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Artigo de método

Imageamento de Fluorescência Quantitativa de Infecção por Alphavirus para Triagens Antivirais

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DOI:

10.3791/69384

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14 de agosto de 2026

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1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresenta-se um protocolo robusto e adaptável para a visualização contínua de infecções por alfavirus. Este protocolo fornece uma abordagem para investigar a replicação de alfavirus e avaliar a eficácia de compostos antivirais ao nível celular com base em imagens de fluorescência.

Resumo

A microscopia de fluorescência oferece uma abordagem altamente sensível e versátil para investigar a infecção por alfavirus ao nível celular. Ao combinar vírus marcados com fluorescência com análise quantitativa de imagens, este método permite uma caracterização detalhada espacial e temporal da dinâmica da infecção, incluindo a detecção de diferenças sutis na cinética de replicação e na disseminação de célula para célula. Um objetivo central deste protocolo é sua aplicação em ensaios de triagem antiviral. A quantificação baseada em imagens da intensidade de fluorescência fornece um meio robusto e reprodutível para avaliar a eficácia de compostos antivirais, permitindo a detecção precoce e sensível de efeitos inibitórios em células infectadas. Isso facilita a identificação de candidatos antivirais promissores e apoia a avaliação de respostas dependentes da dose. A abordagem também é particularmente adequada para estudos comparativos de diferentes cepas ou mutantes de alfavirus, uma vez que variações no comportamento de replicação e nos padrões de disseminação tornam-se facilmente evidentes. Sua flexibilidade, compatibilidade com múltiplas linhagens celulares e integração direta em plataformas automatizadas de imagem tornam o método escalável e adequado para campanhas de triagem de alto rendimento. No geral, este protocolo impulsiona a descoberta e avaliação de estratégias antivirais. Dado que diversos alfavirus causam doenças significativas em humanos e animais, carecem de terapias antivirais aprovadas e continuam a se expandir geograficamente com surtos emergentes, a identificação de novos antivirais permanece uma prioridade urgente. Assim, este fluxo de trabalho baseado em fluorescência representa uma contribuição valiosa e oportuna para a pesquisa moderna de alfavirus.

Introdução

Alphavírus são vírus envelopados de RNA de fita simples e sentido positivo pertencentes à família Togaviridae1,2,3. Eles são transmitidos principalmente por mosquitos e são responsáveis por uma variedade de doenças em humanos e animais. O gênero alphavírus inclui diversos vírus de importância médica, como o vírus Chikungunya (CHIKV), o vírus Sindbis, o vírus da encefalite equina do leste e o vírus da encefalite equina venezuelana4,5. Esses patógenos causam sintomas que variam de febre e erupções cutâneas até complicações neurológicas graves6. De forma preocupante, o CHIKV ressurgiu como uma importante ameaça à saúde pública. Apenas desde o início de 2025, foram registrados mais de 220.000 casos em 14 países, resultando em pelo menos 80 mortes7. Embora a taxa de mortalidade seja baixa, uma proporção significativa dos indivíduos infectados desenvolve dor articular crônica, o que pode levar a incapacidade de longo prazo e redução da mobilidade8. Para desenvolver estratégias antivirais direcionadas, é essencial um entendimento mais abrangente da replicação dos alphavírus e das interações entre hospedeiro e patógeno. Enquanto isso, alguns alphavírus, como o vírus da Floresta de Semliki (SFV), apresentam baixa patogenicidade em humanos, apesar de compartilharem alta similaridade genética e estrutural com alphavírus mais virulentos. Isso torna o SFV um modelo ideal para o estudo dos alphavírus sem representar um alto risco à saúde humana9,10,11.

Ensaios tradicionais, como ensaios de placas, ensaio da dose infecciosa em cultura de tecidos 50% (TCID50) e análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), são valiosos para quantificar títulos virais e expressão gênica, mas estão limitados a medições de ponto final e exigem lise ou fixação celular. Como resultado, não conseguem capturar diretamente a dinâmica da infecção nas mesmas células ao longo do tempo12,13. Para superar essas limitações, a imagem de fluorescência em tempo real oferece uma abordagem poderosa e não destrutiva para monitorar a cinética da infecção em múltiplos pontos temporais. O uso de vírus marcados com fluorescência, como o SFV rotulado com mCherry, permite a visualização e quantificação diretas do sinal do vírus repórter e sua disseminação em células vivas14,15. Para os experimentos descritos aqui, foram empregadas linhagens celulares comumente utilizadas na pesquisa de arbovírus. As células U4.4, derivadas de larvas de Aedes albopictus, são células de mosquito que permitem a replicação eficiente de muitos arbovírus e facilitam estudos sobre interações vetor-vírus16,17. Paralelamente, as células BHK-21, uma linhagem celular de mamífero semelhante a fibroblastos originada de tecido renal de filhote de hamster, fornecem um sistema de hospedeiro vertebrado permissivo frequentemente usado para propagação viral e ensaios de virologia molecular18.

Este protocolo descreve em detalhes o monitoramento da expressão do repórter viral e a caracterização de compostos antivirais, utilizando inibidores da furina como exemplo. A furina é uma convertase de proproteínas encontrada em muitos eucariotos e desempenha um papel fundamental na ativação de precursores de fatores de crescimento, hormônios, metaloproteinases da matriz, proteínas plasmáticas e receptores19,20. Muitos alfavírus exploram a furina para clivar e ativar suas proteínas de superfície, uma etapa crucial para a replicação bem-sucedida20. Os inibidores da furina são compostos sinteticamente projetados que bloqueiam a atividade da furina, reduzindo assim a replicação viral21,22,23. Dada a limitada disponibilidade de protocolos padronizados para análise automatizada por microscopia de fluorescência de infecções por alfavírus utilizando um leitor multifuncional com capacidade de imageamento celular, apresenta-se um fluxo de trabalho detalhado para a caracterização de compostos antivirais em células aedinas. O protocolo delineia etapas para cultura celular, produção de vírus, infecção, tratamento com composto antiviral (inibidor da furina), imageamento por fluorescência e análise de imagens. No entanto, os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados a outros vírus e rótulos fluorescentes alternativos.

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Protocolo

1. Segurança Biológica

OBSERVAÇÃO: O vírus Semliki Forest marcado com mCherry recombinante (SFV-mCherry) utilizado neste protocolo é geneticamente modificado24,25,26. A incorporação de um gene repórter fluorescente o classifica como um organismo geneticamente modificado, o que o torna sujeito a requisitos adicionais de contenção e regulamentação. Trabalhos envolvendo outros alfavirus, particularmente vírus mais patogênicos como o CHIKV, podem exigir contenção e permissões adicionais.

  1. Limpe o gabinete de segurança biológica com um desinfetante apropriado e aplique radiação UV por pelo menos 30 min antes e depois dos ensaios virais.
  2. Descarte todo material contaminado de acordo com as regulamentações locais de biossegurança. Colete resíduos sólidos e líquidos separadamente em recipientes autoclaváveis e submeta-os à autoclavação antes da eliminação.

2. Preparação de compostos antivirais

OBSERVAÇÃO: Os inibidores de furina MI-113027 (trans-4-(aminometil) cicloexanocarboxil-arginina-valina-arginina-4-amidinobenzilamida), MI-113127 (trans-4-(guanidinometil) cicloexanocarboxil-arginina-valina-arginina-4-amidinobenzilamida) e MI-114822,23 (4-(guanidinometil) fenilacetil-arginina-terc.-leucina-arginina-4-amidinobenzilamida) utilizados neste estudo são exemplos de compostos antivirais selecionados para teste. O inibidor de furina MI-1148 foi utilizado como controle negativo no ensaio de citotoxicidade e como controle positivo no ensaio antiviral.

  1. Dissolva compostos antivirais em um solvente apropriado. Sempre que possível, use água estéril para evitar efeitos citotóxicos. Dimetil sulfoxido ou metanol podem ser usados até 2% (v/v). Recomenda-se o uso de soluções estoque de 10 mM em água estéril.
  2. Armazene as soluções estoque a -20 °C, dependendo da estabilidade e solubilidade, salvo indicação em contrário pelo fabricante.

3. Cultura celular

  1. Cultive células U4.4 em meio Leibovitz L-15 suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% de aminoácidos não essenciais MEM, 1% de caldo de triptose fosfato, 1% de glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) (densidade de semeadura: aproximadamente 1 × 106 células/frasco T25, volume de cultura: 5 mL). Mantenha as células a 28 °C. Passe as células U4.4 numa proporção de 1:6 uma vez por semana, mas ajuste as densidades de semeadura conforme as necessidades experimentais.
    NOTA: Linhagens celulares adicionais, como células C6/36, também são compatíveis com este protocolo. Meios e suplementos alternativos podem ser utilizados conforme apropriado. A inclusão de antibióticos é opcional e pode ser omitida.
  2. Cultive células de rim de hamster bebê (BHK-21) em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de FBS, 1% de glutamina ou Equilíbrio estático, ΣFx=0, gráfico, análise de equilíbrio de forças, diagrama de estabilidade mecânica.‑alanil‑Equilíbrio estático, ΣFx=0, gráfico, análise de equilíbrio de forças, diagrama de estabilidade mecânica.‑glutamina e 1% de Pen/Strep (densidade de semeadura: aproximadamente 1 × 106 células/frasco T75, volume de cultura: 10 mL). Mantenha as células a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO2. Passe as células numa proporção de 1:12 a cada 4-5 dias, com flexibilidade para modificar as densidades de semeadura conforme necessário.
  3. Assegure-se de que as células permaneçam saudáveis e em proliferação ativa.

4. Produção do vírus

  1. Preparação de estoques de SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) em células BHK-21.
    1. Cultive células BHK-21 (densidade de semeadura: aproximadamente 1 × 105 células/bem, volume de cultivo: 500 µL) em uma placa de cultivo celular transparente de 24 poços, sob as condições descritas acima.
    2. Quando atingirem cerca de 90% de confluência (confluência-alvo: aproximadamente 2 × 105 células), transfecte as células BHK-21 com o plasmídeo SFV6-2SG-mCherry utilizando um reagente de transfeção em meio de infecção (DMEM suplementado com 1% de Pen/Strep e 0,2% de albumina sérica bovina). Para isso, dilua 1 µL do reagente de transfeção em 25 µL de meio com baixo teor de soro.
    3. Em um tubo separado, dilua 0,5 µg de DNA plasmidial e 1 µL de um aditivo proprietário em 25 µL de meio com baixo teor de soro. Adicione a solução de DNA diluída à solução contendo o reagente de transfeção diluído e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, adicione 50 µL do complexo resultante às células.
      NOTA: Outros reagentes de transfeção podem ser utilizados, desde que compatíveis com a linhagem celular específica, e as instruções podem variar conforme o reagente empregado.
    4. 48 h após a transfeção, colete o sobrenadante contendo o vírus com uma pipeta, alíquotas de 250 µL por tubo livre de DNA/RNA e armazene a -80 °C.
  2. Titulação pelo ensaio de TCID50.
    1. Cultive células BHK-21 (densidade de semeadura: aproximadamente 2 × 104 células/bem, volume de cultivo: 100 µL) em uma placa de 96 poços de qualidade para imagem preta, sob as condições descritas acima.
    2. Descongele uma alíquota do vírus, prepare diluições seriadas decimais da amostra viral em meio de infecção (15 µL da amostra de vírus + 135 µL de meio de infecção), descarte o meio antigo e adicione 100 µL das diluições às células.
    3. Incube as células por 1 h a 37 °C em um incubador umidificado contendo 5% de CO₂ e, posteriormente, substitua o inóculo por 100 µL de meio de infecção fresco.
    4. 48 h após a infecção (hpi), avalie a replicação viral por meio da medição de fluorescência utilizando um leitor de placas com multimodo de imagem (descrição detalhada na seção 7) e determine o efeito citopático causado pela infecção viral. Calcule o valor de TCID50 com base no método de Reed-Muench28 e converta em títulos virais estimados (PFU/mL) utilizando a aproximação padrão baseada na distribuição de Poisson, segundo a qual 1 TCID50 corresponde a 0,7 PFU.

5. Determinação da citotoxicidade

  1. Cultive células U4.4 (densidade de semeadura: aproximadamente 3 × 104 células/poço, volume de cultura: 100 µL) em uma placa de cultura celular transparente de 96 poços sob as condições descritas anteriormente.
    NOTA: Os poços externos (linhas A e H; colunas 1 e 12) foram semeados com células, mas excluídos da análise experimental para evitar efeitos de borda, incluindo evaporação aumentada.
  2. Quando atingirem 90% de confluência (confluência-alvo: aproximadamente 6 × 104 células), trate as células com 100, 50, 25 e 12,5 µM dos inibidores de furina MI-1130 e MI-1131 em um volume total de 100 µL. Adicione MI-1148 (nas mesmas concentrações de MI-1130 e MI-1131), células não tratadas e células tratadas com água como controles negativos, e ionomicina (100 µM no ensaio) como controle positivo para citotoxicidade.
  3. Após 48 h de tratamento (hpt), avalie a viabilidade celular utilizando um ensaio luminescente baseado na quantificação de ATP. Adicione um volume igual do reagente do ensaio luminescente a cada poço (1:1 em relação ao meio de cultura), agite a placa por 2 min para garantir a lise celular e incube por 10 min no escuro antes de medir a luminescência.
    NOTA: Outros ensaios de viabilidade celular baseados em diferentes princípios de detecção também podem ser utilizados.
  4. Registre a luminescência em uma placa de 96 poços preta ou branca utilizando o leitor multimodal.

6. Infecção viral e tratamento com um composto antiviral

  1. Cultive células U4.4 (densidade de semeadura: aproximadamente 3 × 104 células/poço, volume de cultura: 100 µL) em uma placa de 96 poços preta para imagem, sob as condições descritas acima.
    NOTA: Os poços externos (linhas A e H; colunas 1 e 12) foram semeados com células, mas excluídos da análise experimental para evitar efeitos de borda, incluindo evaporação aumentada.
  2. Infecte as células (confluência-alvo: aproximadamente 6 × 104 células) com SFV-mCherry em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 em meio L-15 não suplementado, utilizando um volume de inoculação de 100 µL, e incube por 1 h a 28 °C.
    NOTA: Apenas estoques de vírus repórter de baixo número de passagens devem ser utilizados, especialmente ao trabalhar com MOIs muito baixos e infecções de vários dias.
  3. Dilua os inibidores de furina MI-1130, MI-1131 e MI-1148 para concentrações finais de 100, 50, 25 e 12,5 µM em uma placa separada de 96 poços com fundo em V, utilizando meio L-15 suplementado. Prepare 110 µL por poço para permitir uma sobra de 10% e transfira 100 µL (volume final) para as células. Para os controles, utilize células infectadas tratadas com o solvente dos compostos antivirais e células infectadas contendo apenas o vírus como controle negativo. Células não infectadas e não tratadas também devem ser adicionadas para medir a fluorescência de fundo.
  4. Após o período de infecção de 1 h, remova o inóculo e transfira 100 µL dos inibidores de furina diluídos das placas de fundo em V para as placas pretas para imagem.
  5. Incube as células a 28 °C.

7. Imagem de fluorescência em células vivas, análise quantitativa de imagens e apresentação de dados

  1. Medição da expressão do repórter viral por microscopia de fluorescência (consulte Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 e Supplementary Figure 7 para configuração do programa).
    1. Após 24 e 48 hpi, marque os núcleos celulares adicionando 8 µL de uma solução de contramarcador nuclear permeável às células por poço. Incube por 30 min a 28 °C.
      NOTA: A infecção pode ser monitorada em múltiplos pontos temporais. No entanto, as medições realizadas 48 h após a infecção fornecem o sinal mais forte (consulte Supplementary Figure 8) e permitem avaliar os efeitos antivirais de forma mais confiável. Leituras em 24 h ou em pontos intermediários são viáveis, mas prolongar a incubação além de 48 h aumenta o risco de supercrescimento celular. Selecione uma confluência celular apropriada no início do experimento para garantir que as células não fiquem superconfluentes no momento escolhido para a leitura. Isso evitará a obstrução de uma contagem celular precisa.
    2. Após a incubação (e além da tampa transparente), adicione uma folha selante transparente cobrindo a parte superior da placa para segurança.
      NOTA: Ao usar um dispositivo de imagem, é essencial selecionar o tipo correto de placa. A iluminação, o tempo de integração e os ajustes de ganho variarão conforme o gene repórter. Recomenda-se fortemente realizar medições preliminares para determinar os parâmetros ideais. Os ajustes iniciais de iluminação, integração e ganho utilizados para estabelecer o protocolo sob as condições dadas estão descritos na Supplementary Figure 2, onde a configuração do programa é detalhada.
    3. Adquira imagens de todo o poço utilizando costura de imagens (quatro campos por poço com aumento de 4x) usando o leitor multimodal.
    4. Meça a intensidade de fluorescência vermelha utilizando um cubo de filtro Texas Red (Excitação: 586/15 nm; Emissão: 647/57 nm).
    5. Determine a contagem total de células utilizando o canal DAPI com os seguintes parâmetros (Excitação: 377/50 nm; Emissão: 447/60 nm).
  2. Análise quantitativa de imagens (consulte Supplementary Table 1 para os dados brutos).
    NOTA: Para as medições de fluorescência, foi utilizado um leitor de microplacas com capacidade de imagem. Os parâmetros detalhados usados neste ensaio podem ser encontrados na Supplementary Figure 2.
    1. Processe as imagens utilizando um software apropriado de análise de imagens.
    2. No painel de redução de dados, selecione Costura de Imagem para os canais DAPI e Texas Red para criar uma única imagem a partir dos poços.
    3. Adicione Estatísticas de Imagem e selecione Intensidade Total no canal Texas Red Costurado. Aplique Pré-processamento de Imagem para remover o ruído de fundo do canal DAPI Costurado.
    4. Execute Análise Celular no canal DAPI Costurado pré-processado.
    5. Calcule a intensidade média de fluorescência vermelha por célula subtraindo a fluorescência média dos poços controle não infectados e não tratados de cada poço tratado, e em seguida dividindo o resultado pela contagem total de células no poço correspondente.
  3. Solução de problemas
    1. Monitore a estabilidade do foco durante a medição, especialmente em aquisições de imagem longas ou ao usar placas sensíveis à temperatura.
    2. Ative o foco automático e aumente a frequência do foco automático se for observada deriva de foco. Reduza a velocidade de aquisição ou permita que as placas equilibrem à temperatura do equipamento antes da aquisição de imagens, caso a deriva persista.
    3. Utilize placas de qualidade para imagem para garantir qualidade de sinal consistente durante a aquisição. Evite vazamento de sinal (bleed-through) e superexposição evitando iluminação excessiva e tempos longos de integração.
    4. Reduza a intensidade de excitação, encurte o tempo de integração ou diminua o ganho até que a saturação do sinal seja evitada. Verifique se os canais do fluoróforo estão bem separados e ajuste as configurações dos filtros conforme necessário.
      NOTA: O vazamento entre DAPI e mCherry é geralmente baixo, mas depende do construto repórter utilizado (por exemplo, GFP).
    5. Evite confluência excessiva das células para manter a cinética de infecção adequada e a sensibilidade do ensaio. Caso ocorra confluência excessiva, reduza o tempo de incubação antes da medição.
    6. Monitore os efeitos dos corantes na viabilidade celular e na qualidade do sinal, especialmente em altas concentrações. Reduza a concentração do corante ou encurte os tempos de incubação se for observada toxicidade ou fundo excessivamente saturado relacionado ao corante.
    7. Prepare e armazene os corantes conforme as recomendações do fabricante para manter a estabilidade do sinal.

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Resultados

Neste trabalho, apresenta-se um protocolo detalhado para monitorar a disseminação de alfavirus e avaliar compostos antivirais (por exemplo, inibidores da furina) utilizando microscopia de fluorescência em formato de placa de múltiplos poços. Para demonstrar a visualização dos efeitos inibitórios sobre a expressão do marcador viral, três inibidores da furina previamente sintetizados foram selecionados para testes na linhagem celular aedina U4.4: MI-1148, MI-1130 e MI-1131. Uma visão geral do fluxo experimental é ilustrada...

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Discussão

A capacidade de observar a replicação de alphavírus em tempo real oferece uma perspectiva sequencial e cumulativa sobre testes convencionais de ponto final. Este protocolo de imagem celular viva em múltiplos momentos é um modelo útil para o estudo de alphavírus, pois fornece uma plataforma dinâmica para observar a disseminação viral.

O sucesso deste protocolo depende de vários parâmetros. Primeiramente, é importante avaliar a citotoxicidade dos compostos antes do ensaio antiviral para descarta...

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Divulgações

Os autores não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos ao Prof. Dr. Andres Merits, da Universidade de Tartu, Estônia, e ao Prof. Dr. Andreas Pichlmair, da Universidade Técnica de Munique, Alemanha, pela disponibilização do plasmídeo pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Agradecemos à Prof. Dra. Stefanie Becker, da Universidade de Medicina Veterinária de Hanôver, Alemanha, pelas células C6/36. Agradecemos ao Prof. Dr. Torsten Steinmetzer, da Universidade de Marburgo, Marburgo, Alemanha, pela disponibilização dos inibidores de furina. Este trabalho foi apoiado pelo programa Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz do Ministério Hesseniano de Ensino Superior, Pesquisa e Artes, por meio do Centro LOEWE de Genômica da Biodiversidade Translacional (LOEWE-TBG), com o código de financiamento: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, e pelo BMFTR (Projeto ASCRIBE – Número do Convênio 01KI2024).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina Bovina Fração V, pH 7,0SERVA Electrophoresis11930.03
DMEM BenchStableThermo Fisher ScientificA4192101
Células BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Alemanha603126
FRASCO DE CULTIVO CELULAR, 50 mL, 25 cm2, PS, tampa de rosca com filtro vermelho, transparente, CELLSTAR, TC, estérilGreiner Bio-One690175
Placa de microcultivo celular, 24 poços, PS, fundo F, (poço tipo chaminé), transparente, CELLSTAR, TC, tampa com anéis anti-condensação, estérilGreiner Bio-One662160
Placa de microcultivo celular, 96 poços, PS, fundo F, (poço tipo chaminé), µCLEAR, preta, CELLSTAR, TC, tampa com anéis anti-condensação, estérilGreiner Bio-One655090
Placa de microcultivo celular, 96 poços, PS, fundo F, (poço tipo chaminé), transparente, CELLSTAR, TC, tampa com anéis anti-condensação, estérilGreiner Bio-One655180
Placa de microcultivo celular, 96 poços, PS, fundo V, transparenteGreiner Bio-One651101
Escova para raspagem celularVWR734-2602
Ensaio Colorimétrico de Viabilidade Celular CellTiter-GloPromegaG7573
Leitor Multimodal de Imagens Celulares Cytation 5Biotek
Cubo de filtro DAPI 1225100Biotekex: 377/50 nm; em: 447/60 nm
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Soro Fetal BovinoFisher Scientific11550356
Inibidor de furina MI-1130Este estudo
Inibidor de furina MI-1131Este estudo
Inibidor de furina MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Software Gen5 PrimeBiotek
Sal de Ionomicina com Cálcio, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
Meio Leibovitz L-15, suplemento GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
Reagente de transfeção Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
Ácidos aminoácidos não essenciais MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Placa de microcultivo, PS, 96 poços, fundo F, (poço tipo chaminé), preta, Fluotrac, ligação médiaGreiner Bio-One655076
Reagente NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Universidade de Tartu, Estônia) e Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Universidade Técnica de Munique, Alemanha)
Cubo de filtro Texas Red 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Caldo de Triptose Fosfato Thermo Fisher Scientific18050039
Células U4.4Instituto Friedrich-Loeffler, Instituto Federal de Pesquisa em Saúde Animal, Greifswald, Alemanha
Selante Viewseal, transparenteGreiner Bio-One676070

Referências

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  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
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