Isolamento Padronizado e Preparação de Citocinas de Células Estromais Mesuquimatosas Derivadas da Medula Óssea Murina para Aprimoramento da Imunomodulação

Resumo

Aqui, demonstramos um protocolo para isolar células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea de camundongo, juntamente com um método de preparação por citocinas para amplificar o efeito imunossupressor dos BMSC sobre as células imunológicas.

Resumo

As células estromais mesenquimais (MSCs) possuem forte funcionalidade regenerativa e imunomoduladora. Essas propriedades tornam as MSCs potentes como medicamentos celulares para o tratamento de múltiplos distúrbios imunológicos. A medula óssea é a principal e mais utilizada fonte de MSCs. Estudos mecanicistas pré-clínicos usando modelos murinos são cruciais para obter conhecimento das estratégias ideais de administração de medicamentos para BMSCs em ensaios clínicos em humanos. Portanto, a padronização do processo de fabricação dos MSCs murinos também é fundamental para obter melhores resultados terapêuticos. Um objetivo central deste protocolo é demonstrar como o priming controlado por interferon-gama (IFN-γ) potencializa as propriedades imunossupressoras intrínsecas dos BMSCs. Descrevemos a geração de meios condicionados (MC) a partir de BMSCs não tratados ou pré-licenciados por IFN-γ e avaliamos sua atividade biológica usando macrófagos peritoneais primários. Por meio do ELISA e do perfil citométrico de fluxo, o protocolo detalha como o secretoma derivado do BMSC — especialmente quando preparado por IFN-γ — impulsiona a polarização anti-inflamatória dos macrófagos caracterizada por produção elevada de IL-10 e marcadores superficiais associados ao M2. No geral, esse protocolo estabelece uma estrutura unificada para produzir BMSCs murinos funcionalmente consistentes e para avaliar sua potência imunomoduladora. Ao reduzir a variabilidade técnica e fornecer clareza visual e procedimental, apoia a melhora da reprodutibilidade na pesquisa pré-clínica de MSC e facilita estratégias otimizadas de implantação de MSC para estudos translacionales.

Introdução

As células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea (BMSCs) têm amplas aplicações tanto em estudos pré-clínicos quanto clínicos. Sua baixa imunogenicidade, fácil acesso e capacidade de diferenciação multilinhagem fazem dos BMSCs candidatos promissores para uso em ambientes clínicos como fármacos ^{celulares 1,2,3}. Suas propriedades imunossupressoras e regenerativas têm sido amplamente exploradas em estudos clínicos para tratar distúrbios inflamatórios como a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD⁾⁴,^{sepse 5} e doença inflamatória intestinal (DII⁾⁶. O nicho estromalical da medula óssea compreende uma população celular estromágica heterogênea. No entanto, todos os MSCs seguem os critérios definidos pela Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT), que incluem: adesão plástica, expressão superficial dos receptores — CD73, CD90 e CD105 em humanos, e CD29, CD44 e CD90 em camundongos — sem expressão de marcadores hematopoiéticos ou endoteliais — CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR, e capacidade para adipogênicos, condrogênica, ou diferenciação^{osteogênica 7}.

As BMSCs permanecem funcionais por meio da liberação de fatores paracrinos coletivamente conhecidos como secretoma, que inclui citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, vesículas extracelulares e várias outras moléculas solúveis e dependentes do^{contato 8,9}. O secretoma dos MSCs modula o nicho interagindo com elementos do sistema imunológico inato de maneira^{bidirecional 10}. Fatores liberados durante as interações entre MSCs e macrófagos podem deslocar os macrófagos para um fenótipo pró-inflamatório ou^{anti-inflamatório 11,12}. Por outro lado, o estado funcional das MSCs também é regulado por células imunes locais — particularmente macrófagos — por meio de mecanismos de feedback¹¹. Essa comunicação cruzada entre MSC e macrófagos é indispensável para a funcionalidade imunossupressora das MSCs. As MSCs transferidas adotivamente só reduzem a inflamação dos tecidos quando há macrófagos presentes, como observado em modelos de camundongos com colite. Em contraste, a interação dos MSCs com linfócitos B ou T na ausência de macrófagos é insuficiente para exercer seus efeitos^{terapêuticos 13}.

O primeiro ensaio clínico de fase III usando BMSCs alogênicos foi concluído pela Osiris Therapeutics nos Estados Unidos para o tratamento da GVHD (NCT00366145)1 refratária a esteroides^. Desde então, inúmeros estudos pré-clínicos e clínicos foram realizados, embora o sucesso dos ensaios clínicos não tenha atendido às expectativas baseadas nos resultados pré-clínicos. Para melhorar a taxa de sucesso dos ensaios clínicos baseados em MSC, a otimização das estratégias de implantação de medicamentos é essencial. Compreender a rota ótima de administração, a dose da célula terapêutica e o estado fisiológico das células no ponto de cuidado é fundamental. Por exemplo, em um modelo camundongo de colite in vivo , estudos mostraram que MSCs criopreservadas ou parto intravenoso são métodos subótimos de administração¹⁴.

Diferentes abordagens, como pré-licenciamento de citocinas, modificação genética ou pré-condicionamento hipóxico, foram amplamente estudadas para melhorar a persistência in vivo e a utilidade terapêutica das^{MSCs 15}. No modelo de isquemia murina do membro posterior, o pré-condicionamento da hipóxia (2%_O2) melhorou a capacidade de proliferação e migração das MSCs por meio do aumento da expressão da proteína de choque térmico, proteína regulada pela glicose de 78 kD (GRP78)¹⁶. A pré-licenciamento da IL-1β (Interleucina-1 beta) aumenta a capacidade dos MSCs de empregar neutrófilos, monócitos, linfócitos e eosinófilos¹⁷. Após a entrega in vivo, as MSCs são expostas ao IFNγ derivado das células T e NK ativadas, o que aumenta a produção de indoleamino 2,3-dioxigenase (IDO) pelos^{MSCs 18}. A IDO é um componente essencial no secretoma das MSCs, que reduz a taxa de proliferação das células T. Curiosamente, a capacidade imunossupressora dos MSCs é reduzida quando são co-cultivados com linfócitos T derivados de^{camundongos de IFNγ-/- 19}. Estudos identificaram que a pré-licenciamento de IFN-γ reduz a taxa de apoptose mediada por células T em MSCs^{criopreservadas 13,20}. O priming IFNγ melhora o resultado terapêutico dos^{BMSCs 13}. Todas essas evidências indicam coletivamente o papel indispensável do IFNγ na produção de MSCs imunossupressores mais potentes.

Para determinar a modalidade de entrega mais eficaz dos MSCs, modelos animais têm sido amplamente utilizados por sua acessibilidade ética. Para reduzir a variabilidade nos resultados pré-clínicos, é fundamental estabelecer um método otimizado para o processo de fabricação dos MSCs que garanta alto rendimento, viabilidade celular e consistência ao^{longo do tempo 21}. A passagem dos MSCs é uma variável importante que pode gerar diferentes resultados terapêuticos. Durante o cultivo in vitro , a passagem pode regular a caracterização e a potência das MSCs, e após um certo número de passagens, as células tornam-se^{senescentes 22}. Portanto, em qualquer estudo clínico ou pré-clínico, é fundamental ser consistente com o uso do número de passagem do MSC. Da mesma forma, a consistência com um protocolo específico para o isolamento dos MSCs também é um fator-chave para alcançar a reprodutibilidade no resultado do uso dos MSCs. Entre muitas abordagens, a classificação celular^{baseada em anticorpos 23}, método de seleção^{negativa 24} e digestão^{enzimática 25} são métodos populares de isolamento de MSCs. No entanto, a aplicabilidade desses métodos depende da fonte, pois o uso inadequado reduz o rendimento, a potência e a capacidade de diferenciação trilineage.

Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para o isolamento e caracterização dos BMSCs, enfatizando o número de passagem preferido, a técnica de criopreservação e a coleta de mídia de condições derivada do BMSC. Também fornecemos um protocolo para priming de MSC mediado por IFN-γ e, finalmente, demonstramos um estudo comparativo de como os macrófagos peritoneais respondem diferencialmente a BMSCs normais ou pré-licenciados γ IFN-.

Protocolo

O presente estudo foi realizado com aprovação e seguindo as diretrizes do comitê de ética animal do ICMR-Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde Reprodutiva e Infantil (Projeto IAEC nº 09/23) e do Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Wisconsin-Madison. Fêmeas de camundongos C57Bl/6J de 6 a 8 semanas, reproduzidos e alojados em condições específicas livres de patógenos (FPS), foram usadas para o presente estudo.

NOTA: Seguimos os protocolos de biossegurança determinados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (IBSC) durante os estudos in vivo ou in vitro . Resumindo, para estudos com animais, mantivemos um manuseio suave para reduzir o estresse e o risco de lesões. Usamos EPI adequado, como óculos de proteção, luvas, jaleco de laboratório, máscara e um boné descartável de bouffant. Para reagentes químicos de risco biológico, como DMSO, usamos um gabinete de biossegurança para manusear os produtos químicos. Usamos o recipiente específico de resíduos para descartar reagentes bio-perigosos ou objetos cortantes.

1. Isolamento de células estromais mesenquimais da medula óssea murina

NOTA: Após a coleta dos membros posteriores, o restante dos passos deve ser realizado em uma capuz de cultura de tecidos de fluxo laminar, e técnicas assépticas^{estéreis 26}.

1. Eutanasie o camundongo por luxação cervical, seguida de uma lavagem completa com 70% de etanol. Usando pinças oftálmicas, toque suavemente a pele abdominal entre as duas articulações do quadril do camundongo e corte cuidadosamente a pele com tesoura.
2. Separe a pele puxando suavemente em direção ao pé. Corte as articulações do quadril e o tornozelo para libertar ambos os membros traseiros.
3. Transfira rapidamente os membros posteriores em DMEM gelado, suplementado com 1x penicilina/estreptomicina e 2% de FBS para evitar danos teciduais até o processo de dissecação posterior.
4. Pegue cada membro posterior em uma placa de Petri contendo o substrato gelado. Cuidadosamente remova o músculo e o tecido conjuntivo do fêmur e da tíbia, raspando delicadamente a diáfise do osso. Transfira o osso limpo para uma nova placa de Petri contendo o meio gelado.
5. Descolhe o fêmur e a tíbia, seguido de um corte nas extremidades da tíbia e do fêmur, logo abaixo da extremidade da cavidade medula. Proteja a cavidade medular ao máximo durante o procedimento de dissecção do fêmur e tíbia.
6. Pegue uma seringa estéril de 1 mL com uma agulha de 21 g e retire o meio da placa de Petri. Com pinças estéreis, segure o fêmur extirpado e insira a agulha suavemente na cavidade medula. Lave a cavidade da medula óssea para obter a medula óssea. Repita essa etapa até que o osso fique branco. Lave a tíbia da mesma forma.
7. Pipete suavemente para dentro e para fora para dispersar os aglomerados celulares na placa de Petri. Usando uma malha filtrante de 70 mm, filtre a suspensão da célula para remover quaisquer partículas ósseas. Recolha o filtrado e centrifuge-o a 230 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet com meio completo (DMEM, FBS 10%, 5% L-Glutamina, penicilina e estreptomicina). Meça o rendimento e a viabilidade das células por exclusão de azul de Trypan e contagem em um hemocitômetro.
9. Semeie as células em um frasco tratado com cultura de tecidos de 75^cm 2 com densidade celular de 5000 células/^{cm 2} em meio^{DMEM completo 13}. Remova as células hematopoiéticas não aderentes após 48 horas de cultivo trocando o meio. Substitua a mídia por mídia nova a cada 3-4 dias alternados.
   NOTA: Use um frasco de cultura celular em vez de um recipiente para evitar contaminação. Não retire o frasco da incubadora com frequência para verificar as células, pois isso prejudica o crescimento celular.
10. Para separar as células aderentes, lave as células 1x com PBS, adicione 0,25% de tripsina-EDTA e mantenha as células na tripsina por 5 minutos. Isso ajuda a separar as células do poço.
11. Adicione o meio inteiro, ressuspenda e centrifuge a 230 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernadante. Adicione meio DMEM completo ao pellet, ressuspenda e resemeie as células com uma densidade de 5.000 células/^cm2.
12. Faça a passagem das células semanalmente trocando o meio a cada 3-4 dias. Após a terceira passagem, analise a cultura da MSC por análise citométrica de fluxo, conforme descrito no passo 6. Use as células de passagem 3-5 para qualquer experimento.
    NOTA: Para criopreservar as células para uso experimental futuro, centrifuge-as no volume desejado, resuspenda-as em meio congelante, armazene 1 x 10⁶ células em 1 mL de meio congelante em cada criovial a -80 °C durante a noite, e depois transfera as células para nitrogênio para uso prolongado.
    Composição do meio congelante: 70% DMEM, 20% FBS, 10% DMSO.

2. Preparação de meio condicionado a partir de MSCs cultivados

1. Semeie as células com uma densidade de 5000 células/^{cm, 2} em 6 placas de poço. Cultive MSCs até 80% de confluente.
2. Colete o meio condicionado da placa de cultura celular e centrifuge a 230 x g por 5 minutos em temperatura ambiente, filtre e use para tratamento.

3. Preparação de meio condicionado preparado com IFNγ a partir de MSCs cultivados

1. Semeie as células em placas de 6 poços com uma densidade de 5000 células/^cm2. Trate as células com 25 ng/mL de IFNγ por 48 horas. Realize um estudo dependente da dose para obter o efeito ideal do IFNγ nos MSCs. Para este experimento, selecione uma faixa de concentrações de IFNγ, 5, 10, 10, 25, 50, 100 ng/mL, para pré-licenciar MSCs. As concentrações de 5 e 10 ng/mL foram significativamente menos eficazes na polarização dos macrófagos, e 25 ng/mL foi identificada como a concentração ideal (Figura Suplementar 1).
2. Após decantar o meio contendo IFN-γ, lave o poço 2x com PBS para garantir a remoção completa do IFN-γ. Qualquer IFN-γ residual pode interferir no resultado do estudo.
3. Incube as células por mais 24 horas em meio DMEM normal a 37 °C. Após 24 horas, colete a mídia condicionada seguindo a etapa 2.

4. Isolamento e cultura de macrófagos derivados da cavidade peritoneal

1. Injete 5 mL de PBS gelado (com 3% de FBS) na cavidade peritoneal dos camundongos, seguido de uma massagem suave no abdômen.
2. Recupere a solução de PBS usando uma seringa estéril. Colete em um tubo de 10 mL. Centrifuge a solução a 300 x g por 5 minutos.
3. Remova o sobrenadante. Dissolva o pellet em meio RPMI completo (RPMI, FBS 10%, 1x Penicilina e Estreptomicina). Placar as células a 5000 células/^cm2.
4. Remova as células não aderentes após 24 horas e cultive até a confluência. Use as células para procedimentos experimentais adicionais conforme necessário.

5. Ensaio imunossorvente ligado a enzimas

1. Para detectar IL-10 derivada de macrófagos tratados com BMSC-CM, siga os passos abaixo.
   1. Trate os macrófagos com BMSCs-CM por 24 horas e colete o sobrenadante no dia seguinte.
   2. Meça a quantidade de IL-10 usando o kit IL-10 ELISA seguindo as instruções do fabricante.
2. Para detectar CCL2 derivado de BMSCs ou BMSCs tratados com IFNγ, utilize o kit ELISA CCL2 seguindo as instruções do fabricante.

6. Análise de citometria de fluxo para MSCs e fenotipagem de macrófagos

1. Semeie as células em uma placa de 6 poços e torne-a confluente. Lave 1x com PBS (1 mL) seguido de tripsinização. Adicione tripsina a 0,25% e incube por 5 minutos em tripsina para levantar completamente as células da placa.
2. Adicione mídia para desativar a atividade da tripsina. Colete as células em um tubo de poliestireno de 10 mL. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C para macrófagos e 230 x g por 5 minutos a 4 °C para BMSCs.
3. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 2 mL de tampão de coloração (PBS gelado com 2% de FBS e 0,05% de azida). Centrifuge a 230 x g por 7 minutos. Decante e desfaça a bola. Adicione 1 mL de corante Ghost Red 780 viability e 50 mL de buffer FACS, resuspenda e coloque no tubo de fluxo. Mancha no escuro por 30 minutos.
4. Após 30 minutos, lave as células com 1 mL de tampão de mancha. Decante e desfaça a bola. Adicione o volume desejado de controle de anticorpos ou isotípos. Incubar por mais 30 minutos no escuro. Lave as células com tampão de mancha, decante e ressuspenda em 400 mL de tampão de mancha. O tubo de amostra está pronto para aquisição.
5. Para preparar o controle da coloração viva-morta, após tripsinização e centrifugação, dissolve o pellet em 2 mL de tampão de coloração. Retire 1 mL em outro tubo de microcentrífuga e adicione 10 mL de DMSO para matar as células. Faça vórtice e incube por 10 minutos. Agora misture isso com os outros 1 mL da solução contendo célula em um tubo de fluxo.
6. Adicione 1 mL de tampão de tingimento e centrifuge a 230 x g por 7 minutos. Decante e desfaça a bola. Adicione 1 mL de corante Ghost Red 780 viability e 50 mL de buffer FACS, resuspenda e coloque no tubo de fluxo. Mancha no escuro por 30 minutos. Após 30 minutos, lave as células com 1 mL de tampão de mancha. Decante e desfaça a bola. Resuspenda em 400 mL de tampão de mancha. A amostra viva e morta está pronta para aquisição.
   NOTA: Para a coloração de macrófagos de camundongos, uma etapa adicional de coloração deve ser adicionada antes do protocolo padrão de coloração. Para evitar imprecisão nos dados de fluxo, o bloqueio do receptor FC é uma etapa crítica, que impede a ligação de anticorpos inespecíficos aos receptores Fc nas células. Para bloquear o receptor Fc, adicione 1 mL de reagente bloqueador de Fc (anticorpo purificado anti-camundongo CD16/CD32) à suspensão celular e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Realize as etapas restantes de coloração de anticorpos de fluxo sem lavar o reagente bloqueador de Fc.
7. Para analisar os dados de fluxo, inicialmente, células-únicas devem ser selecionadas com base nos parâmetros de espalhamento direto e lateral. Essa etapa é crucial para remover detritos e agregados celulares. Depois, as células individuais serão bloqueadas com base na coloração de morto-vivo. Realize uma análise adicional baseada na população de células vivas (Figura Suplementar 2).

Resultados

O esquema experimental geral é descrito na Figura 1. Medula óssea de camundongo foi coletada tanto do fêmur quanto da tíbia, com sementes, passagem e citometria de fluxo (Figura 1A). Os meios de condição dos BMSC (BMSCS-CM) com ou sem pré-licenciamento IFNγ foram coletados, e alguns frascos de BMSCS-CM foram armazenados a -80 °C para necessidades experimentais futuras (Figura 1B).

Células derivadas da medula óssea foram contadas por hemocitômetro (Figura 2A) e semeadas com uma densidade de 5000 células/^cm2 em meio DMEM completo. Após 48 horas, o primeiro meio era trocado, e depois o meio era trocado a cada 3/4 dias, até a confluência total. Passamos as células quando atingiram 80% de confluência (Figura 2B). Na passagem 4, caracterizamos células com base na expressão de marcadores específicos de MSC. As células foram CD44, CD29 e CD90 positivas, e negativas para CD45, CD11b e CD34 (Figura 2C). Os BMSC podem se diferenciar em linhagens adipogênica, osteogênica e condrogênica 14,27,28,29. Isso mantém as diretrizes de identidade da Sociedade Internacional de Terapia Celular.

Para entender o efeito imunossupressor das MSCs-CM, tratamos macrófagos derivados da cavidade peritoneal (PMφ) e os tratamos com BMSCs-CM (Figura 3A). Realizamos análise por citometria de fluxo de macrófagos tratados com BMSC-CM (Figuras 3B,C). Macrófagos residentes em cavidades peritoneais adaptados à cultura foram corados por marcadores superficiais específicos para M1 e M2. Prevenimos a ligação de anticorpos inespecíficos incubando macrófagos com CD32/CD16 purificado anti-camundongos (Mouse Fc Block antes de adicionar anticorpos de coloração), antes da coloração efetiva dos marcadores celulares. A expressão dos marcadores específicos do M1, CD86 e iNOS, e dos marcadores específicos do M2, CD206 e CD163, foi estudada. As células foram inicialmente selecionadas com base no marcador hematopoiético CD45.2 (para C57BL6). IL-10 é a citocina assinatura do fenótipo M2. A IL-10 liberada por macrófagos tratados com MSCs e CM foi medida por um estudo ELISA (Figura 3D). Como o LPS/IFNg induz a polarização^{M1 30}, esse tratamento serviu como controle negativo.

CCL2 é uma das citocinas características identificadas no secretoma das MSCs, que desencadeia a polarização¹³ dos macrófagos. CCL2 liberado pelos MSCs foi detectado pelo ELISA (Figura 3E). Para confirmar o papel do CCL2 na polarização dos macrófagos, pré-tratamos os macrófagos com um inibidor do CCR2 seguido do tratamento com MSC-CM (Figura 3F), e a polarização dos macrófagos foi novamente detectada pelo estudo ELISA de IL-10 (Figura 3F).

Nossos resultados demonstram claramente que o secretoma dos CMS pode induzir polarização anti-inflamatória dos macrófagos, como evidenciado pelo aumento da produção de IL-10 em macrófagos derivados do intestino após tratamento com meios condicionados (Figura 3).

Figura 1: Fluxograma do estudo. (A) C57BL/6 camundongos foram eutanasiados. A medula foi retirada tanto dos fêmures quanto da tíbia, centrifugada e cultivada por uma semana, com troca de substrato a cada 3 dias. As MSCs foram passageiras e, na passagem 4, caracterizadas por citometria de fluxo e estudo de adipogênese. (B) Os MSCs da passagem 4 foram semeados em placas de 6 poços, em um conjunto com IFNγ adicionado a uma concentração de 25 ng/mL, e em outro conjunto, mantidos sem tratamento. Após 48 horas, substitua por mídia DMEM nova e completa normal. Após 24 horas, colete o meio da placa, centrífuga e filtro. Armazene o meio de condição a -80 °C para uso futuro. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Caracterização fenotípica. (A) Células derivadas da medula óssea foram contadas por um hemocitômetro antes da semeadura. (B) As células foram deixadas crescer até 80% de confluência antes de cada passagem. (C) Células da passagem 4 foram caracterizadas por análise de citometria de fluxo com marcadores específicos de MSC de camundongo. A barra de escala representa 100 mM. A Figura 2C foi modificada a partir^{do 14}. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Análise do secretoma BM-MSC. (A) Esquema dos experimentos. (B) Análise citométrica representativa de gráfico para fluxo de PMφ tratada com MSC-CM. Células derivadas do peritoneal foram codificadas com base nos marcadores hematopoiéticos da população CD45,2-positiva. A população selecionada foi ainda corada pelos marcadores específicos de M1 CD86 ou iNOS, marcadores específicos de M2 CD206 ou CD163, juntamente com coloração dupla CD11b em cada caso. (C) A porcentagem da população de células M1 ou M2 foi quantificada. Uma população celular tratada com LPS/IFNγ serviu como controle negativo. (D) O ELISA foi realizado para quantificar a IL-10 liberada pelo MSC-CM-treatedPMφ. O ELISA foi realizado para quantificar (E) CCL2 lançado pelo MSC-CM, (F) IL-10 lançado pelo PMφ. Como indicado na figura, um conjunto de experimentos foi realizado na presença de um antagonista CCR2. Barras de erro representam a média ± SEM. Dados representativos de 3 experimentos independentes com 3 amostras de MSC por grupo. O teste t do aluno foi usado para realizar análise estatística de todos os experimentos. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. A Figura 3B-F foi modificada a partir^{do 13}. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura Suplementar 1: Os BMSCs eram pré-licenciados com 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNg. Macrófagos foram tratados com MSCs-CM pré-licenciados por IFNγ. O ELISA foi realizado para quantificar a IL-10 liberada pelo PMφ tratado com MSC-CM. Barras de erro representam a média ± SEM. Dados representativos de 3 experimentos independentes com 3 amostras de MSC por grupo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: (A-C) Células individuais foram selecionadas com base nos parâmetros de espalhamento frontal e lateral. (D) Células individuais foram bloqueadas com base na coloração de mortos-vivos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O isolamento de células estromais mesenquimatosas derivadas da medula óssea do camundongo é uma técnica crítica para entender as propriedades imunossupressoras e regenerativas intrínsecas das MSCs em modelos animais in vivo . Embora o método pareça simples e fácil de seguir, várias etapas devem ser executadas com precisão para evitar contaminação bacteriana e garantir o rendimento celular ideal. Cada etapa do procedimento deve ser realizada assépticamente em um ambiente ultra-limpo.

Para evitar baixo rendimento de células, selecione camundongos na faixa etária de 6 a 8 semanas. Ao cortar as extremidades do fêmur e da tíbia, a cavidade medular deve ser protegida o máximo possível, e o processo de lavagem deve ser firme, porém suave, para garantir a extração completa da medula. As células isoladas devem ser incubadas sob uma concentração adequada de CO₂ e em condições umidificadas. Durante as trocas de meio, é essencial lavar suavemente as células com soro salino tamponado com fosfato (PBS) antes de substituir o meio, a fim de eliminar as células hematopoiéticas contaminantes. Para evitar contaminação por células hematopoiéticas, no momento da repassagem, a tripsinização não deve exceder 5 minutos. Na passagem inicial, a mudança no meio não deve ser muito rápida, pois mudanças frequentes podem causar contaminação bacteriana.

Em cada passagem, é necessário criopreservar as células em vários lotes para manter consistência e disponibilidade. Para o priming IFN-γ, deve ser realizado um experimento dependente de dose para determinar as condições pré-licenciamento mais eficazes para o meio condicionado a MSC. Em nossos experimentos, testamos uma variedade de concentrações de IFNγ, ou seja, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, para pré-licenciamento de MSCs. Então, 25 ng/mL foi identificada como a concentração ideal.

Para preservar a integridade dos dados, células de um número específico de passagem devem ser usadas consistentemente em todos os ensaios experimentais. Para a caracterização citométrica de fluxo de MSCs, células da passagem 3 ou superior devem ser usadas para garantir a detecção confiável da expressão dos receptores de superfície. A discriminação de células vivas/mortas durante a coloração por citometria de fluxo é essencial, pois reduz a probabilidade de resultados falsos negativos.

Os resultados representam um mecanismo chave pelo qual BMSCs administradas exogenamente atenuam a inflamação intestinal durante a colite. O priming IFN-γ potencializa o efeito dos meios condicionados a MSC na polarização dos macrófagos. CCL2 liberado pelos BMSCs é uma quimioquina crítica que atua sobre os macrófagos para induzir a polarização M2. Nossas descobertas anteriores demonstraram que as quimiocinas CCL2 e CXCL12 atuam cooperativamente sobre os macrófagos para promover sua polarização. Esse evento é essencial para a propagação da sinalização anti-inflamatória por meio da modulação subsequente dos fenótipos¹³ das células T e das células B.

Em nosso estudo, seguimos especificamente um protocolo simples para isolamento de BMSCs, baseado na propriedade plástica de aderência das MSCs. A classificação por citometria de fluxo ou triagem imunomagnética podem ser utilizadas para isolar BMSCs com base em marcadores de superfície específicos para MSC. No entanto, em ambos os métodos, há chance de perder muitas células durante a preparação da amostra. Como a medula óssea do camundongo contém um número muito baixo de MSCs (estimada em cerca de 0,001% a 0,08% das células da medula óssea), preferimos o método padrão de isolamento baseado em propriedades plásticas aderentes. No entanto, esse método tem algumas desdesvantagens. O principal risco é a contaminação celular hematopoiética, que pode reduzir a capacidade terapêutica dos MSCs. Portanto, a identificação de um número específico de passagem é crucial, quando uma população significativa de células expressa receptores de superfície específicos dos MSCs.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Exaustor de cultura celular com fluxo laminar vertical, equipado com luz UV & nbsp;
Tesoura cirúrgica estéril
25/75 cm2 frasco
Seringas de 5/10 mL com agulhas de 27G
Pratos culturais de 6 poços
Accutase	Corning	#AT104
Anit-Mouse F4/80 APC	Biolenda	#123116
Anti-Mouse CD 11b PE	BD PharMingen	#557397
APC anti-rato CD 45.2	BD PharMingen	#558702
Anti-Mouse CD163 Percp eFluor710	eBiociência	#46-1631-80
Anti-Mouse CD206 PE	Biolenda	#141706
Anti-Mouse CD86 FITC	BD PharMingen	#553691
Anti-Mouse iNOS PE-Cy7	eBiociência	#25-5920-80
Kit CCL2 ELISA	Invitrogen	#554722
Antagonista de CCR2 (RS 102895)	Sigma	#R1903
Centrífuga
DPBS	Corning	#21-031-CV
Eagle's medium modificado (DMEM) de Dulbecco	Corning	# 10-013-CV
Soro fetal bovino	Sigma	#F8067
Malha do filtro (70 mm)
Corante vermelho fantasma 780 viabilidade	Biociência tonbo	#13-0865-T100
IL-10 ELISA Kit	Invitrogen	#88-7105-88
L-Glutamina	Corning	#25-005-CI
Microscópio com equipamento de contraste de fase
Murine IFNγ	R& Sistemas D	#485-MI-100
Penicilina-estreptomicina	Corning	#30-002-CI
Anti-rato CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMImedium	Corning	#10-040-CV
Pinças cirúrgicas estéreis (retas e curvas)
Incubadora controlada por temperatura e composição de gases
Tripsina	Corning	#25052-cl
Banho-maria com controle de temperatura