ML385 atenua a progressão maligna de células de adenocarcinoma de pulmão induzidas por sílica através da via do eixo de autofagia ROS/NRF2

O adenocarcinoma de pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, com uma estimativa de 2 milhões de novos casos e 1,76 milhão de mortes a cada ano¹. Nos últimos anos, aumentou a incidência de adenocarcinoma de pulmão entre pessoas que nunca fumaram, o que pode estar relacionado a fatores ambientais, como a poluição do ar². A sílica é um poluente ambiental comum e foi identificada como um potencial fator patogênico para adenocarcinoma de pulmão humano³. A sílica pode causar inflamação crônica persistente, levando à infiltração de macrófagos, linfócitos e neutrófilos, e à liberação de espécies reativas de oxigênio e fatores inflamatórios⁴. Esse microambiente inflamatório de longa duração promove a ocorrência de adenocarcinoma de pulmão ^5,6. Embora a associação entre exposição à sílica e adenocarcinoma de pulmão tenha sido confirmada, seu mecanismo molecular específico não foi totalmente elucidado.

O fator de transcrição NRF2, codificado pelo gene NFE2L2, desempenha um papel crucial como regulador mestre na manutenção da homeostase redox celular em resposta ao estresse oxidativo ^7,8. Em circunstâncias normais, o NRF2 é marcado e degradado pelo complexo ubiquitina ligase KEAP1-CUL3. Sob a estimulação do estresse oxidativo ou de substâncias eletrofílicas, a atividade do KEAP1 é inibida, permitindo que o NRF2 se acumule de forma estável e entre no núcleo, exercendo assim o papel de defesa e regulador do núcleo⁹. No entanto, a ativação excessiva de NRF2 no microambiente tumoral pode aumentar a glicólise e a sobrevivência das células tumorais, interrompendo o acúmulo de ROS e aumentando a resistência apoptótica^10,11. Estudos comprovaram que a exposição à sílica pode resultar em ativação anormal da via de sinalização NRF2 ^12,13. Portanto, o direcionamento do NRF2 pode ser uma estratégia eficaz para intervir na progressão maligna do adenocarcinoma de pulmão induzido pela sílica¹⁴.

Este estudo tem como objetivo esclarecer se o inibidor de NRF2 ML385 inibe a progressão maligna do adenocarcinoma de pulmão induzida por sílica, regulando a via do eixo ROS/NRF2-autofagia. Estabelecemos um modelo de camundongo induzido por sílica para reproduzir as principais características da doença e usamos métodos experimentais in vitro para estudar a interação entre macrófagos e células tumorais. Descobrimos que a sílica induziu a expressão de moléculas inflamatórias e imunes e promoveu ainda mais a formação de tumores através da via do eixo ROS/NRF2-autofagia. Quando o inibidor de NRF2 (ML385) foi usado, o efeito promotor da sílica na formação de tumores diminuiu, sugerindo que o inibidor de NRF2 pode desempenhar um papel no tratamento de tumores pulmonares induzidos por sílica.

Todos os blocos de doadores foram obtidos de amostras patológicas de arquivo coletadas entre 2016 e 2018 no Hospital Popular Huai'an NO.1 Afiliado da Universidade Médica de Nanjing. As amostras foram desidentificadas antes do uso e processadas de acordo com os protocolos aprovados. O comitê de ética do Hospital Popular Afiliado Huai'an No.1 da Universidade Médica de Nanjing, KY-2024-250-01. A criação, descarte e aplicação de camundongos experimentais seguem rigorosamente os Regulamentos sobre a Administração de Animais de Laboratório e as diretrizes internacionais.

Construção de um modelo de camundongo induzido por sílica
Preparação de camundongos e suspensão de sílica: Criar camundongos C57BL/6 machos, de 6 a 8 semanas de idade, em uma sala de animais com temperatura ambiente de 20-25 °C e ciclo de 12 h de luz / 12 h de escuridão. Para preparar a suspensão de pó de silício, 300 mg de pó de pó de silício foram pesados com precisão e suspensos em 10 mL de solução salina estéril 1x tamponada com fosfato. Posteriormente, a mistura foi vigorosamente vórtice e oscilada por 5 min e, em seguida, tratada por ultrassom em uma máquina ultrassônica em banho-maria por 30 min para garantir a dispersão uniforme das partículas e evitar a agregação. A concentração final desta suspensão de reserva é de 30 mg/ml. Esterilize-o em autoclave a 121 °C durante 30 min. Antes de cada uso, é necessário vórtice e agitar novamente por 2-3 min para ressuspender quaisquer partículas sedimentadas.

Os camundongos inalaram suspensão de sílica pelo nariz. A micropipeta foi usada para introduzir lenta e gota a gota a solução na cavidade nasal dos camundongos. Os camundongos foram divididos em 6 grupos com 20 camundongos em cada grupo. O volume de inalação de cada grupo foi de 10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL e 200 μL, com concentração de 30 mg/mL, uma vez ao dia durante 40 dias consecutivos. Ao perfundir, segure a pele atrás da orelha do mouse com o polegar e o indicador da mão esquerda e fixe o corpo e a cauda do mouse com os outros dedos. Certifique-se de que o camundongo esteja em decúbito dorsal com a cabeça ligeiramente inclinada para trás para permitir que a suspensão seja naturalmente inalada para o trato respiratório. Descobrimos que não houve evento de morte após o segundo dia de inalação de suspensão de sílica de 10 μL, 30 μL, 50 μL e 70 μL em camundongos, enquanto houve um evento de morte após o segundo dia de inalação de suspensão de sílica de 90 μL e 200 μL em camundongos. Portanto, o volume máximo de inalação de sílica em camundongos foi de 70 μL por dia.

Ao manusear sílica cristalina, deve ser realizado em cabine de biossegurança ou capela de exaustão, e máscaras N95, óculos à prova de poeira, luvas de nitrilo e roupas de proteção devem ser usadas durante todo o processo. Ao preparar a suspensão, os movimentos devem ser suaves e uma câmara de pesagem deve ser usada para evitar a geração de aerossóis. Todos os resíduos de contato com sílica devem ser coletados em recipientes lacrados com resistência à perfuração e descartados de acordo com os regulamentos para resíduos químicos perigosos. É estritamente proibido misturá-lo com lixo geral ou despejá-lo no esgoto. Resíduos biológicos, como meio de cultura de células, devem ser coletados em latas de lixo especiais contendo desinfetantes e esterilizados sob alta pressão. As carcaças e tecidos dos animais devem ser colocados em sacos de lixo biológico e esterilizados sob alta pressão para tratamento inofensivo.

Avalie o sucesso do modelo de camundongo induzido por sílica. Avaliar os animais em diferentes momentos após a inalação de sílica, nomeadamente no 3º, 14º e 40º dias. Os camundongos foram colocados em dispositivos profissionais de eutanásia animal e o dióxido de carbono foi introduzido a uma taxa de enchimento de 30% a 50% do volume / min. Eles foram continuamente expostos até pararem de respirar. Após a confirmação da morte, foram realizadas operações subsequentes. O tecido pulmonar foi removido. O tecido pulmonar foi fixado em solução de paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 48 h. Após a fixação, o tecido foi desidratado com álcool gradiente, transparente com xileno e, em seguida, embebido em parafina. Os cortes contínuos foram feitos usando uma máquina seccionadora de parafina com espessura de 4-5 μm para posterior coloração histológica e análise imuno-histoquímica. O tecido pulmonar não requer tratamento de descalcificação. O exame patológico do tecido pulmonar foi realizado para avaliar a geração bem-sucedida do modelo. Os critérios de sucesso da construção do modelo de silicose foram os seguintes: inflamação pulmonar significativa, fibrose e ocorrência de nódulos de silicose.

Análise da infiltração de células imunes no modelo de camundongo induzido por sílica
Os tecidos pulmonares de camundongos no dia 14 após a inalação de sílica foram corados com marcadores fluorescentes contendo CD3e (proporção de diluição de 1:200), CD8a (taxa de diluição de 1:200), CD86 (proporção de diluição de 1:200), F4/80 (proporção de diluição de 1:200) e Nk1.1 (proporção de diluição de 1:200) para visualizar células imunes. Fixe seções de células ou tecidos e bloqueie com albumina de soro bovino (BSA) a 5% por 1 h para reduzir a ligação inespecífica. Use soro normal da mesma origem da espécie que o anticorpo bloqueador, dilua o soro com PBS na proporção de 1:10 e adicione 100 μL de soro diluído na amostra. Em seguida, bloqueie em temperatura ambiente por 30 min para permitir que o soro bloqueie os anticorpos endógenos. Após a selagem, enxágue suavemente 2x com PBS. Os anticorpos primários contendo CD3e (razão de diluição de 1:200), CD8a (razão de diluição de 1:200), CD86 (razão de diluição de 1:200), F4/80 (razão de diluição de 1:200) e Nk1.1 (razão de diluição de 1:200) foram incubados durante a noite a 4 °C ou em temperatura ambiente por 1-2 h. Após a lavagem com PBS, o anticorpo secundário fluorescente foi adicionado e incubado no escuro por 1 h.

Coloração de Masson e análise imuno-histoquímica
Os cortes de parafina foram desparafinados com xileno e hidratados com álcool gradiente e, em seguida, a recuperação do antígeno foi realizada em tampão citrato de sódio com pH 6,0 por remediação térmica de alta pressão. Para remediação térmica de alta pressão, coloque as fatias de tecido embebidas em tampão de reparo em um forno de micro-ondas em fogo médio por 8-12 min. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com solução de peróxido de hidrogênio a 3% por 20 min e, em seguida, o local de ligação inespecífico foi bloqueado com BSA a 5% em temperatura ambiente por 30 min. Adicione os anticorpos primários NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) e VDAC1 (1:500) e incube durante a noite a 4 °C. Após lavar 3x com PBS, adicione anticorpo secundário anti-coelho de cabra marcado com HRP (1:500) e incube em temperatura ambiente por 1 h. Os cortes de parafina foram submetidos à coloração DAB, contracoloração de hematoxilina, transparência de desidratação e selamento em gel neutro para obter os resultados de imuno-histoquímica molecular correspondentes. Quando o DAB é usado para o desenvolvimento da cor, o desenvolvimento moderado da cor deve ser amarelo acastanhado a marrom acastanhado e o fundo deve ser claro. Tanto o desenvolvimento excessivo (marrom escuro) quanto o insuficiente (amarelo claro) requerem otimização do tempo de desenvolvimento da cor.

O grau de fibrose pulmonar foi analisado semiquantitativamente pelo método de pontuação de Ashcroft¹⁵: cortes corados por Masson foram observados em microscópio de aumento de 100x e o tecido pulmonar foi dividido aleatoriamente em 8 regiões. Cada região foi pontuada de acordo com o grau de fibrose (0-8 pontos), sendo a pontuação final a média de todas as regiões: 0 pontos (tecido pulmonar normal), 1-2 pontos (fibrose leve), 3-4 pontos (fibrose moderada), 5-8 pontos (fibrose grave).

Os resultados imuno-histoquímicos foram analisados quantitativamente por meio do software Image. Cinco campos de alta ampliação foram selecionados aleatoriamente, e o valor médio da densidade óptica (MOD) de cada campo foi medido como um indicador do nível de expressão da proteína.

Examinando o impacto da sílica e ML385 na autofagia e ROS em células RAW264.7
As células RAW264.7 e A549 (fornecidas pela Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui) foram cultivadas usando meio DMEM com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução de anticorpo biespecífico de penicilina-estreptomicina. As células 1 x 10⁷ foram cultivadas uniformemente em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C e 5% de CO₂. 5 μL de suspensão de sílica de 30 mg / mL foram adicionados a 1 x 10⁵ células / mL de células RAW264.7. Após incubação por 24 h, as células foram enxaguadas com PBS 3x, e a autofagia e o estresse oxidativo foram detectados por sondas ROS, LC3 e lisossomos. Ao mesmo tempo, o ML385¹⁶, um inibidor do NRF2, foi utilizado para inibir a expressão do NRF2 (concentração final de ML385: 5 mM/L). A autofagia e o estresse oxidativo foram detectados de acordo com as etapas experimentais acima. O estresse oxidativo e o fluxo de autofagia dos dois grupos foram analisados estatisticamente.

Análise imuno-histoquímica das expressões de VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 em tecido de adenocarcinoma de pulmão
As expressões de VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 foram verificadas em 30 pacientes. Tecidos com adenocarcinoma de pulmão e tecidos saudáveis adjacentes foram obtidos do Hospital Popular Huai'an NO.1 da Universidade Médica de Nanjing e foram analisados por imuno-histoquímica (IHC). Os resultados de IHQ e fibrose pulmonar foram analisados estatisticamente. Colete dados do paciente de acordo com as informações do paciente no sistema hospitalar. As etapas experimentais específicas são as seguintes: os cortes de parafina foram desparafinados com xileno e hidratados com álcool gradiente e, em seguida, a remediação do antígeno foi realizada em tampão citrato de sódio com pH 6,0 por remediação térmica de alta pressão. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com solução de peróxido de hidrogênio a 3% por 20 min e, em seguida, o local de ligação inespecífico foi bloqueado com BSA a 5% em temperatura ambiente por 30 min. Adicione os anticorpos primários NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) e VDAC1 (1:500) e incube durante a noite a 4 °C. Após lavar 3x com PBS, adicione anticorpo secundário anti-coelho de cabra marcado com HRP (1:500) e incube em temperatura ambiente por 1 h. Desenvolvimento de cor DAB, contracoloração de hematoxilina, transparente desidratado, vedação de goma neutra. Quando o DAB é usado para o desenvolvimento da cor, o desenvolvimento moderado da cor deve ser amarelo acastanhado a marrom acastanhado e o fundo deve ser claro. Tanto o desenvolvimento excessivo (marrom escuro) quanto o insuficiente (amarelo claro) requerem otimização do tempo de desenvolvimento da cor.

Análise de migração e invasão celular
Foi estudado o efeito do ML385 e do sobrenadante da co-incubação de sílica com células RAW264.7 na migração e invasão celular após serem incubadas com a linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão A549. O sobrenadante de células RAW264.7 co-cultivadas com sílica por 24 h foi adicionado às células A549. As células foram divididas em grupo sílica, grupo sílica+ML385 e grupo PBS. O grupo sílica: 5 μL de suspensão de sílica de 30 mg/mL foram adicionados a 1 x 10⁵ células/mL de células RAW264.7. Após incubação por 24 h, remova o sobrenadante celular para uso posterior. O grupo sílica + ML385: 5 μL de suspensão de sílica de 30 mg / mL e uma concentração final de 5 mM / L ML385 foram adicionados a 1 x 10⁵ células / mL de células RAW264.7. Após incubação por 24 h, remova o sobrenadante celular para uso posterior. Grupo PBS: 5 μL de PBS foram adicionados a 1 x 10⁵ células/mL de células RAW264.7. Após incubação por 24 h, remova o sobrenadante celular para uso posterior. Durante o ensaio de risco, as células A549 foram semeadas pela primeira vez em placas de 12 poços a uma densidade de 5 x^10,5 por poço. Depois que as células cresceram para 95% -100% de fusão, arranhões foram feitos nas células de monocamada usando a ponta de uma pipeta estéril de 200 μL. As células esfoliadas foram suavemente lavadas com PBS. Posteriormente, as condições de cultura foram alteradas para incluir 1% de meio básico de FBS e os sobrenadantes de cada grupo de tratamento para manter a viabilidade celular durante o período experimental de 7 dias. Imagens da mesma posição foram coletadas em microscópio invertido às 0 h (Dia 0) e no 7º Dia (Dia 7) após o arranhão, respectivamente. Finalmente, a área de arranhões foi analisada quantitativamente e a taxa de fechamento de arranhões foi calculada usando o software ImageJ para avaliar o efeito do sobrenadante de diferentes grupos de tratamento na capacidade de migração das células A549.

No ensaio de invasão de poros de tamanho específico, foi utilizada uma câmara de membrana de policarbonato de 8 μm, com a membrana da câmara superior pré-revestida com gel simulando o ambiente extracelular diluído na proporção de 1:8 para construir uma barreira de membrana basal. As células A549 foram ressuspensas em uma suspensão feita pela mistura de meio livre de soro com os sobrenadantes de cada grupo de tratamento na proporção de 1:1 e, em seguida, inoculadas na câmara superior (2 x 10⁴ células por câmara). Na câmara inferior, uma solução feita pela mistura de um meio contendo 20% de FBS com os sobrenadantes dos grupos de tratamento correspondentes (grupo Sílica + ML385, grupo Sílica e grupo PBS) na mesma proporção foi adicionada como atrativo químico. Os sobrenadantes dos grupos de tratamento correspondentes foram coletados por sucção através de uma pipeta em RAW264.7 Fagocitose celular de sílica. Após as células terem sido incubadas continuamente a 37 °C e CO₂ a 5% por 7 dias, as células não invasivas da câmara superior foram removidas com cotonetes, e as células que penetraram na membrana e atingiram a câmara inferior foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com cristal violeta a 0,1%. Finalmente, o número de células invasivas foi selecionado aleatoriamente a partir de 5 campos de visão por um microscópio óptico.

Análise do impacto da sílica e ML385 na apoptose de células A549 usando citometria de fluxo
Preparação e agrupamento celular: Foram coletadas células A549 tratadas com os sobrenadantes de cada grupo de tratamento (grupo PBS, grupo sílica, grupo sílica + grupo ML385). As células foram lavadas suavemente 2x com PBS pré-resfriado, depois ressuspensas em 1x tampão de ligação, e a densidade celular foi ajustada para 1 x 10⁶ células por tubo/100 μL. Em seguida, 5 μL de anexina V-FITC e 5 μL de solução de coloração PI foram adicionados à suspensão celular, suavemente vórtices para misturar e incubados em temperatura ambiente no escuro por 15 min. Após a incubação, 400 μL de tampão de ligação 1x foram adicionados a cada tubo e imediatamente testados na máquina. A detecção foi realizada usando um citômetro de fluxo. Excitado por um laser de 488 nm, o sinal de fluorescência da Anexina V-FITC foi coletado através do canal FITC, e o sinal de fluorescência do PI foi coletado através do canal PE. Antes do experimento, amostras de coloração única foram usadas para ajuste de compensação de fluorescência para eliminar a sobreposição espectral. Ao realizar a análise de dados, primeiro delineie a população de células-alvo no gráfico de dispersão FSC-A/SSC-A e elimine os fragmentos. Posteriormente, as aderências celulares foram excluídas usando o gráfico de dispersão FSC-H/FSC-A; Finalmente, um portão foi criado para distinguir entre células vivas, células apoptóticas precoces, células apoptóticas / necróticas tardias e células mecanicamente danificadas. Os dados foram obtidos e analisados por meio do software FlowJo V10.

Modelo de rato de sílica
Na Figura 1, os camundongos receberam sílica por via intranasal na dosagem de 30 mg/mL e 70 μL por 40 dias consecutivos, o que garantiu que nenhum evento de morte ocorresse nos camundongos e que o modelo de camundongo de sílica pudesse ser estabelecido com sucesso. Enquanto isso, gavagem de camundongos com PBS foram usados como controles negativos. O objetivo era eliminar a influência da operação e do próprio solvente e garantir que o fenótipo fosse especificamente induzido pela sílica. A replicação bem-sucedida deste modelo de lesão pulmonar induzida por sílica fornece uma base in vivo necessária para pesquisas subsequentes sobre o mecanismo de progressão maligna e intervenção medicamentosa.

Análise da infiltração de células imunes nos nódulos de camundongos induzidos por sílica
Na Figura 2, ao detectar a infiltração de células imunes nos nódulos de camundongos de sílica, verificou-se que havia um grande número de infiltração de células imunes (células CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ e Nk1.1+) nos nódulos, que estavam envolvidos na formação e desenvolvimento da doença pulmonar por sílica. Isso indica que a sílica induz um microambiente tumoral inflamatório persistente, que é um fator promotor chave para a ocorrência e desenvolvimento do tumor, e também a base fisiopatológica para a participação da via ROS/NRF2.

Relação entre fibrose pulmonar induzida por sílica e NRF2, CDK1 e VDAC1 em camundongos
Ao detectar a expressão de moléculas imunes em nódulos, verificou-se que NRF2 (alvo inibitório ML385), CDK1 (relacionado ao ciclo celular) e VDAC1 (envolvido no estresse oxidativo mitocondrial) foram altamente expressos ao redor e dentro dos nódulos e foram relacionados à fibrose pulmonar (Figura 3).

Impacto da sílica e ML385 na autofagia e ROS em células RAW264.7
Através da co-cultura de sílica e células RAW264.7, verificou-se que a sílica poderia induzir a produção de autofagossomos. Após 24 h de cultivo, a co-localização do autofagossomo e do lisossomo foi reduzida, o fluxo de autofagia foi inibido e a produção de ROS também foi reduzida. Quando ML385 (inibidor de NRF2 ) foi adicionado, a co-localização de autofagossomo e lisossomo foi aumentada, o fluxo de autofagia também foi aprimorado e as ROS também foram aumentadas de acordo (Figura 4).

Análise da expressão de VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 em tecido de adenocarcinoma de pulmão por IHQ
Conforme mostrado na Figura 5, NRF2 (um alvo inibitório de ML385), CDK1 (relacionado ao ciclo celular), VDAC1 (envolvido no estresse oxidativo mitocondrial) e p62 (envolvido na autofagia) são altamente expressos em tecidos de adenocarcinoma de pulmão e exibem diferenças significativas em comparação com tecidos adjacentes.

Efeito do ML385 e do sobrenadante da co-incubação de sílica com células RAW264.7 na migração e invasão de células A549
A sílica e o sobrenadante de cultura de células RAW264.7 podem promover a migração e proliferação de células A549, enquanto ML385 pode inibir significativamente esses processos (como mostrado na Figura 6). Este resultado indica que o efeito promotor de tumor do microambiente de macrófagos induzido pela sílica depende da via NRF2 . A inibição do NRF2 pode efetivamente bloquear esse efeito promotor de tumor, reduzindo assim a progressão maligna das células tumorais.

Impacto da sílica e ML385 na apoptose das células A549
A Figura 7 mostra que a sílica e o sobrenadante de cultura de células RAW264.7 têm um certo efeito inibitório na apoptose de células A549, e ML385 pode promover a apoptose de células A549.

Este estudo revelou a via mecanicista pela qual a exposição à sílica promove a progressão maligna do adenocarcinoma de pulmão através do eixo ROS/NRF2/autofagia usando métodos in vivo e in vitro . Experimentos com animais confirmaram que as moléculas-chave da via de sinalização NRF2 são significativamente ativadas no microambiente da fibrose pulmonar induzida pela sílica. Experimentos com células demonstraram que a sílica inibe diretamente o fluxo autofágico em macrófagos e reduz os níveis de ROS, e esse efeito pode ser especificamente revertido pelo inibidor de NRF2 ML385. Estudos de mecanismos mostraram que macrófagos tratados com sílica promovem a migração, invasão e inibição da apoptose de células de adenocarcinoma de pulmão por fatores secretores, e esse efeito promotor de tumor é completamente dependente da ativação da via NRF2.

Disponibilidade de dados:
Os conjuntos de dados que apoiam a conclusão deste artigo estão incluídos no artigo.

Figura 1: Construção de um modelo de sílica em camundongos. (A) Trate camundongos com inalação nasal de sílica (30 mg / mL) em diferentes volumes (10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL e 200 μL). 20 camundongos por dose por inalação. (B) Curva de sobrevivência do camundongo. A quantidade máxima de inalação é de 70 μL/dia. (C) Resultados da observação da coloração histopatológica de HE pulmonar em camundongos do grupo sílica e grupo PBS no dia 3, dia 14 e dia 40. (D) Resultados estatísticos do número de nódulos pulmonares observados em camundongos sob baixa ampliação, teste t, *** p <0,001, p = 0,004, t = 10,61 (dia 14), p = 0,0006, t = 10,02 (dia 40). N = 9. As barras de erro mostram o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Observação da infiltração de células imunes no tecido nodular de camundongos por meio de coloração de fluorescência. Alta infiltração de células imunes (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ e NK1.1+) em nódulos pulmonares induzidos por sílica em camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise da relação entre as expressões de NRF2, CDK1, VDAC1 e fibrose induzida por sílica por meio de imuno-histoquímica (IHQ) e coloração de Masson. (A) As expressões de NRF2, CDK1 e VDAC1 e os resultados da coloração de Masson. (B) Os resultados do IHC. (C) A análise estatística da fibrose pulmonar foi realizada entre o grupo de sílica e o grupo de camundongos PBS. teste t, ***p <0,001, p = 0,0002, t = 13,42 (NRF2), p = 0,0008, t = 9,247 (CDK1), p = 0,0009, t = 8,944 (VDAC1), p = 0,0003, t = 11,76 (fibrose pulmonar). N = 9. As barras de erro mostram o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Efeito da sílica na autofagia em células RAW264.7 e o efeito regulador da autofagia do inibidor de NRF2 ML385. (A) Após a co-incubação de sílica com células RAW264.7 por 24 h, a co-localização de autofagossomos (LC3) e lisossomos diminuiu (Verde). No entanto, após a adição de ML385, a co-localização de autofagossomos e lisossomos aumentou (amarelo). (B) Após a co-incubação de sílica com células RAW264.7 por 24 h, as ROS geradas pelo grupo sílica diminuíram, mas aumentaram após a adição de ML385. (C) Análise estatística das ERO e do fluxo de autofagia dos dois grupos, teste t, *** p <0,001, p = 0,0005, t = 10,59 (ERO), p <0,0001, t = 17,08 (autofagolisossomo). N = 6. As barras de erro mostram o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise imuno-histoquímica das expressões de VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 em tecido de adenocarcinoma de pulmão humano. (A) Expressões diferenciais (VDAC1, CDK1, p62 e NRF2) entre tecido de adenocarcinoma de pulmão humano e tecido não canceroso adjacente. (B) Análise estatística da expressão diferencial entre 30 casos de câncer e tecidos não cancerosos adjacentes do Hospital Popular Afiliado Huai'an NO.1 da Universidade Médica de Nanjing, teste t, ***p <0,001, p <0,0001, t = 8,322 (CDK1), p <0,0001, t = 16,4 (NRF2), p <0,0001, t = 15,47 (p62), p <0,0001, t = 17,75 (VDAC1). N = 30. As barras de erro mostram o erro padrão. (C) Análise estatística da fibrose no tecido adenocarcinoma de pulmão e tecido não canceroso adjacente, teste t, *** p <0,001, p = 0,0009, t = 8,854 (fibrose). N = 30. As barras de erro mostram o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Efeito do ML385 e do sobrenadante da co-incubação de sílica com células RAW264.7 na migração e invasão celular após serem incubadas com a linha celular de adenocarcinoma de pulmão A549. (A) O arranhão celular resulta no dia 0 e no dia 7 após a co-incubação do sobrenadante e ML385 com células A549. (B) Os resultados invasivos de células no dia 7 após a co-incubação de sobrenadante e ML385 com células A549. (C) Realização de análises estatísticas sobre os resultados do ensaio de arranhões celulares. *p <0,05, **p <0,01. teste t, p = 0,0020, t = 22,43 (Sílica + ML385 versus Sílica), p = 0,0135, t = 8,510 (Sílica + ML385 vs PBS), p = 0,0143, t = 8,281 (Sílica versus PBS). N = 6. As barras de erro mostram o erro padrão. (D) Realização de análises estatísticas sobre os resultados do ensaio invasivo celular. *p <0,05, **p <0,01, teste t, p =0,0097, t =10,06 (Sílica+ML385 versus Sílica), p =0,0472, t =4,437 (Sílica+ML385 versus PBS), p =0,0125, t =8,857 (Sílica versus PBS). N = 6. As barras de erro mostram o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Análise do impacto da sílica e ML385 na apoptose das células A549 por citometria de fluxo. (A) Detectar os resultados de apoptose das células A549 por meio de citometria de fluxo. (B) Realizar análise estatística sobre a porcentagem de células apoptóticas. *p <0,05, **p <0,01, teste t, p =0,0013, t =27,29 (Sílica+ML385 versus Sílica), p =0,0022, t =6,973 (Sílica+ML385 versus PBS), p =0,0048, t =5,649 (Sílica versus PBS). N = 6. As barras de erro mostram o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.