Artigo de método

Localização da membrana plasmática e dos receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal usando imagem quantitativa em células de mamíferos

DOI:

10.3791/69371

⸱

19 de dezembro de 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

Neste artigo

Resumo

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Esse protocolo descreve a expressão e quantificação das subunidades neuronais dos receptores nicotínicos de acetilcolina usando a linha celular Neuro-2a de mamíferos. Marcadores fluorescentes sensíveis ao pH e microscopia confocal permitem a avaliação precisa da localização dos receptores na membrana plasmática versus aqueles expressos em compartimentos intracelulares neutros em pH, facilitando o estudo do tráfego e modulação farmacológica do nAChR.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A quantificação dos receptores de acetilcolina nicotínica neuronal (nAChRs) expressos na membrana plasmática de células mamíferas é importante para o desenvolvimento de novas terapias seletivas por alvo e para o estudo de proteínas chaperonas que modulam o tráfego de receptores. Este estudo apresenta um conjunto robusto de metodologias para expressar tanto nAChRs homoméricos quanto heteroméricos em células Neuro2a (N2a) de mamíferos e para quantificar sua localização superficial versus intracelular usando marcadores fluorescentes sensíveis ao pH. pHuji e pHluorina supereclíptica (SEP) são proteínas sensíveis ao pH que podem ser modificadas para marcar proteínas recombinantes, permitindo a visualização da distribuição espacial das subunidades nAChR. Essas etiquetas fluorescentes emitem com pH neutro, mas são temperadas em ambientes ácidos. Para acompanhar a localização relativa interna versus a membrana plasmática das subunidades α7, α4 e β2 de nAChR, tanto pHuji quanto SEP são ligados ao C-terminal de cada construto de DNA. Para expressar α7-pHuji junto com sua chaperona NACHO, ou (α4-SEP; β2-pHuji) em células N2a, é utilizado um reagente de transfecção de DNA à base de lipídios. O reagente de transfecção e o DNA plasmídico são incubados separadamente em meio sérico reduzido em temperatura ambiente, depois combinados para formar complexos de DNA lipídico que facilitam a entrega de plasmídeos nas células. Após a incubação, as células são imagens usando microscopia confocal de células vivas sob condições de pH alto e baixo ou na presença de um ligante fluorescente seletivo para subtipos. As imagens são analisadas usando fluorescência celular total corrigida nos canais fluoróforos relevantes, fornecendo informações quantitativas sobre a distribuição das subunidades nAChR marcadas fluorescentemente entre a membrana plasmática e os compartimentos intracelulares. A imagem confocal de células vivas permite o acompanhamento em tempo real da localização da subunidade nAChR para distinguir diferenças entre populações internas e de receptores de superfície. A forte expressão de membrana plasmática de α7-pHuji ou (α4-SEP; β2-pHuji) é alcançada em 24 horas a 37 °C. Esse método pode ser adaptado para incluir chaperonas adicionais, subunidades auxiliares ou ligantes fluorescentes para o estudo do tráfego de nAChR, modulação farmacológica e alterações relacionadas a doenças na expressão de nAChR.

Introdução

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Os receptores de acetilcolina nicotínica neuronal (nAChRs) são canais iônicos transmembrana dependentes de ligando, expressos na membrana plasmática de muitos tipos celulares, incluindo neurônios, células gliais e células imunes. Esses receptores são compostos por α subunidades (α2-α10) ou β (β2-β4) que se reúnem para formar subtipos homoméricos ou heteroméricos, sendo α7 e α4β2 os nAChRs os mais abundantes nocérebro 1,2. A desregulação desses subtipos tem sido associada à doença de Alzheimer, transtorno de uso de nicotina, epilepsia hipermotora relacionada ao sono, doença de Parkinson e transtorno depressivo major, entre outras condições neurológicas e psiquiátricas 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Métodos rápidos e confiáveis para expressar e quantificar as nAChRs são essenciais para entender os mecanismos da doença e para o desenvolvimento de terapêuticas seletivas por alvo. No entanto, alcançar uma expressão robusta da membrana plasmática desses receptores é frequentemente desafiador e demorado. O método descrito aqui permite uma forte expressão superficial de nAChRs em aproximadamente 24 horas após a transfecção de DNA e pode ser combinado com ligantes ou proteínas chaperonas que modulam o tráfego dos receptores.

Existem várias abordagens para expressar nAChRs, incluindo transfecção transitória de DNA ou geração de linhagens celulares estáveis que expressem o subtipo desejado. Embora criar linhagens celulares estáveis seja útil para estudos de longo prazo envolvendo o mesmo subtipo de receptor, o processo é trabalhoso e pode levar vários meses. Uma vez estabelecidas, tais linhagens celulares podem apresentar expressão variável dos receptores entre as viagens, perda de expressão ao longo do tempo ou viés de seleção para clones com função ou densidade receptorasubótimas 13. Uma redução na temperatura de incubação de 37 °C para 30 °C, a adição de chaperonas moleculares como nicotina, ou o tempo de incubação estendido podem promover a expressão superficial 13,14,15. Essas limitações são particularmente pronunciadas para as nAChRs heteróméricas, que exigem montagem e tráfico adequados de subunidades, e para estudos focados na regulação dos receptores assistidos por chaperona. Portanto, a validação rotineira da expressão de subtipos de receptores através das passagens é necessária ao trabalhar com linhas celulares estáveis que expressam nAChR.

Frequentemente, pesquisadores se interessam por variantes das subunidades nAChR e subunidades de chaperona ou proteínas auxiliares e, portanto, precisam expressar uma variedade de DNAs em rápida sucessão para permitir flexibilidade rápida em seus ensaios. A expressão transitória de nAChRs é vantajosa nesse aspecto porque o processo pode ser concluído rapidamente, permitindo ao pesquisador estudar múltiplos subtipos de receptores ou condições experimentais sem esperar meses para gerar linhagens celulares estáveis. Uma ocorrência comum, mesmo com expressão transitória, é que muitos nAChRs permanecem dentro da célula 24 horas após a indução a 37 °C, exigindo períodos adicionais de incubação de > 48h 16,17. Por exemplo, sem a proteína chaperona resistente a inibidores da colinesterase (RIC)-3, apenas ~1% dos α7 nAChRs são expressos na membrana plasmática das células SHE-P demamíferos 18. Com a co-expressão de RIC-3, aproximadamente 20% dos α7 nAChRs são detectados na superfície. Embora isso represente uma melhora, a abundância total de receptores permanece baixa. A coexpressão de α7 nAChRs com NACHO pode aumentar ainda mais a expressão superficial, embora ainda menos de 40% da população total de receptores seja transferida para amembrana plasmática 19. Outra abordagem envolve incubar células transfectadas a 30 °C para melhorar a expressão da membranaplasmática 20,21. Para α4β2 nAChRs, essa redução de temperatura resulta em uma regulação ascendente de cinco vezes na densidade dos receptores de superfície, sem aumento correspondente na proteína subunitáriatotal 21. No entanto, essa melhoria exige pelo menos um dia adicional e maior uso de consumíveis, reagentes e instrumentação.

O trabalho apresentado oferece um conjunto de métodos otimizados para expressar e quantificar subtipos específicos de nAChR dentro de 24 horas após a transfecção em células N2a de mamíferos, alcançando aproximadamente 83% para α7, 77% para α4 e 56% para subunidades β2 localizadas na membrana plasmática. No caso de α7 nAChRs, a expressão da membrana plasmática pode ser quantificada usando α-bungarotoxina (αBTX) marcada fluorescentemente com α7 ou por marcação fluorescente recombinante. Para marcar cada subunidade, as proteínas fluorescentes sensíveis ao pH pHuji e pHluorina supereclíptica (SEP)22,23,24 são incorporadas no C-terminal das subunidades individuais de nAChR 25,26. pHuji e SEP são variantes sensíveis ao pH das proteínas fluorescentes vermelha e verde, respectivamente, que fluorescem no pH 7,4, mas são temperadas sob condições maisácidas 27,28. Como a fluorescência SEP e pHuji é suprimida no pH < 6, qualquer sinal intracelular observado reflete fluoróforos localizados em compartimentos neutros, em vez de na membrana plasmática. Deve-se notar que alguns organelos, como o aparelho de Golgi, possuem um lúmen ácido; assim, fluoróforos ligados à região C-terminal das subunidades nAChR não são detectados enquanto as subunidades transitam pela viasecretora 29. A diferença entre a fluorescência total no pH 7,5 e a do pH < 6 representa o sinal gerado pelos nAChRs localizados na membrana plasmática. Capturar imagens usando microscopia confocal de célula viva proporciona alta resolução espacial, permitindo quantificar com precisão a localização das subunidades. Além disso, realizar todos os experimentos em células vivas permite que cada célula atue como seu próprio controle, levando em conta a variabilidade na expressão proteica entre as células dentro de cada grupode tratamento 30. Esse método pode ser adaptado para incluir proteínas chaperonas adicionais, como NACHO ou outras, para investigar o tráfego de nAChR. Aplicações adicionais incluem modulação farmacológica, incorporação de subunidades auxiliares e análise de alterações associadas a doenças na expressão de nAChR.

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Protocolo

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NOTA: O procedimento a seguir descreve métodos que foram usados com sucesso para transfectar transitoriamente a linhagem celular N2a com subunidades nAChR (Figura 1). A expressão robusta da membrana plasmática é alcançada em 24 horas, conforme capturado com microscopia confocal de células vivas.

figure-protocol-1
Figura 1: Apresentação esquemática dos métodos individuais apresentados no protocolo. As células são cultivadas até estarem 70%-80% confluentes em placas de imagem. As células são então tratadas com o reagente de transfecção e o complexo de DNA. (Cima) 24 horas depois, as células podem ser tratadas com um ligante marcado fluorescente para marcar subunidades expressas na membrana plasmática e então imagens usando um microscópio confocal. (Embaixo) Alternativamente, para genes de subunidades nAChR que foram modificados para serem marcados com uma proteína sensível ao pH 24 horas após a transfecção, as células podem ser fotografadas vivas usando um microscópio confocal para capturar a fluorescência total das células. O tampão de imagem de pH 7,4 é então alterado para o tampão de tampão de têmpera de pH 5,5. Isso impedirá a fluorescência das proteínas sensíveis ao pH marcadas nas subunidades nAChR localizadas na membrana plasmática da célula, permitindo que apenas as subunidades internas permaneçam fluorescentes. As mesmas células são novamente imagens de imagem. A análise de imagem é realizada usando o ImageJ para quantificar a expressão das subunidades internas e externas. Esses procedimentos podem ser modificados para incorporar chaperona e proteínas auxiliares. Criado no BioRender. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Transfecção transitória N2a nAChR

NOTA: A linhagem celular N2a foi escolhida porque apresenta fenótipo neuronal e baixa expressão endógena de nAChRs. Os genes das subunidades α7-pHuji, α4-SEP e β2-pHuji estão cada um alojados individualmente no vetor de expressão pcDNA3.1(+) dos mamíferos. A proteína chaperona NACHO é expressa a partir de pREP9 (generosamente doada pelo Dr. R. Loring, da Northeastern University). Em todas as etapas, utilize técnicas estéreis e trabalhe dentro de um armário de biossegurança. Use um jaleco limpo, óculos de proteção e luvas. Limpe todos os materiais que entram ou saem do gabinete de biossegurança com etanol 70%. As etapas a seguir descrevem a transfecção em um prato de fundo de vidro revestido com poli-D-lisina de 35 mm, adequado para imagem. Os volumes podem ser ajustados conforme necessário para diferentes vasos de cultura.

  1. Cultive células N2a em um frasco de cultura T25 (ou similar) contendo Meio Essencial Mínimo (EMEM) de Eagle, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e, se necessário, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Incube a 37 °C, 5% de CO₂ até que as células atinjam ~90% de confluência. Visualize usando um objetivo de microscópio óptico 4x.
  2. Monitore a confluência diariamente usando um microscópio óptico e substitua o meio de crescimento a cada 1-2 dias para manter as condições ideais. Quando as células atingem ~90% de confluência, estão prontas para serem encaminhadas para placas de imagem.
  3. Pré-aqueça todos os reagentes a 37 °C em banho-maria. Limpe o gabinete de biossegurança e todos os materiais com etanol a 70% antes de iniciar o procedimento.
    ATENÇÃO: O etanol 70% é um líquido altamente inflamável e vapor que pode causar irritação séria nos olhos. Fique longe de calor, faíscas, chamas abertas e outras fontes de ignição. Armazene em um local bem ventilado com recipientes bem fechados. Use luvas de proteção e proteção para olhos/rosto ao manusear. Em caso de contato com pele ou olhos, enxágue imediatamente com água e procure atendimento médico se a irritação persistir. Um desinfetante alternativo, como uma solução de água sanitária de 5%-10%, pode ser usado em seu lugar.
  4. Aspire o meio antigo do frasco e lave as células com 5 mL de PBS. Adicione 1 mL de tripsina ao frasco e faça girar suavemente. Incube até as células levantarem (<5 min). Para evitar excesso de digestão, adicione imediatamente 4 mL de meio de crescimento EMEM e pipete suavemente para criar uma suspensão unicelular.
  5. Usando um hemocitometro, determine a concentração celular e calcule o volume necessário de meio de crescimento EMEM para ajustar a suspensão de modo que 1 mL contenha 0,5-2 células 10⁵.
  6. Placar 1 mL de suspensão de célula por prato de 35 mm e adicionar meio de crescimento EMEM suficiente para levar o volume total a 2 mL. Incube durante a noite a 37 °C, 5% de CO₂. As células estão prontas para transfecção com 70%-80% de confluência.
  7. No dia da transfecção, pré-aqueça os reagentes a 37 °C, descongele completamente os DNAs das subunidades nAChR e leve o reagente de transfecção à temperatura ambiente. Limpe todos os reagentes com etanol a 70% antes de colocá-los no armário de biossegurança.
  8. Para expressar α7 nAChRs: Em um tubo de microcentrífuga, dilua 4 μg de DNAs de α7 (1 μg/μL) e 1 μg de DNA plasmídico de NACHO (1 μg/μL) em meio sérico reduzido (sem antibiótico) até um volume final de 250 μL. Misture suavemente pipeteando após a adição de DNA.
    1. Para expressar α4β2 nAChRs: Diluir 4 μg de cada subunidade DNA em um total de 250 μL de meio sérico reduzido. Misture suavemente pipetando. Ajuste a razão de cada subunidade para otimizar a expressão de isoformas específicas dos receptores.
    2. Para expressar α4β2 nAChRs com um plasmídeo adicional, adicione quantidades iguais de cada DNA plasmídeo. A proteína fluorescente azul mTagBFP2³¹ em pcDNA3.1(+) serve como plasmídeo de controle e pode ser substituída por qualquer chaperona α4β2.
  9. Misture suavemente o reagente de transfecção de DNA antes de usar. Em um tubo separado para microcentrífuga, dilua 8 μL de reagente de transfecção gota a gota em 250 μL de meio sérico reduzido. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Avance para a próxima etapa em 25 minutos.
  10. Após 5 minutos, combine os DNAs diluídos com o reagente de transfecção diluído (total = 500 μL) gota a gota. Misture suavemente pipetando e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Os complexos DNA-lipídicos permanecem estáveis por até 6 horas.
  11. Enquanto os complexos se formam, retire as placas de cultura da incubadora e substitua o meio por 1 mL de EMEM sem soro (sem antibióticos).
  12. Adicione 500 μL do complexo de reagente de transfecção de DNA em gota em cada recipiente (volume final = 1,5 mL). Misture suavemente balançando a placa para garantir uma distribuição uniforme pelo prato, especialmente sobre a superfície do fundo de vidro. Incube a 37 °C por 24 horas, depois substitua o meio após 4-6 horas para promover a saúde celular.

2. Marcagem de células vivas de nAChRs α7 expressos por membrana plasmática usando αBTX Alexa Fluor 647

NOTA: O procedimento a seguir geralmente é realizado 24 horas após a transfecção. Proteja a αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) da luz para evitar a fotodestruição do fluoróforo.

  1. Pré-aqueça todos os reagentes a 37 °C e descongele a solução αBTX-AF647 (2,3 μM). Limpe com etanol 70% e coloque no armário de biossegurança.
  2. Retire o recipiente contendo as células transfectadas com DNAs α7 e NACHO da incubadora, limpe o exterior com 70% de etanol e coloque-o no armário de biossegurança.
  3. Descarte o meio antigo por sucção a vácuo. Para lavar as células, adicione 2 mL de meio de crescimento novo de EMEM.
  4. Remova o meio de lavagem por sucção a vácuo. Adicione 2 mL de meio de crescimento EMEM aos pratos.
  5. Substitua a quantidade apropriada de meio por αBTX-AF647 para alcançar uma concentração final de 80 nM. Incube durante a noite a 37 °C.
  6. Pela manhã, pré-aqueça PBS ou um meio de imagem preferido e limpe com 70% de etanol. Transfira para o gabinete de biossegurança.
  7. Retire as células transfectadas da incubadora, limpe-as e coloque-as no armário de biossegurança.
  8. Remova o meio antigo contendo αBTX-AF647 e coloque-o em um recipiente de resíduos apropriado.
  9. Lave as células com 2 mL de PBS por 3x, 10 minutos cada em temperatura ambiente. Os enxágues removem ligantes e detritos não ligados, e o tempo pode ser ajustado para atender às necessidades do pesquisador. Remova PBS após cada lavagem.
  10. Adicione 2 mL de PBS ou um meio de imagem preferido e prossiga para a imagem das células usando um microscópio confocal.

3. Imagem de células vivas de nAChRs α7-pHuji totais e internos

NOTA: O procedimento a seguir utiliza um plasmídeo α7-pHuji pcDNA3.1 fabricado internamente co-transfectado com a chaperona NACHO. Um protocolo semelhante foi usado para expressar α4-SEP e β2-pHuji em pcDNA3.1 com o plasmídeo de controle mTagBFP2 pcDNA3.1, conforme descrito na seção de Resultados. Proteja as amostras da luz durante todo o procedimento para evitar a fotodestruição do fluoróforo.

  1. Prepare o tampão de imagem de pH 7,4 (Tabela 1) e o tampão de tampão de têmpera de pH 5,5 (Tabela 2) conformedescrito 23.
  2. Pré-aqueça os reagentes a 37 °C, limpe com 70% de etanol e transfira para o gabinete de biossegurança. Retire as células transfectadas da incubadora, limpe com etanol 70% e coloque-as no armário de biossegurança.
  3. Remova o meio antigo por sucção. Enxágue a travessa com 2 mL de manteide de mantei, 3 vezes, 10 minutos cada em temperatura ambiente. Adicione 2 mL de tampão de imagem pH 7,4.
  4. Leve o prato ao microscópio confocal. Insira o prato de imagem com tampão de imagem pH 7,4 no suporte de lâminas e coloque o suporte na câmara ambiental pré-aquecida no microscópio confocal.
  5. Conecte o tubo da bomba peristáltica ao suporte de placa de imagem e feche a câmara.
  6. Abra o software de imagem e selecione lasers para os fluoróforos de interesse (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm e mTagBFP2 359/461 nm).
  7. Escaneie a antena para localizar células para imagem usando um objetivo 10x-60x. Aumente a ampliação se desejado e ajuste a profundidade de foco conforme necessário.
  8. Ajuste a intensidade do laser e a sensibilidade do detector para visualizar a fluorescência sem um sinal de fundo. Ajuste a abertura para aumentar o sinal de fluorescência, se necessário.
  9. Selecione a resolução preferida e capture a imagem única usando o objetivo desejado (por exemplo, 60x).
  10. Registre a localização no mapa do prato para realocar as mesmas células após a mudança do tampão para tampão de tampão de têmpera de pH 5,5.
  11. Repita o processo de imagem para várias áreas da antena, registrando cada novo local. Use as mesmas configurações de captura para todas as imagens (experimentais e grupos de controle) para permitir comparações válidas.
  12. Mantendo apenas a linha de saída conectada à bomba peristáltica, aspirando lentamente o tampão de pH 7,4 da antena para um recipiente de resíduos.
  13. Quando a maior parte do tampão for removida (sem secar células), transfira a linha de entrada para o tampão de tampão de têmpera de pH 5,5.
  14. Ligue a bomba peristáltica para adicionar um tampão de pH 5,5 lentamente (1,5 mL/min) ao prato, garantindo que as células permaneçam conectadas.
  15. Ligue a bomba por 20 minutos, observando que o buffer flui corretamente para dentro e para fora do prato.
  16. Desligue a bomba e incube as células com o tampão de têmpera de pH 5,5 por mais 20 minutos para permitir o equilíbrio.
  17. Para repetir a imagem, carregue as localizações salvas da sessão anterior para retornar às mesmas regiões.
  18. Confirme que a profundidade focal e a posição estão corretas, pois podem mudar após a troca de buffer.
  19. Repita a imagem em todos os locais salvos usando a condição de extinção com pH.
ReagenteConcentração (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl21.8
HEPES20
Glicose D1
Ajuste a solução para pH 7,4

Tabela 1: Receita de tampão de imagem. Os seguintes reagentes foram somados e a solução ajustada para pH 7,4.

ReagenteConcentração (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
Glicose D1
Ajuste a solução para pH 5,5

Tabela 2: Receita de tampão para têpria. Os seguintes reagentes foram misturados, e a solução resultante foi ajustada para um pH de 5,5.

4. Quantificação de imagens

NOTA: Este procedimento explica como analisar imagens celulares usando o ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) e o método32 de fluorescência celular total corrigida (CTCF).

  1. Abra o ImageJ e abra a imagem para ser analisada. A imagem aparecerá como uma pilha com cada canal capturado separado dentro do mesmo quadro.
  2. Navegue até o canal de Fase . Se a imagem estiver muito brilhante (comum em regiões em branco ou de fundo), selecione Processar > Melhorar Contraste e então clique em OK.
  3. Usando a ferramenta lupa, faça zoom (+) em uma célula. Usando a ferramenta de seleção à mão livre, trace o contorno da célula no canal de fase.
  4. Mude para o canal fluorescente correspondente ao fluoróforo de interesse. Configure as medições desejadas selecionando Analisar > Conjunto de Medições. Certifique-se de que a Área, o Valor Cinza Médio e a Densidade Integrada estejam verificados.
  5. Para medir a região selecionada, escolha Analisar > Medir ou pressione Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).
  6. Faça três medições de fundo traçando áreas vazias próximas à célula. Repita os passos para o número desejado de células.
  7. Os dados de medição aparecerão em uma janela separada de Resultados no ImageJ. Copie e cole esses dados no Excel para análise.
  8. Calcule a média média de fundo a partir das três medições de fundo.
  9. Calcule o valor CTCF de cada célula usando a seguinte fórmula:
    CTCF=Densidade integrada−(Área da célula x Fluorescência média de fundo)
  10. Repita esse processo para múltiplas células e imagens para cada grupo experimental (e condição de pH, se aplicável). Exporte todos os resultados para um software de análise de dados para processamento estatístico.

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Resultados

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Seguindo os procedimentos de transfecção acima, nAChRs α7 e a proteína chaperona NACHO foram coexpressas nas células N2a. Tanto as células não transfectadas quanto as transfectadas foram marcadas com αBTX-AF647 24 horas após a transfecção de DNA. Como o αBTX não é permeável à membrana, toda fluorescência detectada se origina dos receptores presentes na membrana plasmática. Na Figura 2A, foi observada uma coloração fraca por αBTX-AF647 em cél...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As metodologias apresentadas para expressar e quantificar subunidades de nAChR em células N2a de mamíferos abordam desafios antigos para alcançar expressão rápida (~24 horas) e abundante de nAChR (> 60%) na membrana plasmática para estudos de descoberta, localização e tráfico de fármacos. Uma força chave desse conjunto de protocolos é sua adaptabilidade tanto para nAChRs homoméricos (α7) quanto heteroméricos (α4β2), e provavelmente é aplicável a outros subtipos de nAChR, juntamente com a...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer a James Janoso por sua expertise em microscopia técnica e ao Center for Transformative Research in Metabolism (Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número P20GM130443) pelo apoio ao Núcleo de Microscopia da Universidade do Alasca em Fairbanks. Os esforços da LW foram parcialmente apoiados por financiamento do Fundo de Investimento em Ensino Superior, fornecido pelo estado do Alasca por meio da Universidade do Alasca. Os esforços da SMS foram apoiados pelo Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde, sob a bolsa número P20GM103395. Pesquisas relatadas nesta publicação foram apoiadas pelo Instituto Nacional de Saúde Mental dos Institutos Nacionais de Saúde (MMW pelo prêmio número R03MH135358) e pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (MMW pelo prêmio número R16GM150455) dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Tripsina-EDTA (1X) Gibco25200-056Reagente de descolamento celular
Alfa-Bungarotoxina Alexa Fluor 647InvitrogenB35450Conjugado de alfa-bungarotoxina
Gabinete de Biossegurança nível 1 BSL & nbsp;NuaireNU-425-400Área de trabalho de cultura celular estéril
Cloreto de cálcioAventor/VWRBDH9224Componente buffer
D-(+)-glicoseMilliPore Sigma G8270Componente buffer
EMEM com L-glutaminaATCC30-2003Meio celular
DNA livre de endotoxinasFeito internamente usando kits ZymoNão aplicávelDNAs de nAChR para uso em transfecções transitórias celulares
Tubos microcentrífugas livres de endotoxinas, 0,5 mL Aventor/VWR89000-010DNA e preparação para transfecção
Tubos microcentrífugas livres de endotoxinas, 1,5 mL Aventor/VWR20170-038DNA e preparação para transfecção
Soro Fetal BovinoAventor/VWR97068-085Suplemento sérico
Fluoview FV10iOlympusFV10iMicroscópio Confocal
Pratos MatTek com fundo de vidroMatTekP35GC-0-10-CAntenas de imagem
GraphPad Prism v. 10GraphPad Prismahttps://www.graphpad.com/featuresSoftware de análise de dados
HEPESMilliPore Sigma H3375Componente buffer
Lipofectamina 2000Invitrogen11668019Reagente de transfecção
Cloreto de magnésio hexahidratadoTermociência413410025Componente buffer
Hidratação MESMilliPore Sigma M5287Componente buffer
mTagBFP2-pBADAddGene 54572DNA de controle será usado para transfecção transitória celular  
Células Neuro 2 A (N2a)Coleção de Cultura do Tipo AmericanoCCL-131Células usadas para transfecções de DNA e expressão de nAChR
Opti-MEMGibco31985-070Meio sérico reduzido
Penicilina/EstreptomicinaAventor/VWRK952-100mLAntibiótico
Bomba de peristalsisGilsonMiniPuls3O buffer muda ao fazer imagens  
Soro salino tamponado com fosfatoQualidade Biológico119-069-131Amortecedor salino
Auxílio de PipetaDrummond 140084Transferência precisa de líquidos
Pontas de pipeta (estéreis e sem endotoxinas, 1000uL)Rainin30389216Transferência precisa de líquidos
Pontas de pipeta (estéreis e sem endotoxinas, 20uL)Rainin30389229Transferência precisa de líquidos
Pontas de pipeta (estéreis e sem endotoxinas, 250uL)Rainin30389246Transferência precisa de líquidos
Pipettes, P10Rainin L-10XLSTransferência precisa de líquidos
Pipettes, P100Rainin L-100XLSTransferência precisa de líquidos
Pipettes, P1000Rainin L-1000XLSTransferência precisa de líquidos
Cloreto de potássioMilliPore Sigma P3911Componente buffer
Pipetas sorológicas (estéreis e sem endotoxinas, 10 ML)Aventor/VWR89130-898Transferência precisa de líquidos
Pipetas sorológicas (estéreis e livres de endotoxinas, 25 mL)Aventor/VWR89130-900Transferência precisa de líquidos
Pipetas serológicas (estéreis e sem endotoxinas, 5 mL)Aventor/VWR76201-710Transferência precisa de líquidos
Pipetas sorológicas (estéreis e sem endotoxinas, 50 mL)Aventor/VWR75816-088Transferência precisa de líquidos
Cloreto de sódioAventor/VWRBDH9286Componente buffer
Frasco de Cultura de TecidosFalcon353109Cultivo de pratos
Kit de Plasmídeos ZymoPure II MaxiprepPESQUISA COM ZYMOD4203-A + D4203-BProdução de DNA livre de endotoxinas
α 4-SEP Serviços de Síntese Genética Científica ThermoFisher & nbsp;  https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlServiços personalizados de síntese gênica
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Referências

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