotech130-120-718
Albumina Humana 20%CSL Behring
Proteína Recombinante IL-15 HumanaPeproTech200-15
Proteína recombinante IL-7 humanaPeproTech200-07
LSRFortessa X-20BD em Biociências
LymphoprepTecnologias STEMCELL18060
MCF-7ATCCHTB-22Linha celular de câncer de mama  
Penicilina e estreptomicinaLonzaECB3001D
Solução fisiológica (0,9% de cloreto de sódio)Monico
Sulfato de ProtaminaSigma AldrichP3369
RajiATCCCCL-86Linha celular de linfoma de Burkitt  
IFN-gama humana recombinanteR& Sistemas D285-SE-100/CF
IL-2 recombinante (Proleucina)Novartis
rhCD19-EleInvitrogenA42607
Instituto Memorial Roswell Park 1640 (RPMI-1640)EurocloneECB9006L
L-Glutamina EstávelLonzaECB3004D
Solução Trypan-BlueSigma AldrichT8154
Análise de Células em Tempo Real xCELLigenceAgilent
Meio Celular Hematopoiético Livre de Soro X-VIVO 15Lonza02-053Q

Referências

  1. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  2. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  3. Cappuzzello, E., et al. How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits. Front Immunol. 14, 1229540(2023).
  4. Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. 30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective. J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).
  5. Bayatipoor, H., et al. Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed. Med Oncol. 40, 29(2022).
  6. Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. Cancer immunotherapy by γδ T cells. Science. 386, 6717(2024).
  7. Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option. J Immunother Cancer. 6, 102(2018).
  8. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  9. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).
  10. Zhang, J., Wang, L. The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review. Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).
  11. Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  12. Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells. Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).
  13. Palmerini, P., et al. A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks. Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).
  14. Pietà, A. D., et al. Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells. J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).
  15. Pievani, A., et al. Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity. Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).
  16. Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies. OncoImmunology. 5, e1199311(2016).
  17. Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells. Front Immunol. 15, 1459175(2024).
  18. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).
  19. Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).
  20. Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy. J Biol Eng. 15, 13(2021).
  21. Smith, T. A. CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25. Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).
  22. Ludwig, J., Hirschel, M. Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform. Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).
  23. Vera, J. F., et al. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J Immunother. 33, 305-315 (2010).
  24. Bajgain, P., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex "M" series. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).
  25. Talleur, A. C., et al. Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy. Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).
  26. Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system. J Vis Exp. (66), e3683(2012).
  27. Eberhardt, F., et al. Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells. Int J Mol Med. 52, 58(2023).
  28. Cadiñanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).
  29. Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor. Front Immunol. 15, 1412378(2024).
  30. Noldner, P. K., et al. Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing. Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).
  31. Bandeira, V., et al. Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks. Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).

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