Artigo de método

Imageamento de Fluorescência Quantitativa de Infecção por Alphavirus para Triagens Antivirais

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DOI:

10.3791/69384

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14 de agosto de 2026

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1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresenta-se um protocolo robusto e adaptável para a visualização contínua de infecções por alfavirus. Este protocolo fornece uma abordagem para investigar a replicação de alfavirus e avaliar a eficácia de compostos antivirais ao nível celular com base em imagens de fluorescência.

Resumo

A microscopia de fluorescência oferece uma abordagem altamente sensível e versátil para investigar a infecção por alfavirus ao nível celular. Ao combinar vírus marcados com fluorescência com análise quantitativa de imagens, este método permite uma caracterização detalhada espacial e temporal da dinâmica da infecção, incluindo a detecção de diferenças sutis na cinética de replicação e na disseminação de célula para célula. Um objetivo central deste protocolo é sua aplicação em ensaios de triagem antiviral. A quantificação baseada em imagens da intensidade de fluorescência fornece um meio robusto e reprodutível para avaliar a eficácia de compostos antivirais, permitindo a detecção precoce e sensível de efeitos inibitórios em células infectadas. Isso facilita a identificação de candidatos antivirais promissores e apoia a avaliação de respostas dependentes da dose. A abordagem também é particularmente adequada para estudos comparativos de diferentes cepas ou mutantes de alfavirus, uma vez que variações no comportamento de replicação e nos padrões de disseminação tornam-se facilmente evidentes. Sua flexibilidade, compatibilidade com múltiplas linhagens celulares e integração direta em plataformas automatizadas de imagem tornam o método escalável e adequado para campanhas de triagem de alto rendimento. No geral, este protocolo impulsiona a descoberta e avaliação de estratégias antivirais. Dado que diversos alfavirus causam doenças significativas em humanos e animais, carecem de terapias antivirais aprovadas e continuam a se expandir geograficamente com surtos emergentes, a identificação de novos antivirais permanece uma prioridade urgente. Assim, este fluxo de trabalho baseado em fluorescência representa uma contribuição valiosa e oportuna para a pesquisa moderna de alfavirus.

Introdução

Alphavírus são vírus envelopados de RNA de fita simples e sentido positivo pertencentes à família Togaviridae1,2,3. Eles são transmitidos principalmente por mosquitos e são responsáveis por uma variedade de doenças em humanos e animais. O gênero alphavírus inclui diversos vírus de importância médica, como o vírus Chikungunya (CHIKV), o vírus Sindbis, o vírus da encefalite equina do leste e o vírus da encefalite equina venezuelana4,5. Esses patógenos causam sintomas que variam de febre e erupções cutâneas até complicações neurológicas graves6. De forma preocupante, o CHIKV ressurgiu como uma importante ameaça à saúde pública. Apenas desde o início de 2025, foram registrados mais de 220.000 casos em 14 países, resultando em pelo menos 80 mortes7. Embora a taxa de mortalidade seja baixa, uma proporção significativa dos indivíduos infectados desenvolve dor articular crônica, o que pode levar a incapacidade de longo prazo e redução da mobilidade8. Para desenvolver estratégias antivirais direcionadas, é essencial um entendimento mais abrangente da replicação dos alphavírus e das interações entre hospedeiro e patógeno. Enquanto isso, alguns alphavírus, como o vírus da Floresta de Semliki (SFV), apresentam baixa patogenicidade em humanos, apesar de compartilharem alta similaridade genética e estrutural com alphavírus mais virulentos. Isso torna o SFV um modelo ideal para o estudo dos alphavírus sem representar um alto risco à saúde humana9,10,11.

Ensaios tradicionais, como ensaios de placas, ensaio da dose infecciosa em cultura de tecidos 50% (TCID50) e análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), são valiosos para quantificar títulos virais e expressão gênica, mas estão limitados a medições de ponto final e exigem lise ou fixação celular. Como resultado, não conseguem capturar diretamente a dinâmica da infecção nas mesmas células ao longo do tempo12,13. Para superar essas limitações, a imagem de fluorescência em tempo real oferece uma abordagem poderosa e não destrutiva para monitorar a cinética da infecção em múltiplos pontos temporais. O uso de vírus marcados com fluorescência, como o SFV rotulado com mCherry, permite a visualização e quantificação diretas do sinal do vírus repórter e sua disseminação em células vivas14,15. Para os experimentos descritos aqui, foram empregadas linhagens celulares comumente utilizadas na pesquisa de arbovírus. As células U4.4, derivadas de larvas de Aedes albopictus, são células de mosquito que permitem a replicação eficiente de muitos arbovírus e facilitam estudos sobre interações vetor-vírus16,17. Paralelamente, as células BHK-21, uma linhagem celular de mamífero semelhante a fibroblastos originada de tecido renal de filhote de hamster, fornecem um sistema de hospedeiro vertebrado permissivo frequentemente usado para propagação viral e ensaios de virologia molecular18.

Este protocolo descreve em detalhes o monitoramento da expressão do repórter viral e a caracterização de compostos antivirais, utilizando inibidores da furina como exemplo. A furina é uma convertase de proproteínas encontrada em muitos eucariotos e desempenha um papel fundamental na ativação de precursores de fatores de crescimento, hormônios, metaloproteinases da matriz, proteínas plasmáticas e receptores19,20. Muitos alfavírus exploram a furina para clivar e ativar suas proteínas de superfície, uma etapa crucial para a replicação bem-sucedida20. Os inibidores da furina são compostos sinteticamente projetados que bloqueiam a atividade da furina, reduzindo assim a replicação viral21,22,23. Dada a limitada disponibilidade de protocolos padronizados para análise automatizada por microscopia de fluorescência de infecções por alfavírus utilizando um leitor multifuncional com capacidade de imageamento celular, apresenta-se um fluxo de trabalho detalhado para a caracterização de compostos antivirais em células aedinas. O protocolo delineia etapas para cultura celular, produção de vírus, infecção, tratamento com composto antiviral (inibidor da furina), imageamento por fluorescência e análise de imagens. No entanto, os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados a outros vírus e rótulos fluorescentes alternativos.

Protocolo

1. Segurança Biológica

OBSERVAÇÃO: O vírus Semliki Forest marcado com mCherry recombinante (SFV-mCherry) utilizado neste protocolo é geneticamente modificado24,25,26. A incorporação de um gene repórter fluorescente o classifica como um organismo geneticamente modificado, o que o torna sujeito a requisitos adicionais de contenção e regulamentação. Trabalhos envolvendo outros alfavirus, particularmente vírus mais patogênicos como o CHIKV, podem exigir contenção e permissões adicionais.

  1. Limpe o gabinete de segurança biológica com um desinfetante apropriado e aplique radiação UV por pelo menos 30 min antes e depois dos ensaios virais.
  2. Descarte todo material contaminado de acordo com as regulamentações locais de biossegurança. Colete resíduos sólidos e líquidos separadamente em recipientes autoclaváveis e submeta-os à autoclavação antes da eliminação.

2. Preparação de compostos antivirais

OBSERVAÇÃO: Os inibidores de furina MI-113027 (trans-4-(aminometil) cicloexanocarboxil-arginina-valina-arginina-4-amidinobenzilamida), MI-113127 (trans-4-(guanidinometil) cicloexanocarboxil-arginina-valina-arginina-4-amidinobenzilamida) e MI-114822,23 (4-(guanidinometil) fenilacetil-arginina-terc.-leucina-arginina-4-amidinobenzilamida) utilizados neste estudo são exemplos de compostos antivirais selecionados para teste. O inibidor de furina MI-1148 foi utilizado como controle negativo no ensaio de citotoxicidade e como controle positivo no ensaio antiviral.

  1. Dissolva compostos antivirais em um solvente apropriado. Sempre que possível, use água estéril para evitar efeitos citotóxicos. Dimetil sulfoxido ou metanol podem ser usados até 2% (v/v). Recomenda-se o uso de soluções estoque de 10 mM em água estéril.
  2. Armazene as soluções estoque a -20 °C, dependendo da estabilidade e solubilidade, salvo indicação em contrário pelo fabricante.

3. Cultura celular

  1. Cultive células U4.4 em meio Leibovitz L-15 suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% de aminoácidos não essenciais MEM, 1% de caldo de triptose fosfato, 1% de glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) (densidade de semeadura: aproximadamente 1 × 106 células/frasco T25, volume de cultura: 5 mL). Mantenha as células a 28 °C. Passe as células U4.4 numa proporção de 1:6 uma vez por semana, mas ajuste as densidades de semeadura conforme as necessidades experimentais.
    NOTA: Linhagens celulares adicionais, como células C6/36, também são compatíveis com este protocolo. Meios e suplementos alternativos podem ser utilizados conforme apropriado. A inclusão de antibióticos é opcional e pode ser omitida.
  2. Cultive células de rim de hamster bebê (BHK-21) em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de FBS, 1% de glutamina ou Equilíbrio estático, ΣFx=0, gráfico, análise de equilíbrio de forças, diagrama de estabilidade mecânica.‑alanil‑Equilíbrio estático, ΣFx=0, gráfico, análise de equilíbrio de forças, diagrama de estabilidade mecânica.‑glutamina e 1% de Pen/Strep (densidade de semeadura: aproximadamente 1 × 106 células/frasco T75, volume de cultura: 10 mL). Mantenha as células a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO2. Passe as células numa proporção de 1:12 a cada 4-5 dias, com flexibilidade para modificar as densidades de semeadura conforme necessário.
  3. Assegure-se de que as células permaneçam saudáveis e em proliferação ativa.

4. Produção do vírus

  1. Preparação de estoques de SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) em células BHK-21.
    1. Cultive células BHK-21 (densidade de semeadura: aproximadamente 1 × 105 células/bem, volume de cultivo: 500 µL) em uma placa de cultivo celular transparente de 24 poços, sob as condições descritas acima.
    2. Quando atingirem cerca de 90% de confluência (confluência-alvo: aproximadamente 2 × 105 células), transfecte as células BHK-21 com o plasmídeo SFV6-2SG-mCherry utilizando um reagente de transfeção em meio de infecção (DMEM suplementado com 1% de Pen/Strep e 0,2% de albumina sérica bovina). Para isso, dilua 1 µL do reagente de transfeção em 25 µL de meio com baixo teor de soro.
    3. Em um tubo separado, dilua 0,5 µg de DNA plasmidial e 1 µL de um aditivo proprietário em 25 µL de meio com baixo teor de soro. Adicione a solução de DNA diluída à solução contendo o reagente de transfeção diluído e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, adicione 50 µL do complexo resultante às células.
      NOTA: Outros reagentes de transfeção podem ser utilizados, desde que compatíveis com a linhagem celular específica, e as instruções podem variar conforme o reagente empregado.
    4. 48 h após a transfeção, colete o sobrenadante contendo o vírus com uma pipeta, alíquotas de 250 µL por tubo livre de DNA/RNA e armazene a -80 °C.
  2. Titulação pelo ensaio de TCID50.
    1. Cultive células BHK-21 (densidade de semeadura: aproximadamente 2 × 104 células/bem, volume de cultivo: 100 µL) em uma placa de 96 poços de qualidade para imagem preta, sob as condições descritas acima.
    2. Descongele uma alíquota do vírus, prepare diluições seriadas decimais da amostra viral em meio de infecção (15 µL da amostra de vírus + 135 µL de meio de infecção), descarte o meio antigo e adicione 100 µL das diluições às células.
    3. Incube as células por 1 h a 37 °C em um incubador umidificado contendo 5% de CO₂ e, posteriormente, substitua o inóculo por 100 µL de meio de infecção fresco.
    4. 48 h após a infecção (hpi), avalie a replicação viral por meio da medição de fluorescência utilizando um leitor de placas com multimodo de imagem (descrição detalhada na seção 7) e determine o efeito citopático causado pela infecção viral. Calcule o valor de TCID50 com base no método de Reed-Muench28 e converta em títulos virais estimados (PFU/mL) utilizando a aproximação padrão baseada na distribuição de Poisson, segundo a qual 1 TCID50 corresponde a 0,7 PFU.

5. Determinação da citotoxicidade

  1. Cultive células U4.4 (densidade de semeadura: aproximadamente 3 × 104 células/poço, volume de cultura: 100 µL) em uma placa de cultura celular transparente de 96 poços sob as condições descritas anteriormente.
    NOTA: Os poços externos (linhas A e H; colunas 1 e 12) foram semeados com células, mas excluídos da análise experimental para evitar efeitos de borda, incluindo evaporação aumentada.
  2. Quando atingirem 90% de confluência (confluência-alvo: aproximadamente 6 × 104 células), trate as células com 100, 50, 25 e 12,5 µM dos inibidores de furina MI-1130 e MI-1131 em um volume total de 100 µL. Adicione MI-1148 (nas mesmas concentrações de MI-1130 e MI-1131), células não tratadas e células tratadas com água como controles negativos, e ionomicina (100 µM no ensaio) como controle positivo para citotoxicidade.
  3. Após 48 h de tratamento (hpt), avalie a viabilidade celular utilizando um ensaio luminescente baseado na quantificação de ATP. Adicione um volume igual do reagente do ensaio luminescente a cada poço (1:1 em relação ao meio de cultura), agite a placa por 2 min para garantir a lise celular e incube por 10 min no escuro antes de medir a luminescência.
    NOTA: Outros ensaios de viabilidade celular baseados em diferentes princípios de detecção também podem ser utilizados.
  4. Registre a luminescência em uma placa de 96 poços preta ou branca utilizando o leitor multimodal.

6. Infecção viral e tratamento com um composto antiviral

  1. Cultive células U4.4 (densidade de semeadura: aproximadamente 3 × 104 células/poço, volume de cultura: 100 µL) em uma placa de 96 poços preta para imagem, sob as condições descritas acima.
    NOTA: Os poços externos (linhas A e H; colunas 1 e 12) foram semeados com células, mas excluídos da análise experimental para evitar efeitos de borda, incluindo evaporação aumentada.
  2. Infecte as células (confluência-alvo: aproximadamente 6 × 104 células) com SFV-mCherry em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 em meio L-15 não suplementado, utilizando um volume de inoculação de 100 µL, e incube por 1 h a 28 °C.
    NOTA: Apenas estoques de vírus repórter de baixo número de passagens devem ser utilizados, especialmente ao trabalhar com MOIs muito baixos e infecções de vários dias.
  3. Dilua os inibidores de furina MI-1130, MI-1131 e MI-1148 para concentrações finais de 100, 50, 25 e 12,5 µM em uma placa separada de 96 poços com fundo em V, utilizando meio L-15 suplementado. Prepare 110 µL por poço para permitir uma sobra de 10% e transfira 100 µL (volume final) para as células. Para os controles, utilize células infectadas tratadas com o solvente dos compostos antivirais e células infectadas contendo apenas o vírus como controle negativo. Células não infectadas e não tratadas também devem ser adicionadas para medir a fluorescência de fundo.
  4. Após o período de infecção de 1 h, remova o inóculo e transfira 100 µL dos inibidores de furina diluídos das placas de fundo em V para as placas pretas para imagem.
  5. Incube as células a 28 °C.

7. Imagem de fluorescência em células vivas, análise quantitativa de imagens e apresentação de dados

  1. Medição da expressão do repórter viral por microscopia de fluorescência (consulte Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 e Supplementary Figure 7 para configuração do programa).
    1. Após 24 e 48 hpi, marque os núcleos celulares adicionando 8 µL de uma solução de contramarcador nuclear permeável às células por poço. Incube por 30 min a 28 °C.
      NOTA: A infecção pode ser monitorada em múltiplos pontos temporais. No entanto, as medições realizadas 48 h após a infecção fornecem o sinal mais forte (consulte Supplementary Figure 8) e permitem avaliar os efeitos antivirais de forma mais confiável. Leituras em 24 h ou em pontos intermediários são viáveis, mas prolongar a incubação além de 48 h aumenta o risco de supercrescimento celular. Selecione uma confluência celular apropriada no início do experimento para garantir que as células não fiquem superconfluentes no momento escolhido para a leitura. Isso evitará a obstrução de uma contagem celular precisa.
    2. Após a incubação (e além da tampa transparente), adicione uma folha selante transparente cobrindo a parte superior da placa para segurança.
      NOTA: Ao usar um dispositivo de imagem, é essencial selecionar o tipo correto de placa. A iluminação, o tempo de integração e os ajustes de ganho variarão conforme o gene repórter. Recomenda-se fortemente realizar medições preliminares para determinar os parâmetros ideais. Os ajustes iniciais de iluminação, integração e ganho utilizados para estabelecer o protocolo sob as condições dadas estão descritos na Supplementary Figure 2, onde a configuração do programa é detalhada.
    3. Adquira imagens de todo o poço utilizando costura de imagens (quatro campos por poço com aumento de 4x) usando o leitor multimodal.
    4. Meça a intensidade de fluorescência vermelha utilizando um cubo de filtro Texas Red (Excitação: 586/15 nm; Emissão: 647/57 nm).
    5. Determine a contagem total de células utilizando o canal DAPI com os seguintes parâmetros (Excitação: 377/50 nm; Emissão: 447/60 nm).
  2. Análise quantitativa de imagens (consulte Supplementary Table 1 para os dados brutos).
    NOTA: Para as medições de fluorescência, foi utilizado um leitor de microplacas com capacidade de imagem. Os parâmetros detalhados usados neste ensaio podem ser encontrados na Supplementary Figure 2.
    1. Processe as imagens utilizando um software apropriado de análise de imagens.
    2. No painel de redução de dados, selecione Costura de Imagem para os canais DAPI e Texas Red para criar uma única imagem a partir dos poços.
    3. Adicione Estatísticas de Imagem e selecione Intensidade Total no canal Texas Red Costurado. Aplique Pré-processamento de Imagem para remover o ruído de fundo do canal DAPI Costurado.
    4. Execute Análise Celular no canal DAPI Costurado pré-processado.
    5. Calcule a intensidade média de fluorescência vermelha por célula subtraindo a fluorescência média dos poços controle não infectados e não tratados de cada poço tratado, e em seguida dividindo o resultado pela contagem total de células no poço correspondente.
  3. Solução de problemas
    1. Monitore a estabilidade do foco durante a medição, especialmente em aquisições de imagem longas ou ao usar placas sensíveis à temperatura.
    2. Ative o foco automático e aumente a frequência do foco automático se for observada deriva de foco. Reduza a velocidade de aquisição ou permita que as placas equilibrem à temperatura do equipamento antes da aquisição de imagens, caso a deriva persista.
    3. Utilize placas de qualidade para imagem para garantir qualidade de sinal consistente durante a aquisição. Evite vazamento de sinal (bleed-through) e superexposição evitando iluminação excessiva e tempos longos de integração.
    4. Reduza a intensidade de excitação, encurte o tempo de integração ou diminua o ganho até que a saturação do sinal seja evitada. Verifique se os canais do fluoróforo estão bem separados e ajuste as configurações dos filtros conforme necessário.
      NOTA: O vazamento entre DAPI e mCherry é geralmente baixo, mas depende do construto repórter utilizado (por exemplo, GFP).
    5. Evite confluência excessiva das células para manter a cinética de infecção adequada e a sensibilidade do ensaio. Caso ocorra confluência excessiva, reduza o tempo de incubação antes da medição.
    6. Monitore os efeitos dos corantes na viabilidade celular e na qualidade do sinal, especialmente em altas concentrações. Reduza a concentração do corante ou encurte os tempos de incubação se for observada toxicidade ou fundo excessivamente saturado relacionado ao corante.
    7. Prepare e armazene os corantes conforme as recomendações do fabricante para manter a estabilidade do sinal.

Resultados

Neste trabalho, apresenta-se um protocolo detalhado para monitorar a disseminação de alfavirus e avaliar compostos antivirais (por exemplo, inibidores da furina) utilizando microscopia de fluorescência em formato de placa de múltiplos poços. Para demonstrar a visualização dos efeitos inibitórios sobre a expressão do marcador viral, três inibidores da furina previamente sintetizados foram selecionados para testes na linhagem celular aedina U4.4: MI-1148, MI-1130 e MI-1131. Uma visão geral do fluxo experimental é ilustrada na Figura 1.

Antes de avaliar a eficácia antiviral, é essencial avaliar a citotoxicidade para garantir que qualquer redução na replicação viral não seja decorrente da morte celular causada pelo composto. Portanto, células U4.4 foram tratadas, com 90% de confluência, com os inibidores nas concentrações de 100, 50, 25 ou 12,5 µM. Células não tratadas e células tratadas com água (controle de solvente) serviram como controles negativos, enquanto a ionomicina foi utilizada como controle positivo. A viabilidade celular foi avaliada 48 h após o tratamento, utilizando um ensaio luminescente baseado na quantificação de ATP. Para os inibidores de furina testados, nenhuma redução significativa na viabilidade celular foi observada (Figura 2).

Dada a ausência de citotoxicidade, os compostos foram subsequentemente avaliados quanto à atividade antiviral. Por esse motivo, células U4.4 foram infectadas com SFV-mCherry por 1 h, seguido de tratamento com os mesmos inibidores da furina nas mesmas concentrações. Células infectadas e não tratadas, bem como células infectadas e tratadas com água, serviram como controles negativos para atividade antiviral, enquanto células não infectadas e não tratadas foram utilizadas para avaliar a fluorescência de fundo. Após 48 h do tratamento, a expressão do repórter viral foi quantificada por microscopia de fluorescência. Antes da aquisição de imagens, 8 µL de uma solução corante nuclear permeável a células foram adicionados a cada poço e incubados por 30 min para colorir os núcleos celulares. O sinal de fluorescência vermelha correspondente à expressão do repórter viral e o número total de núcleos foram quantificados a partir das imagens de fluorescência processadas. Dentre os inibidores testados, o MI-1148 demonstrou atividade antiviral potente, reduzindo significativamente a expressão do repórter viral de maneira dependente da dose (Figura 3). Em contraste, o MI-1130 e o MI-1131 não mostraram inibição observável da expressão do repórter viral em nenhuma das concentrações testadas. Os dados brutos e a análise do ensaio antiviral estão fornecidos na Tabela Suplementar 1.

Os resultados representativos demonstram que o protocolo identifica de forma confiável compostos com atividade antiviral, conforme mostrado pela forte redução no sinal do repórter observada com o MI-1148. Em contraste, os inibidores MI-1130 e MI-1131 não reduziram a expressão do repórter, indicando que sua potente inibição da furina, refletida por constantes de inibição em picomolar, não se traduziu em atividade antiviral nessas condições (Figura 4). Esses achados destacam a capacidade do ensaio em distinguir compostos ativos de inativos e em apoiar a identificação de estruturas ativas potentes e relevantes.

Processo de triagem antiviral; cultura celular, infecção viral, tratamento com compostos; gráfico de análise de dados.
Figura 1: Fluxo experimental. Uma visão esquemática do procedimento experimental utilizado para avaliar a atividade antiviral de inibidores da furina na linhagem celular aedina U4.4. O fluxo inclui a preparação do composto, semeadura celular, infecção com o vírus Semliki Forest marcado com mCherry, tratamento com compostos, microscopia de fluorescência para visualização em tempo real e quantificação da expressão do repórter viral. Esta ilustração foi criada com o BioRender. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras de viabilidade celular, comparação de concentração de fármaco; tratamentos com MI-1148, MI-1130, MI-1131.
Figura 2: Efeitos citotóxicos de inibidores da furina em células U4.4. Em aproximadamente 90% de confluência, as células U4.4 foram tratadas com MI-1148, MI-1130 e MI-1131 nas concentrações de 100, 50, 25 e 12,5 µM. Células não tratadas e células tratadas com água serviram como controles negativos, enquanto a ionomicina (100 µM) foi utilizada como controle positivo. Após 48 h de tratamento, a viabilidade celular foi avaliada por meio da quantificação de ATP. Os dados foram normalizados em relação ao controle não tratado e expressos como porcentagem (%). A viabilidade celular média (n=3) é apresentada, e as barras de erro representam o coeficiente de variação. A linha tracejada representa o limite de corte de citotoxicidade definido em 80%. n.d. = não detectável. A representação dos dados foi realizada com o GraphPad Prism v9.5.1. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras da intensidade vermelha das células versus concentração do fármaco; análise estatística dos compostos da série MI.
Figura 3: Atividade antiviral de inibidores da furina contra o vírus Semliki Forest marcado com mCherry (SFV) na linhagem celular aedina U4.4. Em aproximadamente 90% de confluência, as células foram infectadas com SFV-mCherry por 1 h, seguido de tratamento com MI-1148, MI-1130 e MI-1131 nas concentrações de 100, 50, 25 e 12,5 µM. Após 48 h de tratamento, a expressão do repórter viral foi quantificada por microscopia de fluorescência. Antes da aquisição de imagens, 8 µL de uma solução corante nuclear permeável a células foram adicionados a cada poço e incubados por 30 min para colorir os núcleos celulares. As imagens de fluorescência foram obtidas utilizando um filtro Texas Red para o sinal viral e um filtro DAPI para os núcleos. A análise de imagem foi realizada para quantificar a intensidade total de fluorescência vermelha (indicativa de replicação viral) e o número total de células por poço. Os dados (n = 4) são apresentados como intensidade vermelha total por célula (sinal total do vírus / contagem total de células). As barras de erro representam o desvio padrão. A significância estatística em comparação com o controle infectado com SFV foi determinada por ANOVA unidirecional e teste de comparações múltiplas de Dunnett: **** = P<0,0001; ns = P>0,05. A representação dos dados e a análise estatística foram realizadas com o GraphPad Prism v9.5.1. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Imagem de microscopia de culturas celulares infectadas com SFV em diferentes concentrações, mostrando os níveis de infecção.
Figura 4: Imagens de fluorescência representativas mostrando a atividade antiviral de inibidores da furina contra o vírus Semliki Forest marcado com mCherry (SFV) na linhagem celular aedina U4.4. As células com aproximadamente 90% de confluência foram infectadas com SFV-mCherry por 1 h, seguido de tratamento com MI-1148, MI-1130 e MI-1131 nas concentrações de 100, 50, 25 e 12,5 µM. Células infectadas e não tratadas, bem como células infectadas tratadas com água, serviram como controles negativos, enquanto células não infectadas e não tratadas foram incluídas como controles de fundo. O sinal do repórter foi avaliado 48 h após o tratamento por microscopia de fluorescência utilizando um filtro Texas Red para captar o sinal mCherry. Barra de escala = 2000 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Dados brutos da intensidade total do sinal do vírus e da contagem de células. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 1: Etapas do procedimento utilizadas no leitor de imagens para os resultados representativos. Primeiro, um conjunto de temperatura (vermelho) compatível com as condições de cultivo das células U4.4. Em seguida, três etapas independentes de aquisição de imagem (laranja) para as medições de DAPI, Texas Red e campo claro. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Configurações de imagem nas etapas do procedimento utilizadas no leitor de imagens para os resultados representativos. As primeiras configurações a serem modificadas são: aumento (4x) e tamanho da imagem (Campo de Visão Total). Deve-se selecionar o fluoróforo a ser medido e ajustar adequadamente os parâmetros de Iluminação, Tempo de Integração e Ganho. Por fim, devem-se selecionar a montagem de imagem (2x2) e a sobreposição (30 µm x 30 µm). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Etapas de redução de dados utilizadas no leitor de imagens para os resultados representativos. A primeira etapa é o remendo de imagens (azul) para os canais DAPI e Texas Red. Em seguida, Estatísticas da Imagem (roxo) fornecem a medição da intensidade total. Depois, é necessário o pré-processamento da imagem (verde) para remover o ruído de fundo do canal DAPI. Por fim, a Análise Celular (amarelo) é realizada na imagem remendada e pré-processada do DAPI. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Empalhamento de imagens nas etapas de redução de dados utilizadas no leitor de imagens para os resultados representativos. A configuração mais relevante é a redução do tamanho da imagem final (80%), pois, se for menor, afeta a resolução da imagem e, consequentemente, a medição final dos parâmetros. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Estatísticas das imagens nas etapas de redução de dados utilizadas no leitor de imagens para os resultados representativos. É importante selecionar o canal correto (Stitched: Fluorophore), escolher um limiar mínimo (2500) e, finalmente, o parâmetro a ser medido (Total Intensity). Para uma medição mais precisa, pode-se criar um Image Plug. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 6: Pré-processamento de imagem nas etapas de redução de dados utilizadas no leitor de imagens para os resultados representativos. A configuração mais relevante é o parâmetro de bola rolante (30 µm), priorizando resultados finos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 7: Análise Celular nas etapas de redução de dados utilizadas no leitor de imagens para os resultados representativos. É importante escolher o canal que possui a imagem pré-processada. Escolha dividir os objetos que se tocam e preencher os orifícios com máscaras. É fundamental selecionar a faixa correta de objetos (5-50 µm). Por fim, para resultados mais refinados, pode-se criar um Plug-in de Imagem. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 8: Atividade antiviral de inibidores da furina contra o vírus Semliki Forest marcado com mCherry (SFV) na linhagem celular aedina U4.4. Em torno de 90% de confluência, as células foram infectadas com SFV-mCherry por 1 h, seguido de tratamento com MI-1148, MI-1130 e MI-1131 nas concentrações de 100, 50, 25 e 12,5 µM. Em 24 h (barras vermelhas) e 48 h (barras verdes) após o tratamento, a expressão do repórter viral foi quantificada por microscopia de fluorescência. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 4). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A capacidade de observar a replicação de alphavírus em tempo real oferece uma perspectiva sequencial e cumulativa sobre testes convencionais de ponto final. Este protocolo de imagem celular viva em múltiplos momentos é um modelo útil para o estudo de alphavírus, pois fornece uma plataforma dinâmica para observar a disseminação viral.

O sucesso deste protocolo depende de vários parâmetros. Primeiramente, é importante avaliar a citotoxicidade dos compostos antes do ensaio antiviral para descartar resultados falso-positivos decorrentes da morte celular. Após a avaliação dos efeitos citotóxicos, a atividade antiviral dos compostos pode ser subsequentemente avaliada. Para os compostos em teste, nenhuma citotoxicidade foi observada. MI-1130 e MI-1131 não mostraram impacto significativo na expressão do repórter viral, enquanto MI-1148, utilizado como controle positivo, suprimiu-a efetivamente. Além disso, o momento da infecção em relação ao semeadura celular é crucial. As células devem atingir uma confluência adequada para garantir uma infecção reprodutível sem supercrescimento. Também é importante otimizar a multiplicidade de infecção, dependendo da linhagem celular, para observar uma infecção gradual sem comprometer a viabilidade celular. Por fim, a frequência de aquisição de imagens deve ser cuidadosamente determinada para permitir a visualização da expressão gradual do repórter viral sem grandes saltos. Para a maioria das aplicações, adquirir imagens a cada oito horas, por exemplo, fornece um equilíbrio eficaz entre detalhe temporal e integridade da amostra.

A principal vantagem deste protocolo é sua adaptabilidade. Neste experimento, utilizamos o SFV-mCherry e células U4.4 para demonstrar o monitoramento da expressão do marcador viral e sua inibição após tratamento com inibidores de furina. No entanto, o protocolo pode ser otimizado para a análise fluorescente de vírus alternativos com diferentes marcadores fluorescentes, como GFP, bem como para outros tipos celulares hospedeiros, incluindo células primárias e linhagens celulares diferenciadas. Embora o protocolo enfatize o tratamento com compostos após a infecção, o fluxo de trabalho também pode ser facilmente adaptado para experimentos de tempo de adição, incluindo pré-tratamento, co-tratamento, tratamento imediato pós-infecção ou tratamento tardio, a fim de investigar mais profundamente o mecanismo de ação antiviral. O protocolo foi inicialmente utilizado para comparar a funcionalidade da maquinaria de RNAi em células C6/36 e U4.414. Posteriormente, foi expandido para examinar como o dsRNA direcionado ao vírus inibe a expressão do marcador viral15.

Podem surgir desafios potenciais ao utilizar este protocolo. Os vírus marcadores, embora muito úteis para diversas aplicações in vivo29 e in vitro30, também podem apresentar menor virulência31 e instabilidade genética dos genes repórter32. A dessanexação celular causada pela superconfluência pode dificultar a visualização e a aquisição de imagens, afetando assim a contagem celular. A exposição prolongada a corantes para células vivas (por exemplo, Hoechst 33342 para núcleos) pode alterar o comportamento ou a viabilidade celular15. Além disso, experimentos envolvendo alfavirus altamente patogênicos, como o CHIKV, podem exigir medidas de biossegurança mais rigorosas e adaptações correspondentes do protocolo. Adicionalmente, pode-se observar deslocamento do foco em alguns casos, devido à variabilidade das placas, bem como ao uso de placas diferentes. Por exemplo, sinais de fluorescência em placas de cultivo celular transparentes podem vazar de um poço para os poços adjacentes, e placas brancas podem causar superexposição. Em ambos os casos, a precisão da medição do sinal fluorescente será afetada.

Este protocolo oferece diversas vantagens em comparação com ensaios virológicos convencionais. Por exemplo, os ensaios de placas e os ensaios de TCID50 fornecem dados finais sobre as titulações virais12. Além disso, a qPCR permite detecção sensível de RNA viral, mas não consegue distinguir entre vírus com capacidade de replicação e partículas virais não infecciosas ou ácidos nucleicos residuais. Em contraste, esse tipo de imagem fluorescente em tempo real permite avaliação contínua e não invasiva da progressão viral, disseminação e efeitos de tratamento dentro da mesma população de células ao longo do tempo.

Além da análise de inibidores de furina como compostos antivirais, nosso protocolo pode ser adaptado para outras aplicações. É particularmente adequado para triagem de fármacos antivirais, permitindo a quantificação de respostas dependentes da dose a diversos compostos. Oferece uma plataforma para o estudo de interações entre hospedeiro e patógeno, incluindo o momento e a localização da entrada viral, replicação e disseminação. Pode ser utilizado para comparação entre vírus repórter, diferentes cepas ou diferentes alfavírus. Além disso, pode ser combinado com abordagens como silenciamento gênico usando siRNA ou dsRNA. Assim, este sistema pode auxiliar na identificação e validação de alvos críticos e compostos antivirais para a replicação viral. No entanto, este ensaio baseado em fluorescência representa uma abordagem inicial de triagem e não um método confirmatório isolado; investigações adicionais, incluindo ensaios com vírus selvagens, serão necessárias para confirmar os resultados da triagem.

Divulgações

Os autores não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos ao Prof. Dr. Andres Merits, da Universidade de Tartu, Estônia, e ao Prof. Dr. Andreas Pichlmair, da Universidade Técnica de Munique, Alemanha, pela disponibilização do plasmídeo pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Agradecemos à Prof. Dra. Stefanie Becker, da Universidade de Medicina Veterinária de Hanôver, Alemanha, pelas células C6/36. Agradecemos ao Prof. Dr. Torsten Steinmetzer, da Universidade de Marburgo, Marburgo, Alemanha, pela disponibilização dos inibidores de furina. Este trabalho foi apoiado pelo programa Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz do Ministério Hesseniano de Ensino Superior, Pesquisa e Artes, por meio do Centro LOEWE de Genômica da Biodiversidade Translacional (LOEWE-TBG), com o código de financiamento: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, e pelo BMFTR (Projeto ASCRIBE – Número do Convênio 01KI2024).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina Bovina Fração V, pH 7,0SERVA Electrophoresis11930.03
DMEM BenchStableThermo Fisher ScientificA4192101
Células BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Alemanha603126
FRASCO DE CULTIVO CELULAR, 50 mL, 25 cm2, PS, tampa de rosca com filtro vermelho, transparente, CELLSTAR, TC, estérilGreiner Bio-One690175
Placa de microcultivo celular, 24 poços, PS, fundo F, (poço tipo chaminé), transparente, CELLSTAR, TC, tampa com anéis anti-condensação, estérilGreiner Bio-One662160
Placa de microcultivo celular, 96 poços, PS, fundo F, (poço tipo chaminé), µCLEAR, preta, CELLSTAR, TC, tampa com anéis anti-condensação, estérilGreiner Bio-One655090
Placa de microcultivo celular, 96 poços, PS, fundo F, (poço tipo chaminé), transparente, CELLSTAR, TC, tampa com anéis anti-condensação, estérilGreiner Bio-One655180
Placa de microcultivo celular, 96 poços, PS, fundo V, transparenteGreiner Bio-One651101
Escova para raspagem celularVWR734-2602
Ensaio Colorimétrico de Viabilidade Celular CellTiter-GloPromegaG7573
Leitor Multimodal de Imagens Celulares Cytation 5Biotek
Cubo de filtro DAPI 1225100Biotekex: 377/50 nm; em: 447/60 nm
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Soro Fetal BovinoFisher Scientific11550356
Inibidor de furina MI-1130Este estudo
Inibidor de furina MI-1131Este estudo
Inibidor de furina MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Software Gen5 PrimeBiotek
Sal de Ionomicina com Cálcio, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
Meio Leibovitz L-15, suplemento GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
Reagente de transfeção Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
Ácidos aminoácidos não essenciais MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Placa de microcultivo, PS, 96 poços, fundo F, (poço tipo chaminé), preta, Fluotrac, ligação médiaGreiner Bio-One655076
Reagente NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Universidade de Tartu, Estônia) e Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Universidade Técnica de Munique, Alemanha)
Cubo de filtro Texas Red 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Caldo de Triptose Fosfato Thermo Fisher Scientific18050039
Células U4.4Instituto Friedrich-Loeffler, Instituto Federal de Pesquisa em Saúde Animal, Greifswald, Alemanha
Selante Viewseal, transparenteGreiner Bio-One676070

Referências

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