Geração de um modelo baseado em organoides prostáticos de camundongos para estudar as interações hospedeiro-patógeno

Summary

Este protocolo descreve a geração de um modelo murino baseado em organoide prostático cultivado em 2D. Inclui dissociação organoide, semeadura celular, diferenciação, avaliação da integridade epitelial e infecção in vitro com Escherichia coli uropatogênica. O modelo oferece acessibilidade apical e é adequado para estudar interações hospedeiro-patógeno, superando limitações dos sistemas organoides 3D tradicionais.

Abstract

Homens idosos são altamente afetados por doenças prostáticas, como hiperplasia benigna prostática, prostatite e câncer de próstata. Juntas, essas condições contribuem significativamente para a carga global de saúde e são uma das principais causas de doenças nos homens. Modelos organoides transformaram a modelagem de doenças ao permitir a replicação de características-chave da estrutura e função epitelial in vitro. No entanto, a estrutura de lúmen fechado dos organoides limita o acesso experimental à superfície apical, dificultando estudos das interações hospedeiro-patógeno. Para superar esses desafios, geramos um sistema de cultura fisiologicamente relevante, no qual células derivadas de organoides prostáticos de camundongos são semeadas como um modelo bidimensional (2D). Essa abordagem mantém características epiteliais essenciais enquanto proporciona acesso direto à superfície apical. Este protocolo passo a passo descreve a dissociação de organoides prostáticos maduros de camundongos e as condições ideais de semeadura para apoiar a inserção, proliferação e diferenciação celular. A microscopia de imunofluorescência confirmou a expressão de marcadores específicos da próstata no modelo baseado em organoides e demonstrou uma representação precisa da organização celular do tecido prostático. Medições TEER, juntamente com F-actina e coloração por junção apertada, confirmaram ainda mais a diferenciação celular e a formação de barreiras. A infecção do modelo com Escherichia coli uropatogênica (UPEC) demonstrou sua utilidade na investigação das interações hospedeiro-patógeno. Esse modelo oferece uma plataforma valiosa para investigar a biologia epitelial da próstata e os mecanismos da doença, sendo particularmente adequado para estudar as interações hospedeiro-patógeno e avaliar potenciais estratégias terapêuticas.

Introduction

A glândula prostática é um pequeno órgão localizado abaixo da bexiga, que circunda a uretra. É um órgão essencial do trato reprodutivo masculino, e sua principal função é produzir o fluido prostático. Esse fluido representa até 30% do plasma seminal e é fundamental para nutrir e proteger o esperma durante sua jornada pelo trato reprodutor^{feminino 1}. Doenças da próstata, como prostatite, hiperplasia benigna da próstata e câncer de próstata, são altamente prevalentes e representam um peso significativo para a saúde mundial 2,3,4,5. Enquanto a hiperplasia benigna da próstata e o câncer de próstata estão sendo amplamente estudados, a prostatite, e especialmente a prostatite bacteriana, permanecem relativamente pouco estudadas. A prostatite afeta até 16% dos homens no^{mundo globalmente 6,7}, sendo que infecções bacterianas representam aproximadamente 10% dos casos. Apesar de sua prevalência, a prostatite bacteriana ainda é pouco compreendida. Cepas de Escherichia coli (E. coli), especificamente E. coli uropatogênica (UPEC), são a principal causa de prostatite^{bacteriana 8,9}.

A pesquisa sobre os mecanismos moleculares da infecção prostática permanece limitada pela ausência de modelos in vitro fisiologicamente relevantes. A maioria dos estudos sobre doenças da próstata tradicionalmente se baseou em linhagens celulares ou modelos animais. Em particular, linhagens celulares cancerígenas ou transformadas, como LNCaP ou RWPE-1, têm sido amplamente usadas para modelar doenças prostáticas e resposta ao^tratamento 10,11,12,13. No entanto, esses modelos carecem de composição celular e da complexidade de um epitélio prostático saudável ou cancerígeno. Além disso, muitos outros estudos empregaram modelos animais (principalmente modelos de camundongos) para estudar diferentes hipóteses sobre infecção prostática, resposta imune, crescimento tumoral prostático e metástase 14,15,16,17. Embora esses modelos tenham sido os mais avançados e informativos até agora, normalmente levantam questões éticas, exigem tempo e recursos substanciais e podem ser caros. Alternativamente, explantações de tecido ex vivo e culturas celulares primárias também têm sido usadas para estudos de curto prazo sobre respostas teciduais a medicamentos ou desenvolvimento de câncer 18,19,20. No entanto, esses modelos têm uma vida útil limitada, e a disponibilidade de tecido humano fresco é frequentemente limitada.

Culturas organoides tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco adultas surgiram como uma alternativa promissora para modelar tecidos epiteliais in vitro. Ao contrário das linhagens celulares convencionais, os organoides mantêm características-chave do epitélio original, como heterogeneidade celular, arquitetura específica do tecido e características^funcionais 21,22,23. Ao contrário das culturas celulares primárias ou explantações ex vivo, as culturas organoides podem ser expandidas e liberadas por um longo período de tempo sem se tornarem senescentes. Essas propriedades tornam os sistemas organoides particularmente adequados para estudar doenças e interações hospedeiro-patógeno em um contexto fisiologicamente relevante. Organoides prostáticos foram gerados a partir de tecidos humanos saudáveis e cancerosos, bem como de modelos de camundongo, e usados principalmente em pesquisas sobre câncer de próstata 24,25,26. No entanto, para estudos de infecção, a estrutura 3D dos organoides apresenta um desafio significativo, principalmente devido ao acesso limitado à superfície celular luminal. Tradicionalmente, organoides 3D intactos foram infectados seja por microinjeção do agente patogênico, seja por dissociação inicial do organoide em fragmentos ou células isoladas antes da incubação com o patógeno²³. Aqui, variabilidade no tamanho e na estrutura 3D podem afetar a reprodutibilidade e o throughput. Como alternativa, organoides apical-out oferecem uma forma de superar a limitação da inacessibilidade do lúmen. O cultivo de organoides em suspensão, seja em placas de cultura de tecidos de fixação ultra-baixa ou em superfícies revestidas com surfactantes não adesivos, induz uma inversão da polaridade dos organoides. Como resultado, a superfície apical fica voltada para fora, permitindo acesso direto para estudos de infecção por^{patógenos 27,28}. No entanto, essas culturas não podem ser mantidas a longo prazo, e a variabilidade no tamanho dos organoides e no número de células complica a determinação da multiplicidade de infecções (MOI). Além disso, os mecanismos subjacentes à reversão da polaridade e seus efeitos nas células organoides ainda não são totalmente compreendidos. Para superar as limitações dos organoides como modelos de infecção in vitro, modelos baseados em organoides acessíveis apicalmente foram desenvolvidos usando organoides de órgãos como estômago, intestino ou^{pulmão 29,30,31}. Esses sistemas preservam as principais características epiteliais e permitem manipulação, obtenção de imagens e exposição controlada a patógenos e/ou medicamentos. No entanto, as condições de cultura que permitem a diferenciação celular nem sempre se traduzem das culturas organoides para os modelos de cultura 2D^31,32.

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar um modelo epitelial prostático acessível apicamente usando organoides prostáticos de camundongo. Esse modelo foi previamente desenvolvido e validado em nosso laboratório, onde demonstramos sua forte semelhança com o tecido prostático nativo e sua relevância para estudos de biologia de infecções envolvendo a UPEC³². O sistema imita de perto a composição celular e a polaridade do epitélio da próstata, ao mesmo tempo em que oferece maior acessibilidade para manipulação experimental. Além disso, demonstramos sua aplicabilidade para estudar as interações hospedeiro-patógeno na próstata, oferecendo uma alternativa mais fácil de tratar aos modelos in vivo e um sistema fisiologicamente mais relevante do que as linhas celulares convencionais ou os modelos organoides 3D.

Protocol

Declaração ética: Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com as diretrizes de cuidado e uso animal da Universidade de Würzburg e foram aprovados sob as regulamentações institucionais e governamentais relevantes. Apenas camundongos WT que haviam sido eutanasiados em nosso instituto por outros grupos de pesquisa para fins independentes foram usados neste estudo. Nenhum animal foi sacrificado especificamente para esse trabalho, de acordo com os princípios das 3R (substituição, redução e refinamento).

NOTA: O protocolo apresentado aqui é baseado em um estudo anterior publicado pelos^{autores 32}. Todas as etapas descritos aqui devem ser realizadas em um armário de biossegurança estéril, utilizando as técnicas assépticas aplicáveis e com o uso de equipamentos de proteção individual adequados. Organoides próstatas murinos foram gerados a partir de camundongos C57BL/6 e mantidos em cultura 3D, conforme descrito^{anteriormente 25,26}. Para seguir os princípios 3R, próstatas de camundongos foram doadas pela instalação animal a partir de camundongos WT ingênuos não tratados (pelo menos 6 meses) sacrificados por outros motivos. Brevemente, as próstatas de camundongos foram trituradas e digeridas em duas etapas usando colagênase e a Enzima TrypLE Express. As células foram então semeadas em gotas de matriz extracelular (ECM) para gerar os organoides 3D. O meio de cultura era adicionado à cultura e reabastecido a cada 3 dias. Culturas organoides 3D eram realizadas uma vez por semana e usadas para semeadura 2D a partir da passagem 3. Organoides prostáticos de camundongo, com uma semana de idade, foram usados para semear o modelo baseado em organoides em uma superfície 2D, seguindo o protocolo atual. Não é necessário revestir placas de cultura de tecidos com proteínas ECM para esse protocolo.

1. Geração do modelo baseado em organoides prostáticos

1. Isolamento de organoides 3D
   1. Aspire o meio do número desejado de poços de organoides 3D a partir de uma placa de 24 poços. Substitua por 500 μL de adDMEM/F12+/+ por poço (veja a Tabela de Materiais).
   2. Use uma pipeta P1000 para interromper mecanicamente a queda do ECM. Colete a suspensão em um tubo cônico de 15 mL. Colete apenas no máximo dois poços por tubo.
   3. Complemente com adDMEM/F12+/+ até 10 mL. Com cuidado, inverta o tubo 3-4 vezes para misturar. Centrifuge a 450 x g por 5 minutos a 4 °C.
2. Perturbação de organoides 3D em células individuais
   1. Aspire o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 2 mL de TrypLE Express Enzyme pré-aquecido (37 °C) suplementado com 10 μM de RHOKi.
   2. Incube em banho-maria a 37 °C por 15 minutos. Use uma pipeta P1000 para misturar a suspensão de células a cada 5 minutos.
      NOTA: Verifique a suspensão celular sob um microscópio invertido usando um objetivo 4x para verificar se as células são em sua maioria únicas. Pequenos aglomerados de 2-3 células são aceitáveis. Normalmente, 15 minutos de incubação são suficientes, mas isso pode ser estendido se necessário.
   3. Complemente com 10 mL de adDMEM/F12+/+. Com cuidado, inverta o tubo 3-4 vezes para misturar. Centrifuge a 450 x g por 5 minutos a 4 °C.
3. Suspensão de célula única com revestimento
   1. Aspire o sobrenadante sem mexer na bola. Ressuspenda o pellet celular em meio de cultura suplementado com 10 μM RHOKi (300 μL de meio de cultivo por poço de organoides 3D usados na etapa 1.1.1).
      NOTA: O meio de cultivo é composto por: Advance Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-acetilcisteína, meio condicionado Noggin 10%, 10% R-spondin 1 meio condicionado, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-dihidrotestosterona (DHT), 0,2 μM TGFβi e 100 ng·^mL-1 Primocina ( veja Tabela de Materiais). Para experimentos de infecção, use meio de cultivo sem Primocina.
   2. Conte o número de células na suspensão usando uma câmara de contagem de Neubauer.
   3. Diluir a suspensão celular em meio de cultura suplementado com 10 μM de RHOKi até uma concentração de 62.500 células·^mL-1. Use 200 μL da suspensão da célula por poço para semear em placas de 48 poços (cultura de tecido tratada do fabricante, ver Tabela de Materiais) ou 300 μL por poço em lâminas μ com câmara (ver Tabela de Materiais). Coloque a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de_CO2.
      NOTA: Cada poço de organoides 3D, usado no Passo 1.1.1. normalmente gera aproximadamente 200.000 células.
   4. Após um dia, a maioria das células individuais está conectada à superfície 2D. Mude o meio de cultura a cada 2-3 dias. A confluência é alcançada em até 7 dias.
      NOTA: Certifique-se de que o RHOKi seja adicionado apenas para a semeadura inicial e não para mudanças subsequentes de meio.
4. Diferenciando o modelo baseado em organoides.
   NOTA: Siga os próximos passos para obter um modelo diferenciado baseado em organoides enriquecido com células luminais.
   1. Adicione 10 nM de DHT à suspensão da célula (passo 1.3.3). Use substrato de cultura suplementado com 10 nM de DHT para mudanças subsequentes de meio (a cada 2-3 dias).
      NOTA: Se nenhum DHT for adicionado à suspensão celular (e mudanças subsequentes no meio), o modelo baseado em organoides será enriquecido com células basais.

2. Medições de resistência elétrica transepitelial (TEER)

1. Semeie a suspensão da célula organoide a uma concentração de 62.500 células·^mL-1, usando 300 μL (obtido no passo 1.3.3.) em uma lâmina PET μ de 8 poços com 40 eletrodos por poço (veja a Tabela de Materiais). Adicione 300 μL de meio de cultura, descrito em 1.3.1, a um dos poços sem células.
   NOTA: O poço sem células é usado como uma base para medições.
2. Conecte o μ-slide ao sistema de análise celular baseado em impedância (veja Tabela de Materiais) com a estação de 16 poços colocada dentro de um incubador de cultura de tecidos. Meça o TEER a 400 Hz por 7 dias. Mude o meio de cultura a cada 2-3 dias.

3. Coloração por imunofluorescência

NOTA: Para este método, certifique-se de que as células sejam semeadas em lâminas μ com câmara (veja Tabela de Materiais), que são compatíveis com aplicações de microscopia de alta resolução.

1. No momento selecionado, remova o substrato e lave as células 3 vezes com 1x PBS. Fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente (evite exposição à luz).
   ATENÇÃO: O paraformaldeído a 4% pode causar reação alérgica na pele, danos oculares graves e suspeita de causar câncer. Sempre use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados. Evite a inalação de poeira, vapores, gases, névoas, vapores ou sprays. Use luvas de proteção e garanta que as roupas contaminadas permaneçam no laboratório até que sejam devidamente descontaminadas. Descarte o conteúdo e recipientes por meio de uma instalação de descarte de resíduos aprovada.
2. Após a fixação, lave as células 3 vezes com 1x PBS (5 min cada). Permeabilize as células com 0,5% de Triton X-100 (veja Tabela de Materiais) por 15 minutos em temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: O Triton X-100 causa irritação na pele e sérios danos oculares. É muito tóxico para a vida aquática, com efeitos duradouros e pode causar perturbações endócrinas no ambiente. Ao manusear, use luvas de proteção, proteção para olhos e rosto. Descarte o conteúdo e recipientes por meio de uma instalação de descarte de resíduos aprovada. Evite liberar no ambiente.
3. Lave as células duas vezes com 1x PBS (5 min cada). Bloqueie as células com tampão bloqueante (1% de BSA em PBS, veja Tabela de Materiais) por 30 minutos em temperatura ambiente.
4. Dilua os anticorpos primários no tampão bloqueante (1% de BSA em 1x PBS) e incube com as células durante a noite a 4 °C em uma plataforma de balanço. No dia seguinte, incube por 1 hora em temperatura ambiente. (veja a Tabela de Materiais para diluições de anticorpos).
   NOTA: Para a coloração de F-actina com falloidina ou membrana plasmática com CellMask (veja Tabela de Materiais), pule a etapa 3.4.
5. Lave as células 3 vezes com 1x PBS (5 min cada). Dilua os anticorpos secundários, falloidina ou CellMask (veja Tabela de Materiais) em tampão bloqueante (1% de BSA em 1x PBS) e incube com as células por 1 hora em temperatura ambiente.
6. Lave as células 3 vezes com 1x PBS (5 min cada). Incube as células por 15 minutos em temperatura ambiente com Hoechst (veja Tabela de Materiais) diluído em 1x PBS para corar os núcleos.
7. Lave as células 3 vezes com 1x PBS (5 min cada) e deixe as células com 1x PBS. Armazene a 4 °C.
8. Imagine as lâminas de μ com câmara (veja Tabela de Materiais) em uma microscopia confocal de varredura a laser ou microscópio de fluorescência.
   NOTA: Imagens de visão geral podem ser adquiridas usando uma objetiva 20x em um microscópio de fluorescência para avaliar a eficiência e distribuição geral da infecção. Imagens de maior resolução foram obtidas usando um microscópio confocal equipado com uma objetiva de imersão em água de 40x para visualizar bactérias individuais ligadas ou internalizadas dentro das células epiteliais. Os fluoróforos eram excitados usando linhas de laser em 405, 499, 590 e 653 nm, dependendo dos fluoróforos utilizados. A emissão foi detectada com janelas de emissão ajustadas para 415 a 516 nm para Hoechst, 509 a 573 nm para GFP ou Alexa 488, 600 a 651 nm para mcherry ou Alexa 594, e 663 a 720 nm para Alexa 647. As pilhas Z foram adquiridas com um passo de 0,5 μm e cobrindo toda a espessura da camada epitelial. As imagens foram adquiridas com resolução de 1024 por 1024 pixels, com frequência de varredura de 400 Hz e média de quadros definida para 4, o que proporciona boa qualidade de imagem. A potência do laser e o ganho do detector foram mantidos constantes em todas as condições dentro do mesmo experimento. Todos os parâmetros de imagem, incluindo potência do laser, ganho do detector, velocidade de varredura e média, devem ser otimizados e ajustados conforme necessário, dependendo do microscópio confocal utilizado.

4. Infecção bacteriana por E. coli uropatogênico (UPEC)

NOTA: Certifique-se de usar um modelo baseado em organoides mantido por 7 dias sem Primocin (veja a Tabela de Materiais) para as etapas a seguir.

A cepa uropatogênica E. coli UTI89, que expressa constitutivamente uma proteína mCherry do plasmídeo pFPV-mCherry (resistente à ampicilina), foi utilizada neste estudo.

ATENÇÃO: Ao manusear patógenos infecciosos (Nível de Biossegurança 2), use luvas e proteção adequada para os olhos e o rosto. Sempre use um jaleco totalmente abotoado. Realize todos os procedimentos dentro de um gabinete certificado de segurança biológica. Descontamine as superfícies de trabalho e lave bem as mãos após manusear materiais biológicos. Colete resíduos BSL-2 em recipientes designados para risco biológico, adequados para autoclavagem. Descontamine os resíduos antes do descarte por meio de autoclaving ou outro método adequado de descontaminação.

1. Três dias antes do experimento de infecção, estrace a cepa UPEC em uma placa de ágar LB suplementada com o antibiótico correspondente (ampicilina 100 μg·^mL-1 foi usada neste protocolo) e incube de 16 a 24 horas a 37 °C.
   ATENÇÃO: Alguns antibióticos podem causar reações alérgicas ou irritação ao contato e contribuir para a resistência antimicrobiana se descartados incorretamente. Sempre prepare e adicione antibióticos dentro de um armário de segurança biológica, usando o equipamento de proteção individual adequado (luvas e proteção ocular). Descarte soluções contendo antibióticos como resíduos químicos por meio de uma instalação aprovada para descarte de resíduos.
2. Dois dias antes do experimento de infecção, inocule 3 mL de caldo LB suplementado com o antibiótico correspondente (ampicilina 100 μg·^mL-1) usando uma única colônia UPEC da placa de ágar (passo 4.1). Incube estaticamente a 37 °C por 12-16 horas.
3. Um dia antes do experimento de infecção, faça vórtice da cultura bacteriana do passo 4.2 e meça seu OD₆₀₀. Calcule o volume dessa cultura necessário para inocular 3 mL de caldo LB suplementado com ampicilina (100 μg·^mL-1) para um OD_{inicial de} 0,05 usando a seguinte fórmula: Volume (μL) = (0,05 * 3.000 μL) / OD_{medido 600}. Adicione o volume calculado da cultura a partir do passo 4.2. para o caldo fresco LB e incubar estaticamente a 37 °C por 24 horas.
   NOTA: O OD₆₀₀ da cultura overnight do passo 4.2 deve estar entre 1.7 e 2.2.
4. No dia da infecção, faça vórtice da cultura bacteriana do passo 4.3 e meça seu OD₆₀₀. Colhe OD₆₀₀₁ da cultura, depois centrifuge a 12.000 x g por 2 minutos em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante.
5. Resuspenda em 1 mL de meio de cultura organoide sem primocina sem DHT. Dilua para um MOI de 100.
   NOTA: Cada poço em uma placa de 48 poços é considerado como tendo aproximadamente 150.000 células no dia 7. Essa estimativa foi obtida contando células em um bem antes da infecção em múltiplos experimentos. Para ajustar corretamente o MOI, recomenda-se semear um poço extra para contar células antes da infecção. Para determinar o volume de suspensão bacteriana (passo 4.4) necessário, multiplique o número de células por poço pelo MOI para obter o número total de bactérias necessárias por poço, depois divida esse número pela concentração bacteriana (8 × 10⁵ bactérias/μL) para obter o volume em μL.
6. Substitua o meio de cultivo do modelo baseado em organoides por meio de cultivo contendo bactérias. Ajuste o volume de acordo com a superfície de cultura: use 200 μL por poço para placas de 48 poços e 300 μL por poço para μ-slides. Incube por 1 hora em incubadora de culturas celulares a 37 °C e 5% de CO₂.
7. Após o período de incubação, aspire o meio contendo bactérias do modelo baseado em organoides. Lave o poço 3 vezes com adDMEM/F12+/+ para remover bactérias extracelulares.
8. Adicione meio de cultivo contendo 50 μg·^mL-1 gentamicina para eliminar bactérias extracelulares. Incube por 30 minutos.
   NOTA: A concentração de gentamicina pode precisar ser ajustada dependendo da cepa bacteriana utilizada. Se for usada uma concentração superior a 50 μg·^mL-1, recomenda-se verificar a citotoxicidade celular.
9. Remova o meio e substitua por meio fresco suplementado com 10 μg·^mL-1 gentamicina pelo tempo restante da infecção.
   Processe as células infectadas para coloração por fluorescência, seguindo a seção 3, ou para quantificação por citometria de fluxo, seguindo a seção 5.

5. Quantificação da infecção por citometria de fluxo

1. Aspire o meio de cultura e lave as células 3 vezes com 1x PBS. Use 100 μL de Enzima Expressa TrypLE para desprender as células. Incube por 5-10 minutos até que todas as células se soltem.
   NOTA: Um poço de uma placa de 48 poços é suficiente por condição.
2. Recolha a suspensão da célula e transfira-a para um poço de uma placa de 96 poços (fundo cônico). Adicione 100 μL de buffer de citômetro de fluxo (1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA) por cima para inativar a Enzima Expressa TrypLE.
3. Centrifuge a placa de 96 poços a 450 x g por 5 minutos a 4 °C. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em 150 μL de buffer de citômetro de fluxo.
4. Adquirir e quantificar células infectadas usando o citômetro de fluxo (veja a Tabela de Materiais).
   NOTA: A citometria de fluxo foi realizada usando um laser de excitação de 488 nm e um filtro de emissão de 615/20 nm para detecção de células mCherry-positivas. Os dados foram adquiridos em alta taxa de fluxo (66 μL·min⁻¹), coletando pelo menos 10.000 eventos por amostra e incluindo apenas eventos com valores de altura de dispersão frontal maiores que 80.000. Células infectadas foram identificadas com base na fluorescência de mCherry em comparação com um controle não infectado (ingênuo), após exclusão de detritos e doublets. Um marcador de viabilidade (por exemplo, iodeto de propidium ou outras colorações vivas/mortas) pode ser incluído na estratégia de gate para avaliar a viabilidade celular. Isso pode ser particularmente útil ao trabalhar inicialmente com o modelo para garantir que a dissociação celular não afete negativamente as células.

Results

Esse protocolo descreve a geração de um modelo baseado em organoides do epitélio da próstata do camundongo que recapitula o tipo celular e a expressão transcricional do compartimento epitelial do tecido nativo. Esse modelo é gerado usando organoides 3D de células-tronco adultas gerados a partir de tecido prostático de camundongos adultos. Essas culturas organoides são então mantidas em cultura e aprovadas semanalmente. Para o modelo baseado em organoides, o primeiro passo no fluxo de trabalho (Figura 1A) começa usando organoides 3D com 7 dias de uso. Esse período de tempo é necessário para que atinjam tamanho e densidade celular adequados para semeadura subsequente em uma superfície 2D. Após a passagem, pequenos fragmentos de organoides (Figura 1B, Dia 0) foram semeados em ECM e deixados crescer. Com o tempo, eles crescem em grandes estruturas esféricas com um lúmen interno definido até o Dia 7 (Figura 1B). Após dissociar os organoides de 7 dias em células únicas, as células foram semeadas em uma placa tratada com cultura de tecido (Figura 1C, Dia 0) usando o mesmo meio de cultivo das culturas organoides 3D (1nM DHT) para formar uma monocamada. No primeiro dia, as células aderidas começaram a proliferar. Nos dias seguintes, a monocamada expandiu-se e atingiu confluência entre o dia 3 e o dia 5, conforme observado pela microscopia de campo claro (Figura 1C). Para caracterizar as mudanças morfológicas ao longo do tempo e monitorar o tempo em que o modelo baseado em organoides atinge a confluência, tingimos a membrana plasmática com CellMask e realizamos imagens de fluorescência em múltiplos pontos temporais (Figura 1D).

Como a sinalização dos receptores de andrógenos (AR) é um regulador chave da diferenciação celular na próstata, e a modulação da concentração de testosterona (ou DHT) no meio de cultura organoide demonstrou direcionar a diferenciação de células-tronco em células basais ou^{luminais. 32}, ajustamos os níveis de DHT no meio de cultura para promover o enriquecimento de células luminais (DHT 10 nM) ou basais (sem DHT, Controle; Método1, Figura 2A). Como mostrado na Figura 2 (B-F), não foram observadas diferenças significativas no crescimento ou confluência celular. Como esperado, na condição controle (meio de cultivo organoide sem DHT), a maioria das células expressou citoceratina 5 (KRT5), um marcador das células-tronco basais prostáticas (Figuras 2B,E). Em contraste, apenas algumas células expressaram baixos níveis de CD24a, um marcador de células prostáticas luminais diferenciadas (Figuras 2B,F).

A suplementação com 1 nM de DHT, como descrevemos^{anteriormente 32}, resultou em uma população mista contendo células basais e luminais. No entanto, a expressão de CD24a permaneceu baixa, indicando diferenciação incompleta em células luminais (Figura 2C,F³²). Aumentar a DHT para 10 nM promoveu a diferenciação completa das células luminais, mantendo ainda algumas células basais após 7 dias de cultivo (Figura 2D-F). A diferenciação dos modelos baseados em organoides também pode ser avaliada usando microscopia de campo claro. Embora as diferenças entre as condições não sejam muito claras quando as células são esparsas (Dias 0 - 5, Figura 1C, Figura Suplementar 1A), a morfologia e aparência celular tornam-se distintas e perceptíveis entre as três condições de cultura por microscopia de campo claro no Dia 7 (Figura 1C, Figura Suplementar 1A,B). Na ausência de DHT, as células apareciam mais planas e de formato mais irregular, enquanto na DHT 10 nM, as células estavam compactas com uma disposição poligonal, semelhante a uma morfologia de paralelepípedos (Figura Suplementar 1B).

Notavelmente, culturas organoides 3D também passaram por mudanças morfológicas quando cultivadas em diferentes concentrações de DHT. Especificamente, observou-se um aumento claro dependente da dose no tamanho dos organoides, com os maiores organoides se formando na presença de 10 nM de DHT (Figura 1B, Figura Suplementar 2A,B). Esses resultados indicam que a via AR é crítica não apenas para a diferenciação celular, mas também para modular a dinâmica de crescimento dos organoides prostáticos de camundongo.

Para avaliar a integridade epitelial e a polarização dos modelos, realizamos medições de resistência elétrica transepitelial (TEER) no modelo baseado em organoides cultivado com DHT sem ou com 10 nM. Os valores de TEER aumentaram ao longo do tempo em ambas as condições, mas foram substancialmente maiores na presença de DHT de 10 nM (Figura 3A), indicando aumento da função da barreira epitelial. Esses resultados foram apoiados pela coloração por faloidina dos filamentos de actina, que normalmente são organizados em um anel apical nas junções célula-célula das células epiteliais da próstata luminal. Na condição DHT de 10 nM, o anel de actina apareceu mais definido em comparação com a condição controle, consistente com aumento da polaridade celular e da organização epitelial (Figura 3B). Além disso, a imunocoloração para zonula occludens 1 (ZO-1) revelou um aumento nas junções apertadas na condição DHT de 10 nM (Figura 3C), reforçando ainda mais a integridade da barreira epitelial e a diferenciação em direção a um fenótipo luminal. Projeções ortogonais revelam que organoides cultivados com DHT de 10 nM exibem polaridade epitelial bem definida (Figura Suplementar 3A). As células basais KRT5⁺ estão localizadas na parte inferior, e as células luminais CD24a⁺ estão distribuídas ao longo da camada epitelial, mostrando maior intensidade de coloração em direção ao lado apical. Essa arquitetura é semelhante à observada no tecido prostático de camundongo (Figura Suplementar 3B). Vale destacar que dados do Atlas de Proteínas Humanas mostram que esses marcadores têm localização comparável no tecido prostático humano, com células basais KRT5⁺ sob uma camada luminal CD24a⁺ (Figura Suplementar 3C)³³. Em contraste, células cultivadas sob controle ou em condições de DHT de 1 nM não apresentam uma separação espacial clara entre marcadores basais e luminais, e a altura da célula foi muito menor do que na condição de 10 nM (Figura Suplementar 3A). Isso indica que a suplementação de DHT a 10 nM promove a diferenciação e polarização epitelial no modelo 2D de forma comparável ao epitélio nativo da próstata. Como o modelo baseado em organoides cultivado com DHT de 10 nM se assemelha muito ao epitélio prostático nativo de camundongo (Figura 2D, Figura Suplementar 3A,B), ele serve como uma plataforma relevante para investigar as interações hospedeiro-patógeno. Para demonstrar a aplicabilidade do modelo, usamos infecções com UPEC, especificamente a cepa UTI89, uma das cepas UPEC mais comumente usadas no campo do trato genitourinário, como exemplo. Como mostrado na Figura 4A, as bactérias foram cultivadas em caldo LB por 24 horas (conforme descrito no Método 4) e incubadas com as células por uma hora. Bactérias extracelulares foram então eliminadas com gentamicina para quantificar a invasão e a replicação intracelular. Após a infecção do modelo baseado em organoides, a UPEC aderiu às células epiteliais em alto número (0 hpi; Figura 4B, painel esquerdo; Figura 4C). Depois, e após o tratamento com gentamicina (1 hpi), o número de células positivas para UPEC diminuiu significativamente, devido à morte das bactérias extracelulares (Figura 4B, painel central; Figura 4C). Com 24 hpi, o número de células infectadas permaneceu inalterado (Figura 4C), porém, a microscopia confocal mostrou que as bactérias intracelulares continuaram a se replicar, formando estruturas semelhantes a comunidades, semelhantes às descritas anteriormente no epitélio da bexiga (Figura 4B, painel direito). As células infectadas foram identificadas por fluorescência de mCherry usando controles não infectados (ingênuos) como referência, após exclusão de detritos e duplas (Figura Suplementar 4).

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho e evolução morfológica dos organoides prostáticos e dos modelos baseados em organoides ao longo do tempo. (A) Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental (Método 1). (B) Imagens em campo claro mostrando o desenvolvimento morfológico dos organoides prostáticos suplementados com DHT de 1 nM, capturadas nos dias 0, 1, 3, 5 e 7 (da esquerda para a direita). Barra de escala: 200 μm. (n = 3). (C) Imagens em campo claro do modelo baseado em organoides complementadas com DHT de 1 nM, capturadas nos dias 0, 1, 3, 5 e 7 (da esquerda para a direita). Barra de escala: 200 μm. (n = 3). (D) Imagens representativas de microscopia de imunofluorescência do modelo baseado em organoide suplementado com 1 nM de DHT e corado com CellMask (vermelho), nos dias 1, 3, 5 e 7 (da esquerda para a direita). Núcleos foram contra-coloridos usando Hoechst 33342 (azul). Barra de escala: 50 μm. (n = 3) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A DHT modula a diferenciação de linhagem no modelo baseado em organoides. (A) Representação esquemática das diferentes condições usadas para a diferenciação. (B-D) Imagens representativas de microscopia de imunofluorescência do modelo baseado em organoides cultivadas por 7 dias na ausência (Ctrl) ou presença de (C) 1 nM ou (D) 10 nM de DHT. As imagens foram capturadas nos dias 1, 3, 5 e 7 (da esquerda para a direita). Os modelos baseados em organoides foram corados para CD24a (marcador celular luminal, verde) e KRT5 (marcador basal celular, magenta). Núcleos foram contra-coloridos usando Hoechst 33342 (azul). Barra de escala: 50 μm. (n = 4). (E,F) Quantificação de imagem das células (E) KRT5⁺ e (F) CD24a⁺ no modelo baseado em organoides cultivadas sem DHT (Ctrl), 1nM ou 10nM. Os dados são mostrados como % de células positivas por campo de visão. Teste estatístico: ANOVA unidirecional com o teste post hoc de Tukey. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: O modelo baseado em organoides diferenciado com DHT de 10 nM mostra maior polarização celular em comparação ao controle. (A) Análise TEER do modelo baseado em organoides cultivado por 7 dias na ausência (Ctrl; rosa) e presença de DHT (10 nM; verde). Barras de erro representam SD (n = 3). Teste estatístico: ANOVA unidirecional com o teste post hoc de Tukey. (B,C) Imagens representativas de microscopia de imunofluorescência do modelo baseado em organoide cultivadas por 7 dias sem (Ctrl; cima) ou com 10 nM de DHT (base) e coradas para (B) F-actin (vermelho) e (C) ZO-1 (vermelho). Núcleos foram contra-coloridos usando Hoechst 33342 (azul). Barra de escala: 50 μm. (n = 3) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise da dinâmica da infecção no modelo baseado em organoides. (A) Representação esquemática do protocolo de infecção (seção 4). (B) Imagens representativas de microscopia de imunofluorescência mostrando o modelo baseado em organoide infectado às 0, 1 e 24 horas após a infecção (hpi; da esquerda para a direita). A UPEC é visualizada em vermelho. Núcleos foram contra-coloridos usando Hoechst 33342 (azul). Barra de escala: 50 μm. (n = 3). (C) Análise de citometria de fluxo de células UPEC-positivas (mCherry positivas, células infectadas) em 0, 1 e 24 hpi. A estratégia de gating é mostrada na Figura Suplementar 4. Barras de erro representam SEM (n = 3). Teste estatístico: ANOVA unidirecional com o teste post hoc de Tukey. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Evolução morfológica do modelo baseado em organoides ao longo do tempo. (A,B) Imagens em campo claro do modelo baseado em organoides na ausência (A) (Ctrl) e (B) presença de 10 nM DHT, capturadas nos dias 0, 1, 3, 5 e 7 (da esquerda para a direita). Barra de escala: 200 μm. (n = 3) Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: A concentração de DHT afeta o crescimento de organoides prostáticos 3D. (A) Imagens de campo claro do modelo baseado em organoides na ausência (Ctrl; cima) e presença de 10 nM DHT (embaixo), imagens nos dias 0, 1, 3, 5 e 7 (da esquerda para a direita). Barra de escala: 200 μm. (n = 3). (B) Quantificação do tamanho do organoide 3D no Dia 7 cultivado sob as três condições diferentes: sem DHT (Ctrl; rosa), 1 nM DHT (roxo) e 10 nM DHT (verde). Teste estatístico: ANOVA unidirecional com o teste post hoc de Tukey (n = 3). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Caracterização da morfologia dos organoides prostáticos e polaridade epitelial. (A) Projeções ortogonais de pilhas z confocais ilustrando a organização epitelial e a polaridade apical-basal sob diferentes concentrações de DHT (Ctrl, 1 nM e 10 nM DHT). Células basais foram coradas para KRT5 (magenta) e células luminais para CD24a (verde). Barra de escala: 50 μm.(B) Coloração imunofluorescente do tecido prostático de camundongo embutido em OCT mostrando marcadores epiteliais basais (KRT5, magenta) e luminais (CD24a, verde). Núcleos são contra-tingidos com DAPI (azul). Barra de escala: 50 μm. Resumidamente, fragmentos de tecido de camundongo foram fixados com 4% de PFA, desidratados durante a noite com 30% de sacarose e³² embutidos por OCT. As lâminas foram então reidratadas em PBS por 10 minutos e imunoscoloridas após a seção 3. (C) Análise imunohistoquímica da expressão proteica CD24a e KRT5 em tecido prostático humano (Painel C foi extraído do Banco de Dados do Atlas de Proteínas Humanas (versão 25.0; Human Protein Atlas proteinatlas.org), Uhlén, M. et al(2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Estratégia de rastreamento de citometria de fluxo para identificar células infectadas. As células foram inicialmente direcionadas com base na altura de dispersão lateral (SSC-H) versus altura de dispersão frontal (FSC-H) para excluir detritos, seguidas pelo gate no SSC-H versus área de dispersão lateral (SSC-A) para selecionar células individuais. Células mCherry-positivas (infectadas) foram então identificadas usando Contagens versus fluorescência PE-Texas Red-H (Histograma). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Uma variedade de doenças pode afetar a próstata, incluindo hiperplasia benigna da próstata, prostatite e câncer de próstata. Essas doenças são altamente prevalentes e influenciam significativamente a qualidade de vida dos^{pacientes 2}. Apesar de seu impacto significativo na saúde, nosso entendimento dessas doenças, especialmente dos mecanismos subjacentes e das respostas do hospedeiro em condições não cancerígenas, permanece limitado. Isso se deve em grande parte à falta de modelos experimentais fisiologicamente relevantes. Por um lado, linhagens celulares imortalizadas não capturam a complexidade ou o status de diferenciação do epitélio normal da próstata. Por outro lado, modelos animais, principalmente roedores, levantam preocupações éticas e não são econômicos. Uma abordagem alternativa é o uso de células primárias humanas ou explantações de tecido derivadas do paciente. No entanto, a disponibilidade limitada de tecido prostático fresco limita sua ampla aplicação. Essas limitações destacam a necessidade de outros sistemas in vitro que sejam fisiologicamente relevantes, fáceis de usar e experimentalmente gerenciáveis. Nesse contexto, a tecnologia de organoides de células-tronco adultas transformou a modelagem de doenças. Essas culturas 3D têm a capacidade de se auto-organizar, preservando a identidade epitelial e a diversidade celular^epitelial 23,34,35,36,37,38. Embora sua arquitetura 3D tenha possibilitado aplicações em pesquisa do câncer, testes de medicamentos e medicina^regenerativa 23,34,35,36,37,38,39,40,41, sua estrutura fechada, com a superfície apical voltada para dentro, apresenta desafios práticos para o acesso experimental, especialmente como in vitro modelos de infecção. Organoides apical-out abordam essa limitação invertendo a polaridade epitelial, expondo a superfície apical para estudos de infecção^{direta 27,28}. No entanto, sua eficácia como modelo de infecção pode ser limitada pela variabilidade de tamanho, exposição desigual a patógenos e fragilidade durante infecções de longo prazo.

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo da próstata do camundongo baseado em organoides que recapitula a composição celular epitelial e o perfil transcricional do epitélio murino nativo, ao mesmo tempo em que oferece fácil acesso à superfície apical. Otimizado em nosso trabalho^{anterior 32}, esse modelo permite controle preciso sobre variáveis experimentais chave, incluindo densidade de semeadura, exposição uniforme a estímulos, razões definidas entre bactérias e células (MOI) e parâmetros de imagem de alto rendimento que muitas vezes são difíceis de padronizar em sistemas organoides 3D convencionais.

Em linha com o princípio das 3Rs (Substituir, Reduzir, Refinar) para experimentação^{animal 42}, os organoides usados como fonte de células primárias para este modelo são derivados de camundongos selvagens ingênuos que foram sacrificados para fins não relacionados, como reprodução. A próstata é obtida por meio de doações de instalações veterinárias próximas, reduzindo assim a necessidade de sacrificar animais adicionais especificamente para esse protocolo.

A diferenciação robusta e confiável de organoides e modelos baseados em organoides é fundamental para replicar fielmente a composição celular e as características funcionais do tecido nativo, garantindo sua relevância como modelos in vitro. A diferenciação celular dentro dos organoides é fortemente influenciada pela composição específica do meio de cultura, incluindo as concentrações precisas de fatores de crescimento e agentes farmacológicos (ou seja, inibidores de medicamentos). Manipular esses fatores permite a diferenciação direta em relação a linhagens celulares específicas, como demonstrado em vários sistemas organoides. Por exemplo, em organoides intestinais, a remoção da WNT promove a diferenciação de enterócitos, que pode ser ainda mais potencializada pelo interferon gama (revisado em³⁸). A diferenciação em células caliciformes pode ser alcançada pela remoção do inibidor de p38 e nicotinamida ou pela inibição de Notch via DAPT/DBZ (revisado em³⁸). IGF-1 e FGF-2 também demonstraram apoiar a expansão a longo prazo de culturas enriquecidas por células^{secretoras 43}. Além disso, a IL-22 potencializa a diferenciação das células Paneth, e as células enteroendócrinas surgem pela inibição de vias como Notch e BMP³⁸. De forma semelhante, organoides gástricos e monocamadas baseadas em organoides apresentam diferenciação em direção às células pit quando a WNT é retirada do meio de cultura, enquanto a adição de nicotinamida ao meio direciona as células para um fenótipo glândular (pescoço e células principais⁾31,44,45.

Na próstata, o receptor de andrógenos (RA) desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase tecidual 46,47,48,49. A testosterona, produzida pelas células de Leydig nos testículos, é convertida em DHT nas células epiteliais da próstata pela 5α-redutase. A DHT ativa a RA, que dimeriza, transloca para o núcleo e se liga aos elementos de resposta androgênica para regular genes envolvidos na diferenciação celular e^{homeostase 50}. Estudos anteriores mostraram que a suplementação de 1 nM em organoides prostáticos de camundongos 3D é suficiente para alcançar a diferenciação celular em células^{luminais 51}. Outros também demonstraram que a suplementação com vitamina D (especificamente 1,25-dihidroxivitamina D) promoveu o crescimento de organoides prostáticos humanos e acelerou a diferenciação ao inibir a atividade canônica da WNT e suprimir o membro da família WNT^{DKK3 52}. No entanto, nesses estudos, apenas organoides 3D foram utilizados. Nossos trabalhos anteriores³² e outros⁵³ mostraram que a suplementação com DHT 10 nM em organoides 3D não é suficiente para alcançar a diferenciação completa. Em contraste, usar o modelo 2D descrito aqui, ou seja, semear as células em 2D com 10 nM DHT, é suficiente para diferenciar o modelo para um estado semelhante ao tecido^{nativo 32}. Para entender essa diferença entre os modelos 3D e 2D, será necessário mais trabalho, mas isso pode ser explicado pelas diferentes pistas mecano-físicas entre os sistemas ou pela presença de fatores de crescimento contendo ECM no modelo 3D.

Três principais tipos celulares epiteliais podem ser encontrados no tecido prostático adulto: células luminais, basais e neuroendócrinas. Dessas, apenas células luminais e basais estão presentes em todos os modelos organoides publicados até agora. A ausência das raras células neuroendócrinas sugere que os protocolos organoides atuais podem não estar totalmente otimizados. Entre as células luminais e basais, uma população celular intermediária prostática também foi descrita como um estado de transição que expressa tanto marcadores luminais (ou seja, CD24a) quanto basais (ou seja, SCA-1)^18,51. Essa subpopulação é frequentemente encontrada na região periuretral da próstata, razão pela qual são frequentemente chamadas de células luminais^{periuretrais 54}. Embora isso tenha sido relatado em alguns sistemas organoides 3D sob condições específicas de diferenciação ou sinalização^53,55, não observamos uma separação clara entre células luminais e intermediárias em nosso^{sistema 32}. Uma possível explicação é que, durante a geração de organoides 3D, não distinguimos entre diferentes regiões prostáticas e, para evitar contaminação com células uretrais, removemos o tecido diretamente adjacente à conexão uretra-próstata. Portanto, culturas organoides derivadas de regiões proximais ou adjacentes à uretra provavelmente são mais capazes de gerar células intermediárias.

A integridade da barreira é considerada uma característica registrada de um epitélio maduro e diferenciado, fornecendo uma barreira protetora contra toxinas e microrganismos que chegam ao tecido subjacente. Junções apertadas (ricas em proteínas ZO-1⁵⁶) desempenham um papel vital na regulação da permeabilidade paracelular e na manutenção da integridade da barreira^{epitelial 57}. À medida que as células epiteliais se diferenciam, a maturação dessas junções intercelulares fortalece a^{barreira 58}. Portanto, avaliar a integridade da barreira é um resultado importante para um modelo epitelial in vitro . Neste protocolo, mostramos três métodos complementares para avaliar a integridade da barreira: medição TEER, imunocoloração por ZO-1 e coloração com F-actina. Embora os três métodos avaliem efetivamente a integridade das barreiras, diferem significativamente nos equipamentos e recursos necessários. As medições TEER fornecem um valor quantitativo que pode ser acompanhado ao longo do tempo, oferecendo insights dinâmicos sobre a função da barreira; No entanto, essa técnica exige hardware e software especializados que podem não estar disponíveis em todos os laboratórios. Por outro lado, a coloração com anticorpos anti-ZO-1 ou faloidina é muito mais gerenciável em termos de tempo e custo (por exemplo, a coloração com faloidina pode ser feita em cerca de 3 horas - seção 3).

Este protocolo descreve como usar organoides prostáticos 3D de camundongo para gerar um modelo 2D acessível apicalmente. Diversas revisões destacaram as vantagens e desvantagens dos organoides e dos sistemas baseados em organoides no estudo das interações hospedeiro-patógeno 23,36,59. Nos estudos de infecção, é fundamental considerar o local natural de interação entre patógenos e o epitélio do hospedeiro. Na próstata, as células luminais são tipicamente o primeiro ponto de contato e, portanto, o acesso à superfície apical é essencial para modelar com precisão a dinâmica da infecção. Em organoides prostáticos 3D convencionais, a superfície apical fica voltada para o lúmen organoide e não é diretamente acessível. Nesses casos, a exposição ao patógeno pode ser alcançada por microinjeção, que é de baixo débito e tecnicamente desafiadora, ou por perturbação dos organoides, comprometendo a polaridade epitelial e resultando em locais de interação^{não fisiológicos 23}. Em contraste, o modelo 2D acessível apicalmente apresentado neste protocolo oferece acesso direto à superfície luminal. Isso permite exposição controlada e fisiologicamente relevante a patógenos, regulação precisa do MOI e compatibilidade com plataformas de imagem de alta resolução, alta resolução ou de alta eficiência. Aqui, apresentamos o uso desse modelo como sistema de infecção in vitro utilizando a cepa de referência UPEC UTI89, uma referência amplamente utilizada que representa as principais espécies bacterianas responsáveis pela prostatite^{bacteriana 9}. No entanto, esse modelo pode ser facilmente adaptado para estudar outros patógenos prostáticos, como Enterococcus faecalis ou Pseudomonas aeruginosa, tornando-se uma plataforma versátil para a biologia da infecção na próstata.

A dissociação dos organoides 3D é um passo crítico para o estabelecimento bem-sucedido do modelo baseado em organoides. A falha em dissociar totalmente os organoides 3D, resultando em fragmentos grandes, pode prejudicar a adesão celular à superfície da cultura, enquanto a exposição prolongada ao reagente de dissociação por mais de 30 minutos reduz a viabilidade celular. Além disso, manter um intervalo de passagem consistente de aproximadamente sete dias antes da dissociação e da sementeira é essencial, pois o estado fisiológico dos organoides influencia fortemente sua capacidade de se fixar e diferenciar. Outra variável crítica que influencia o desenvolvimento bem-sucedido do modelo baseado em organoides prostáticos é a densidade de semeadura. A concentração de semeadura usada aqui foi otimizada para diferenciação ao longo de 7 dias. Aumentar ou diminuir essa concentração provavelmente resultaria em diferentes tempos de diferenciação. Além disso, a ressuspensão celular inadequada antes do revestimento pode levar à distribuição desigual das células entre os poços, resultando em densidades celulares variáveis que, por sua vez, influenciam tanto a proliferação quanto a diferenciação. Além disso, como em outros modelos organoides, diferentes lotes de ECM ou fatores de crescimento podem influenciar a capacidade de crescimento e diferenciação. Portanto, é importante verificar se o modelo baseado em organoides mantém um fenótipo consistente após qualquer alteração no número do lote ou lote do fator de crescimento.

Uma vez estabelecido o modelo baseado em organoides, os parâmetros de infecção também devem ser cuidadosamente otimizados. Frequentemente são necessários diferentes MOIs para alcançar níveis robustos e reprodutíveis de infecção, dependendo da cepa bacteriana e da leitura escolhida. Para a cepa UPEC UTI89 (usada aqui e^{no 32}) e para vários isolados de^{prostatite 32}, um MOI de 100 foi suficiente para obter um número confiável de células infectadas nos tempos de adesão, invasão e replicação. No entanto, se a incubação de células com bactérias precisar ser estendida além de 1 hora, um MOI mais baixo deve ser usado para evitar o crescimento excessivo extracelular de UPEC no meio e a subsequente toxicidade para as células. Neste protocolo, a infecção foi avaliada usando dois métodos: I) citometria de fluxo para quantificar a proporção de células infectadas e II) microscopia confocal para avaliar a localização bacteriana. No entanto, várias outras abordagens também podem ser usadas, como ensaios unitários formadores de colônias para medir a^{bactéria 32}, imunocoloração para detectar hospedeiros ou marcadores^{bacterianos 32}, ou análises transcriptômicas para perfilar respostas do hospedeiro.

Embora o modelo baseado em organoides prostáticos forneça um sistema fisiologicamente relevante, várias limitações devem ser consideradas ao aplicá-lo à pesquisa de infecções. Uma das principais limitações desse modelo é a ausência de células imunes residentes ou periféricas, o que limita sua capacidade de capturar totalmente a resposta do hospedeiro à infecção (por exemplo, recrutamento de células imunes ou eliminação mediada pelo sistema imunológico). Outros componentes essenciais ausentes do modelo incluem vasculatura, estroma e nervos, todos os quais podem influenciar as interações hospedeiro-patógeno. Incorporar tipos celulares adicionais, como fibroblastos estromalas, células imunes e células endoteliais, ajudaria a recriar um microambiente tecidular mais completo. Sistemas avançados de cocultura ou plataformas microfluídicas de órgãos em chip poderiam apoiar ainda mais interações celulares complexas e permitir estudos dinâmicos de infecção. Além disso, ao usar organoides derivados de modelos animais, diferenças específicas de espécie devem ser consideradas, especialmente ao estudar patógenos específicos de humanos. Embora nosso trabalho anterior³² tenha mostrado que os achados do modelo baseado em organoides de próstata murina poderiam ser reproduzidos em tecidos humanos, variações interespécies na regulação gênica, expressão dos receptores ou respostas hormonais ainda podem limitar a relevância direta do modelo para a fisiologia humana. Incorporar organoides de origem humana, quando possível, aumentaria o valor translacional ao possibilitar o estudo das interações e respostas de patógenos específicos do ser humano. Embora essas adições possam fortalecer modelos baseados em organoides como ferramentas poderosas para estudar a biologia da próstata, patogênese de infecção e desenvolvimento terapêutico, o modelo puramente epitelial que apresentamos oferece um sistema simplificado e compartimentado. Isso permite uma investigação focada das interações específicas entre hospedeiro e patógeno epitelial sem interferência de outros componentes teciduais.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de 48 poços	Sarstedt	83.3923	Formato inferior: plano
5&alfa;-Androstan-17β-ol-3-uma dihidrotestosterona	Sigma-Aldrich	A8380	Ele foi designado como DHT. Solução original 10μ M em 100% etanol
Slide PET de 8 poços com 40 eletrodos por poço	Biofísica Aplicada	8W10E+	Slides usados para medições TEER
Placas de 96 poços	Sarstedt	82.1583	Formato inferior: cônico
Advance Dulbecco' s Eagle Medium modificado/F12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Foi designado adDMEM/F12+/+ quando suplementado com 10 mmol L− 1 HEPES e 1x GlutaMAX
Ampicilina	Roth	K029.2	Estoque de concentração 100 mg/mL
Anticorpo anti-CD24a	Proteintech	10600-1-AP	Anticorpo primário; diluição 1:100 em 1x PBS 1%BSA
Anti-Citoqueratina 5 Alexa Fluor 647 anticorpo	Abcam	ab193895	Anticorpo primário; diluição 1:100 em 1x PBS 1%BSA
anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  anticorpo	Invitrogen	A21441	Anticorpo secundário; diluição 1:500 em 1x PBS 1%BSA
Anticorpo policlonal anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Anticorpo primário; diluição 1:750 em 1x PBS 1%BSA
B27, 50x	Thermo Fisher Scientific	12587010
Bovines Serumalbumin (BSA) Fraktion V, NZ-Origin	Roth	8076.3	Componente do buffer de bloqueio usado a 1% em 1x PBS
poços micro-slide 8 com câmara	Ibidi	80806	Modificação de superfície: ibiTreat
Tubo cônico (15 mL)	Sigma Aldrich	T1943	O fundo plano é melhor para pellets pequenos.
Etilenediamina dissódica tetraacetato 2H2O (EDTA)	Roth	8043.2	Caseiro: 93,0 g em 400 mL de H2O, ajuste o pH para 8,0, ajuste o volume com H2O até 500 mL; 0,5 M EDTA; Componente do buffer do citometro de fluxo
Solução Salada Equilibrada de Dulbecco (DPBS)	Gibco	14190-144	PBS
Microscópio ECHO Revolve	ECHO
ECIS  Z-Theta -  Sistema de análise de células baseado em impedância	Biofísica Aplicada	ECIS  Z-Theta	O sistema inclui: estações de 16 e/ou 96 poços; módulo de controle externo; Laptop PC; software de controle, aquisição e exibição ECIS; módulo de campo elevado para migração e eletroporação automatizada de células
Soro Fetal Bovino (FBS) Superior	Sigma Aldrich	S0615	Componente do buffer de citômetro de fluxo; componente do meio de cultivo da linha celular 293T; componente do meio de cultura HEK293T linha celular
Flash Phalloidin Red 594	Biolenda	424203	Diluição 1:250 em 1x PBS 1%BSA
Buffer de citômetro de fluxo			1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA
Gentamicina	Sigma Aldrich	G1272
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-038	Dipeptídeo L-alanyl-L-glutamina, componente do adDMEM/F12+/+
Medidor de Densidade de Células Harvard Biochrom Ultrospec 10	Fisher Scientific	10704417
Coloração Deep Red HCS CellMask	Tecnologias de Vida	H32721	Diluição 1:1.000 em 1x PBS 1%BSA
HEK293T linha celular transfectada com vetor de expressão de Noggin-Fc em camundongos	Linha celular do Prof. Dr. Clevers		Usado para produzir Noggin; meio de cultura: 500ml DMEM, alta glicose, GlutaMAX, piruvato (Gibco Life Technologies, 31966)+ 50ml FBS; Farin et al. Gastroenterology 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630056	Componente do adDMEM/F12+/+
Hoechst 33342	Tecnologias de Vida	H3570	Diluição 1:5.000 em 1x PBS
Fator de crescimento epidérmico humano (EGF) e nbsp;	Peprotech	AF-100-15	Estoque de concentração 500 & micro; g/mL
Anéis de inoculação	Sarstedt	86.1567.010
Tubos de inoculação	Sarstedt	62.515.006
Microscópio confocal Leica Stellaris 5	Leica
Caldo Luria Bertani (caldo LB)	Roth	X968.1
Matrigel	Corning	356231	Matriz Extracelular (ECM)
N-Acetilcisteína	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Estoque de concentração 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon	Agilent		Citômetro de Fluxo
Paraformaldeído (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	usado a 4% em 1x PBS, 4% de sacarose
Primocin	Invivogen	Ant-pm-1
Q-VETTES semi-micro	Ratiolab	2712120
RHOKi (Y-27632)	AbMole	M1817	Inibidor de RhoA/ROCK; Estoque de concentração 10 mM
R-spodin1 CM
R-Spondin1 expressando a linha celular 293T	Sigma Aldrich	SCC111	Usado para produzir R-spo1 CM; meio de cultura: 500ml DMEM, alta glicose, GlutaMAX, piruvato (Gibco Life Technologies, 31966)+ 60ml FBS
TGF & beta; i (A-83-01)	Tocris	2939	inibidor ALK4/5/7; Estoque de concentração 5 mM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	usado 0,5% diluído no PBS 1x
TrypLE Express Enzima	Gibco	12605028	Agente enzimático de dissociação celular para digerir organoides prostáticos de camundongos 3D
Cepa uropatogênica Escherichia coli cepa UTI89	Cepa WT do Prof. Dr. Dobrindt		transformado com pFPV-mCherry (addgene #20956)