Artigo de método

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

DOI:

10.3791/69400

⸱

28 de outubro de 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os principais elementos cis-regulatórios conhecidos como intensificadores desempenham um papel central na ativação da regulação transcricional precisa de genes-alvo que controlam diversas funções celulares e processos de desenvolvimento. Esses intensificadores são frequentemente transcritos em ambas as direções, produzindo longos transcritos não codificantes chamados de RNAs intensificadores (eRNAs). A expressão de eRNAs está intimamente ligada a características ativas da cromatina, como H3K27ac e recrutamento de co-ativadores, e contribui funcionalmente para a ativação transcricional de genes-alvo. No entanto, a detecção e quantificação de eRNAs permanecem desafiadoras, especialmente quando eles se sobrepõem à transcrição do gene do hospedeiro. Para resolver isso, apresentamos um fluxo de trabalho computacional padronizado e fácil de usar para analisar a transcrição do intensificador a partir de dados de sequenciamento de RNA nascentes. O protocolo orienta os usuários por meio do pré-processamento de dados, mapeamento de leitura e controle de qualidade, seguido pela quantificação específica da transcrição associada ao intensificador, com procedimentos dedicados para intensificadores intragênicos onde a atribuição de sinal é complexa. Os módulos de visualização permitem uma inspeção clara da atividade do intensificador em contextos genômicos, e as opções integradas suportam análises de intensificadores intergênicos e intragênicos. Projetado para pesquisadores com experiência limitada em bioinformática, este fluxo de trabalho fornece uma estrutura prática para estudos consistentes, reprodutíveis e escaláveis de transcrição de intensificadores, facilitando uma aplicação mais ampla da biologia de intensificadores em diversos sistemas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os intensificadores são elementos de DNA cis-regulatórios que controlam a transcrição do gene alvo organizando o loop da cromatina e recrutando a maquinaria transcricional 1,2,3. Sua atividade específica do tecido permite uma regulação precisa durante o desenvolvimento e o comprometimento da linhagem 4,5,6,7,8. Os intensificadores ativos apresentam características características da cromatina, como H3K4me1 (histona H3, lisina 4, monometilação) e H3K27ac (histona H3, lisina 27, acetilação) e são geralmente encontrados em regiões hipersensíveis à DNase I que marcam a cromatina aberta 9,10,11,12. Essas características permitem que os fatores de transcrição e a RNA polimerase II acessem o DNA, iniciando a transcrição nascente nos loci intensificadores 13,14,15,16.

Este processo biológico sequencial produz transcritos derivados de intensificadores, chamados eRNAs, que são bidirecionais, não codificantes e tipicamente RNAs não poliadenilados 13,14,15,16. Os eRNAs servem como marcadores da atividade intensificadora e funcionam como efetores por si só 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Eles promovem o alongamento produtivo liberando o Fator de Alongamento Negativo (NELF) da RNA polimerase II pausada16,19 e ajudam a estabilizar as alças intensificador-promotor 17,18,20. Eles também suportam a formação de condensados transcricionais, potencialmente por meio da modificação de m6A (N 6-metiladenosina) 21,22,23.

Ainda assim, a função da transcrição do intensificador intragênico, iniciada a partir de elementos regulatórios dentro dos corpos gênicos, permanece controversa. Alguns estudos relatam que os eRNAs de intensificadores intragênicos aumentam a expressão gênica do hospedeiro25, potencialmente promovendo a liberação de NELF e o alongamento produtivo dependente de estímulo26,27. Em contraste, outro trabalho sugere que essa transcrição pode impedir genes do hospedeiro por meio de colisões de RNA polimerase II ou interferência transcricional, levando à atenuação ou término prematuro28,29. Essas observações conflitantes, juntamente com o duplo papel dos eRNAs como marcadores e reguladores, destacam a necessidade de quantificação cuidadosa e dissecção funcional. No entanto, medir eRNAs intragênicos é difícil porque eles geralmente se sobrepõem aos transcritos do hospedeiro da fita sensorial 13,25,26,30. O desafio é amplificado quando os intensificadores residem em regiões com genes aninhados ou transcrição sobreposta em ambas as fitas, o que obscurece os sinais específicos do intensificador.

Para superar esses desafios, desenvolvemos um pipeline de bioinformática para detectar, quantificar e visualizar transcritos associados a intensificadores, com foco particular em regiões intragênicas. O pipeline integra o Ensaio para Cromatina Acessível por Transpase usando sequenciamento (ATAC-seq), Sequenciamento de Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP-seq), Sequenciamento Global Run-on (GRO-seq) e anotações genômicas para obter resolução em nível de intensificador, mesmo em contextos genômicos complexos.

O pipeline compreende quatro etapas principais: (i) pré-processamento, alinhamento, chamada de pico e geração de sinal31; (ii) identificação do intensificador usando características da cromatina; (iii) atribuição de orientação de fita, particularmente dentro de corpos gênicos; e (iv) quantificação e visualização de transcritos de intensificadores nascentes. Essa estrutura é particularmente útil para sistemas com dados de sequenciamento de alta resolução, como as células-tronco embrionárias de camundongos analisadas neste estudo, e pode ser estendida a outros organismos quando conjuntos de dados adequados estiverem disponíveis. Ao permitir a quantificação específica do intensificador onde os pipelines existentes ficam aquém, esse fluxo de trabalho oferece uma ferramenta prática para benchmarking e estudo da transcrição de eRNA intragênico em diversos contextos genômicos.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Todos os conjuntos de dados brutos usados no fluxo de trabalho estão listados na Tabela 1. Detalhes das ferramentas de bioinformática são fornecidos na Tabela de Materiais. O número de threads usados nesse pipeline pode ser ajustado modificando a variável THREADS definida na parte superior de cada script. Os usuários podem aumentar o número para acelerar a análise, dependendo dos recursos de CPU do usuário.
Após cada etapa, um arquivo de log é gerado. Para verificações rápidas de falhas, use comandos como cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt && echo "ERROR found. Corrija antes da próxima etapa." || echo "OK: sem marcadores de ERRO". Se algum ERRO aparecer, trate a etapa como falha e resolva-a primeiro.

1. Download do pipeline de análise completo do repositório GitHub

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. Inicie a interface de linha de comando (CLI) apropriada para o sistema operacional usado.
    1. Windows: configure um ambiente Linux usando o WSL (Subsistema do Windows para Linux). Siga as instruções oficiais para instalar e configurar o WSL antes de prosseguir32.
    2. macOS: continue sem configuração adicional, pois o macOS é baseado em Unix. Consulte o guia oficial para abrir o terminal33.
    3. Usuários do Linux, particularmente aqueles que usam o Ubuntu: Abra um terminal conforme descrito nas instruções referenciadas34.
  2. Execute wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   no terminal para baixar o pipeline para identificação do intensificador e quantificação do RNA do intensificador.
  3. Digite unzip ~/pipeline.zip -d ~/ no terminal. Isso extrairá todos os arquivos necessários para o diretório inicial.
  4. Execute rm ~/pipeline.zip e digite mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization para remover o arquivo e renomear a pasta extraída.
  5. Digite cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/ e execute chmod +x scripts/* para tornar todos os scripts no diretório "scripts/" executáveis.

2. Configurando o ambiente mamba/conda para pipeline de análise

  1. Digite bash scripts/Step1_conda_environment_formation.sh para criar e executar um ambiente virtual mamba. Se solicitado durante a execução, digite Y e pressione Enter para confirmar as instalações do pacote. Para macOS, siga a Etapa 2.1.1; para sistemas com Mamba ou Conda já instalados, siga a Etapa 2.1.2.
    1. MacOS: Abra o script e substitua o link de download do miniconda pela versão do macOS:
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      Em seguida, siga a etapa 2.1.
    2. Depois que (enhancer-env) aparecer no prompt, digite bash scripts/Step2_package_installation.sh para instalar os pacotes necessários para análises downstream. Digite Y e pressione Enter se solicitado durante a instalação.
    3. Depois de executar a Etapa 2.2, verifique a saída do terminal em busca de mensagens de erro. Resolva quaisquer problemas; em seguida, execute novamente a Etapa 2.2.
    4. (OPCIONAL) Execute a lista mamba para confirmar se todos os pacotes gerenciados pelo mamba na Tabela de Materiais estão instalados. O HOMER é instalado manualmente e não aparecerá na lista de mambas. Verifique o HOMER verificando se o diretório "~/homer/" existe.

3. Baixe conjuntos de dados ChIP-seq, ATAC-seq e GRO-seq disponíveis publicamente do SRA (Sequence Read Archive)

  1. Execute cp scripts/Step{3..12}_*.sh ./ para copiar os scripts de shell necessários para o processamento de leitura bruta.
  2. Digite bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1 e pressione a tecla Enter para baixar e processar dados brutos de sequenciamento do SRA.
    NOTA: Este script automatiza o download e a preparação de dados de sequenciamento público para análise. Ele cria uma estrutura de pastas padronizada em "MATERIAL/", organizada por tipo de ensaio e replicada (biológica: rep1/rep2; técnica: trep1/trep2). Uma lista integrada de números de acesso SRA impulsiona a recuperação com pré-busca (v3.2.0), conversão para FASTQ com fasterq-dump (v3.2.0) (paired-end: --split-files) e compactação com pigz (v2.8) para reduzir o armazenamento. O processamento segue prefetch, fasterq-dump, pigz, com saídas gravadas nos diretórios "00.Rawdata/" correspondentes.

4. Execute o controle de qualidade e o corte de leituras brutas

  1. Digite bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1 para realizar o corte de leitura e o controle de qualidade de arquivos FASTQ brutos.
    NOTA: Este script processa arquivos FASTQ brutos de GRO-seq, ATAC-seq e ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) com controles de entrada correspondentes. Ele executa o FastQC (v0.12.1)35 em leituras brutas e, em seguida, corta os adaptadores com o Trim Galore (v0.6.10)36 usando parâmetros específicos do ensaio. Para GRO-seq, ele primeiro remove as caudas NextSeq G e leituras muito curtas (--nextseq 20, --length 20), depois usa o Cutadapt (v5.1)37 para remover longos tratos poli-A, mantendo leituras maiores que 20 nucleotídeos ( -a A{15}, -m 20). Para ATAC-seq, ele processa bibliotecas emparelhadas e tem como alvo adaptadores Tn5/Nextera (--paired, --nextera). Para H3K27ac e entrada correspondente, ele lida com bibliotecas ChIP-seq de extremidade emparelhada (--paired). Para H3K4me1 e sua entrada, ele executa o corte de extremidade única padrão (padrão). O FastQC é executado novamente em leituras cortadas. As saídas são gravadas no diretório "01.Clean/" de cada ensaio e os arquivos intermediários cortados pelo adaptador GRO-seq são removidos.

5. Prepare o índice de referência Bowtie2

  1. Escolha uma das duas opções abaixo para preparar o índice do genoma Bowtie2 (v2.5.4)38 para o genoma de referência mm10 (Mus musculus).
    1. Execute o bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1 para usar o índice Bowtie2 pré-construído fornecido pelos desenvolvedores.
    2. Correr bash Step5_2_download_reference_make_index_with_
      bowtie2.sh > Step5_2_log.txt 2>&1       para baixar a sequência do genoma MM10 bruto e construir o índice manualmente.
      NOTA: Ambas as abordagens geram um arquivo de índice para o diretório "reference_index/" e são funcionalmente equivalentes para alinhamento padrão.

6. Alinhe as leituras aparadas ao genoma de referência mm10

  1. Digite bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1 para alinhar as leituras de cada ensaio para referenciar e gerar arquivos BAM.
    NOTA: Esta etapa mapeia as leituras de cada ensaio para a referência mm10 indexada anteriormente. H3K27ac ChIP-seq e entrada correspondente usam mapeamento de extremidade emparelhada para precisão balanceada (-1, -2) com sensibilidade padrão. H3K4me1 ChIP-seq e entrada correspondente usam mapeamento de extremidade única nas configurações padrão (-U). O ATAC-seq usa mapeamento de alta sensibilidade para acomodar fragmentos variáveis e longos derivados de Tn5 (--muito sensível, -X 2000) com entrada de extremidade emparelhada (-1, -2). O GRO-seq usa mapeamento de alta sensibilidade para posicionar melhor leituras curtas e cortadas (--very-sensitive) com entrada de extremidade única (-U). Os arquivos SAM são convertidos para BAM e filtrados com a visualização samtools (v1.22.1)39 , usando MAPQ moderado para ChIP/entrada (-b, -q 10) e limites mais rígidos para ATAC-seq e GRO-seq (-b, -q 30); os arquivos BAM finais são gravados no diretório "02.Align/" de cada conjunto de dados.

7. Mesclar réplicas técnicas de dados H3K27ac ChIP-seq

  1. Execute o bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1 para mesclar réplicas técnicas do H3K27ac ChIP-seq e os arquivos BAM de entrada correspondentes.
    NOTA: Este script classifica arquivos BAM para replicações técnicas com a classificação sambamba (v1.0.1)40 e, em seguida, mescla H3K27ac ChIP-seq e replicações de entrada correspondentes em BAMs consolidados com mesclagem de sambamba. Se o conjunto de dados do usuário não contiver nenhuma réplica técnica, ignore esta etapa e prossiga com arquivos BAM individuais.

8. Remova duplicatas e cromossomos não essenciais

  1. Remova duplicatas e classifique as leituras mapeadas para ChIP-seq e GRO-seq.
    1. Digite bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1 para remover duplicatas dos conjuntos de dados ChIP-seq de histonas e classificar os BAMs de saída ChIP-seq e GRO-seq.
      NOTA: Este script remove duplicatas de PCR com marcação de sambamba (-r) e ordena por coordenadas com classificação de sambamba. Para H3K27ac, o processamento tem como alvo BAMs de replicações técnicas mescladas, manipulando ChIP e entrada separadamente. Para H3K4me1, cada entrada replicada e correspondente é processada individualmente. Para GRO-seq, a remoção de duplicatas é ignorada e somente a classificação por coordenadas é aplicada. As saídas são salvas no diretório "02.Align/" de cada conjunto de dados.
  2. Remova duplicatas e filtre leituras mapeadas por cromossomos mitocondriais do ATAC-seq.
    1. Digite bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1 para remover duplicatas de PCR, filtrar leituras mitocondriais (chrM) e classificar BAMs ATAC-seq.
      NOTA: Este script faz referência às recomendações de pipeline ENCODE para processamento de dados ATAC-seq. Ele começa executando a classificação de nomes com sambamba sort (-n) e corrigindo informações de pares de companheiros usando samtools fixmate (-m). Esta etapa garante que as informações de posicionamento sejam atribuídas corretamente antes de marcar duplicatas. Em seguida, as duplicatas de PCR são removidas usando a marcação sambamba (-r). As leituras mitocondriais são removidas gerando uma lista de manutenção de samtools idxstats (exclua chrM e *) e mantendo apenas as referências listadas com a visualização samtools (-b). A ordenação por coordenadas final é realizada com a ordenação do sambamba. Os BAMs limpos são gravados no diretório "02.Align/" de cada replicação.

9. Executar chamadas de pico para cada conjunto de dados

  1. Execute o script da etapa 9 digitando bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 para realizar chamadas de pico para dados ChIP-seq e ATAC-seq.
    NOTA: Este script executa chamadas de pico com MACS3 (v3.0.3)41 para ATAC-seq e ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1). O ATAC-seq gera picos fornecendo todos os BAMs replicados como sinal no modo sem modelo com deslocamento / extensão (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0,01). H3K27ac chama picos amplos de replicações técnicas mescladas com entrada correspondente (-f BAMPE, --broad). H3K4me1 processa cada réplica individualmente com sua entrada correspondente no modo amplo de extremidade única (-f BAM, --broad), e picos sobrepostos são obtidos com ferramentas de base (v2.31.1)42 se cruzam. As saídas são gravadas no diretório "peak_calling/" de cada conjunto de dados, com picos H3K4me1 de alta confiança em "peak_calling/overlapped_peak/".

10. Mesclar réplicas biológicas de arquivos ChIP-seq e ATAC-seq BAM para análise de sinal downstream

  1. Execute o bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1 para mesclar arquivos BAM de réplicas biológicas de ATAC-seq e H3K4me1 ChIP-seq.
    NOTA: Este script combina BAMs replicados com mesclagem de sambamba para ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq e entrada H3K4me1 correspondente. Os BAMs mesclados suportam análises downstream (por exemplo, geração de sinal bigWig, normalização). Os BAMs de saída são salvos em diretórios "merge/02.Align/" em cada caminho de amostra.

11. Gere diretórios de tags e sinalize arquivos bigWig a partir de leituras mapeadas

  1. Execute o bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1 para criar diretórios de tags e gerar arquivos de sinal bigWig para leituras mapeadas de cada conjunto de dados.
    NOTA: Este script cria diretórios de tags HOMER com makeTagDirectory e, em seguida, gera faixas de sinal bigWig com o comando makeUCSCfile usando os pacotes HOMER (v5.1)43 e ucsc-bedgraphtobigwig (v482)44 . Todas as trilhas de sinal são criadas usando arquivos de tamanho de cromossomo do UCSC Genome Browser (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/). O GRO-seq produz faixas de sinal específicas da fita (estilo rnaseq, -strand + / -, -bigWig). O ATAC-seq produz faixas não normalizadas a partir de BAMs mesclados (-bigWig). ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) produz faixas normalizadas por entrada com uma pseudocontagem de 1 (-bigWig, -i, -pseudo 1). As saídas são organizadas em "03.TagDir/" e "04.bigwig/".

12. Prepare arquivos para identificação do intensificador

  1. Digite bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 no terminal para preparar os arquivos necessários e referência para identificação do enhancer.
    NOTA: Esta etapa coleta todos os arquivos necessários para a identificação do aprimorador em "01.E_identification/material/", organizados nas pastas "ATAC/", "Histone/" e "Annotation/". Ele copia arquivos de pico (ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1) em diretórios apropriados. O arquivo de anotação GENCODE M23 (mm10) é baixado automaticamente e os arquivos de referência, incluindo ENCODE blacklist45 (mm10-blacklist.v2.bed) e arquivo de tamanho cromossômico (mm10.chrom.sizes) são copiados de um caminho predefinido.

13. Identifique candidatos a promotores e corpos gênicos a partir de anotações

  1. Digite cd 01.E_identification/ para entrar no diretório de trabalho e execute cp .. /scripts/Step{13..20}_*.sh ./ para copiar scripts de identificação do aprimorador.
  2. Execute o bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1 para gerar arquivos BED para regiões promotoras, corpos de genes e genes codificadores de proteínas (PCGs) usando a anotação GENCODE.
    NOTA: Este script processa o GENCODE M23 Gene Transfer Format (GTF) baixado para criar arquivos BED para candidatos a promotores, todos os corpos de genes e corpos de PCG, salvando as saídas em "material/Annotation/". Os promotores são definidos como uma janela de 2 kb em torno do TSS (Transcription Start Site) de cada transcrição com ferramentas de leito (-b 2000, -g mm10.chrom.sizes). Os corpos codificadores de genes e proteínas são derivados de entradas GTF anotadas como gene, com entradas codificadoras de proteínas filtradas por "gene_type = protein_coding".

14. Picos de processo para identificação do intensificador

  1. Execute o bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1 para pré-processar arquivos de pico ATAC-seq e histona ChIP-seq para identificação do intensificador.
    NOTA: Este script pré-processa conjuntos de picos para chamadas aprimoradas. Para ATAC-seq, ele remove regiões que se sobrepõem a regiões da lista negra com subtração de ferramentas de leito (-A) e, em seguida, exclui picos de candidatos a promotores sobrepostos com subtração de ferramentas de leito (-A); para marcas de histonas (H3K27ac, H3K4me1), ele expande simetricamente cada pico em 1 kb de cada lado com a inclinação das ferramentas de cama (-b 1000 -g mm10.chrom.sizes) e, em seguida, remove as sobreposições do promotor com a subtração das ferramentas de base.

15. Identifique e classifique os potenciadores

  1. Execute o bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1 para definir e classificar intensificadores usando dados de pico de cromatina.
    NOTA: Esta etapa define e anota aprimoradores usando ferramentas de base. Sobreposições entre picos ATAC-seq e picos H3K4me1 expandidos são obtidas com interseção (-wa, -u), e regiões que também se sobrepõem a picos H3K27ac flanqueados são classificadas como intensificadores ativos com interseção (-wa, -u); Os intensificadores não ativos são derivados da remoção de regiões ativas do conjunto completo de aprimoradores com subtrair. Os cumes ATAC-seq que se sobrepõem a cada conjunto de intensificadores são coletados com interseção (-u), então os cumes são divididos em intergênicos e intragênicos com interseção (-v ou -u) contra o corpo gênico. Os intervalos intensificadores são finalmente atribuídos a classes intergênicas / intragênicas com base no cume associado ao pico com a interseção (-u). Todos os resultados são salvos em "01.E_identification/" em "01.allE/", "02.interE/" e "03.intraE/".

16. Atribua informações temporárias de fita a intensificadores intragênicos

  1. Digite bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1 para atribuir informações temporárias de fio ao BED intragênico.
    NOTA: Esta etapa atribui rótulos de fita genética a intensificadores intragênicos sobrepondo intervalos de intensificadores com corpos gênicos usando ferramentas de cama que se cruzam (-wa, -wb). As colunas 1, 2, 3, 4, 5, 16 são retidas com awk e, em seguida, os registros são classificados e desduplicados. A saída é salva como "03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed".

17. Priorize a atribuição de fitas para intensificadores que se sobrepõem a genes de ambas as fitas

  1. Digite bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1 para resolver a direção da fita para genes sobrepostos de intensificadores intragênicos em ambas as fitas.
    NOTA: Este script resolve a ambiguidade da fita para genes sobrepostos de intensificadores intragênicos em ambas as fitas, priorizando as sobreposições de PCG. Os intensificadores presentes em ambas as fitas são isolados primeiro (agrupamento awk por cromo/início/fim/id/fita), os casos sobrepostos de PCG na mesma fita são selecionados com a interseção de ferramentas de leito (-s, -wa, -u) e os casos não PCG são retidos com a interseção de ferramentas de leito (-v). Os conjuntos selecionados e retidos são concatenados e ordenados. Saída: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed".

18. Calcule os valores de leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas (RPKM) específicas da fita para genes que se sobrepõem a intensificadores intragênicos priorizados por PCG

  1. Digite bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1 para calcular RPKM específico da fita para genes sobrepostos em intensificadores na mesma fita.
    NOTA: Esta etapa usa "ES_E_intragenic_PCG_priority.bed" da Etapa 17, que contém intensificadores que (i) sobrepuseram um PCG em uma fita e receberam uma fita, (ii) sobrepuseram PCGs em ambas as fitas e permaneceram ambíguos, ou (iii) não tiveram sobreposição de PCG e mantiveram ambas as fitas. Genes sobrepostos da mesma fita são selecionados com ferramentas de cama se cruzam (-s, -wa, -u), convertidos em GTF via awk e quantificados a partir de GRO-seq com featureCounts (v2.1.1)46 modo de contagem específico da fita (-s 1, -t gene, -g gene_id, -O, --fraction). O total de leituras mapeadas é obtido com o flagstat do sambamba e o RPKM é calculado a partir do comprimento, contagem e totais do gene. As saídas são gravadas em "03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/".

19. Atribuição final de fita com base na expressão gênica (RPKM) de genes sobrepostos

  1. Digite bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1 para finalizar a atribuição de fios para intensificadores intragênicos.
    NOTA: Esta etapa atribui fitas a intensificadores intragênicos usando suporte de expressão gênica da Etapa 18. Sobreposições da mesma fita entre intensificadores (ES_E_intragenic_PCG_priority.bed) e genes são encontradas com ferramentas de cama que se cruzam (-s, -wa, -wb). Os valores de RPKM do gene são unidos aos intervalos do gene por meio de awk/sort/join, produzindo BED de RPKM do gene. Para cada intensificador, o gene sobreposto com o RPKM mais alto é selecionado e o intensificador herda a fita desse gene. Os resultados são salvos em "03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed".

20. Atribua informações de fita a intensificadores intragênicos e cumes de intensificadores

  1. Digite bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1 para atribuir informações de fita decidida a todos os intensificadores intragênicos e a cada cume.
    NOTA: Esta etapa finaliza a atribuição de fios para intensificadores intragênicos e cumes correspondentes usando ferramentas de cama. Os intervalos de fita oposta são removidos com subtração (-S), os intensificadores designados pela fita são interceptados com conjuntos ativos e não ativos usando interseção (-wa, -u) e os arquivos de cume são reanotados por cumes sobrepostos com intensificadores designados por fita via interseção (-wa, -wb) e obter fita com awk. Os resultados são salvos em "03.intraE/final_strand_IntragenicE/" e sua subpasta "summit/".

21. Prepare arquivos de entrada para validação do intensificador, quantificação de eRNA e visualização

  1. Tipo cd .. / ou cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization para mover para a raiz do pipeline e, em seguida, digite cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ para copiar o script para preparação da análise downstream.
  2. Execute o bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1 para preparar todos os arquivos necessários para agregação de enhancer, processamento de sinal GRO-seq e quantificação de eRNA.
    NOTA: Esta etapa prepara os arquivos de entrada e a estrutura de diretórios para validação do aprimorador, quantificação de eRNA e visualização de sinal em "02.E_visualization_quantification/". As subpastas são criadas para arquivos bigWig, BEDs aprimoradores, BAMs, matrizes de sinal, contagens e gráficos. As principais entradas, como BEDs de cúpula, bigWigs, listas de intensificadores e BAMs GRO-seq, são copiadas para os locais apropriados.

22. Gerar gráficos de agregação para validação do aprimorador

  1. Digite cd 02.E_visualization_quantification/ para entrar no diretório de trabalho e, em seguida, digite cp .. /scripts/Step{22..24}_*.* ./ para copiar os scripts necessários para análise downstream.
  2. Execute o bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2>&1 para gerar gráficos de agregação de sinais de cromatina em torno de cada tipo de ápice de intensificador.
    NOTA: Esta etapa visualiza o enriquecimento médio do sinal de cromatina centrado em cumes intensificadores usando computeMatrix e plotProfile de deepTools (v3.5.6)47. Para cada conjunto de intensificadores definido, o ponto de referência computeMatrix (--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero) calcula a densidade do sinal em uma janela de 10 kb em torno de cumes de intensificadores usando arquivos bigWig para ATAC-seq, H3K27ac e H3K4me1. A matriz de saída é passada para plotProfile, que gera curvas de agregação de sinal para comparação entre grupos de intensificadores. Os gráficos de agregação são salvos no diretório "01.Profiling/04_1.aggregation/".

23. Quantificar e visualizar a expressão do RNA intensificador

  1. Execute o bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1 para quantificar os níveis de expressão de eRNA do GRO-seq usando featureCounts.
    NOTA: Esta etapa quantifica a transcrição de eRNA de regiões intensificadoras definidas de maneira específica da fita usando GRO-seq. Os intensificadores intergênicos são contados com featureCounts no modo não encalhado (-s 0, -t enhancer, -g gene_id, -O, --fraction) e os intensificadores intragênicos são quantificados no modo antisense (-s 2) para excluir o sinal da transcrição gênica sobreposta. As regiões BED são convertidas em GTF com awk antes da contagem. O total de leituras mapeadas vem do flagstat do sambamba e as contagens são normalizadas para RPKM usando o comprimento do aprimorador, as contagens de leitura e o total de leituras mapeadas. As saídas são organizadas em "02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/" por "inter/" e "intra/".
  2. Execute o Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript. R > Step24_log.txt 2>&1 para visualizar e comparar os níveis de expressão de eRNA entre grupos de intensificadores usando R.
    OBSERVAÇÃO: o script R usa os pacotes ggplot2 (v3.5.2)48 e cowplot (v1.2.0)49 para gerar gráficos de violino e caixa comparando a expressão do aprimorador ativo e não ativo com base em valores RPKM. Para visualização e teste estatístico, os valores de RPKM são transformados em log2 (RPKM + 1). A significância estatística é avaliada usando o teste de soma de postos de Wilcoxon. Os gráficos de resumo e a tabela de valores-p são salvos em "03.eRNA_visualization/" para interpretação a jusante.
    NOTA: Se alguma etapa nesse pipeline falhar e persistir mesmo após a nova execução, relate o problema em https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to visualização/problemas. Declarar claramente a etapa com falha e anexar o arquivo de log garante um suporte preciso à solução de problemas.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluxo de trabalho esquemático para pipeline de quantificação de transcrição do intensificador
Os conjuntos de dados ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq e GRO-seq disponíveis publicamente (Tabela 1) foram processados com um pipeline padronizado projetado principalmente para validação. O corte do adaptador e a filtragem de qualidade foram realizados com Trim Galore e Cutadapt, seguidos de alinhamento ao genoma de referência mm10 usando Bowtie2 (detalha...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Após a descoberta de transcritos derivados de intensificadores 13,14,15, quantificar com precisão os eRNAs continua sendo um grande desafio, particularmente em contextos intragênicos onde os eRNAs geralmente se sobrepõem aos transcritos do gene do hospedeiro. Essa sobreposição complica a atribuição de fitas e a atribuição de sinais, dificultando a distinção da transcrição genuína do intensificad...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pelo fundo de pesquisa da Universidade Nacional de Chungnam [2022-0582-01 (S.-K.K.) e 2023-0545-01 (S.-K.K.)], Coreia do Sul. A Figura 1 foi criada usando o BioRender (https://biorender.com/).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ferramentas de camaQuinlan Lab, Universidade de Utah & nbsp;v2.31.1Utilitários para edição de arquivos BED
gravata-borboleta 2Langmead Lab, Universidade Johns Hopkinsv2.5.4Alinhador multithread para mapeamento de leituras a um genoma de referência
CowplotWilke Lab, Universidade do Texasv1.2.0Ferramentas para combinar e alinhar figuras baseadas em ggplot2
cutadaptLaboratório Ciência para a Vida, Universidade de Estocolmov5.1Adaptador e aparador de cauda poli-A/G
DeeptoolsInstalação de Bioinformática, Instituto Max Planckv3.5.6Ferramenta de contagem de leituras para quantificar leituras em regiões genômicas definidas
fastqcBabraham Bioinformática, Instituto Babrahamv0.12.1Controle de qualidade para leituras de sequenciamento
FeatureCounts (sublê)Shi Lab, Universidade Monashv2.1.1Ferramentas brutas de contagem de leitura para regiões genômicas específicas
HomeroLaboratório Benner, Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD)v5.1Kit de ferramentas para análise de ChIP-seq, ATAC-seq e RNA nascente; Inclui criação de diretórios de tags e perfilamento de sinais
MACS3Iniciativa Chan Zuckerbergv3.0.3Chamadas de pico para conjuntos de dados ChIP-seq e ATAC-seq
pigz.v2.8Ferramenta de compressão multithreaded para gerar arquivos comprimidos em gzip
SammbaUniversidade Estadual de Petersburgv1.0.1Kit de ferramentas para processamento de arquivos SAM/BAM multithreaded
samtoolsInstituto Wellcome Trust Sangerv1.22.1Ferramentas para processar e manipular arquivos SAM/BAM
SRA-FerramentasCentro Nacional de Informação em Biotecnologia (NCBI)v3.2.0Para baixar arquivos SRR do banco de dados SRA do NCBI
tidyversePosit PBCv2.0.0Coleção de pacotes R para manipulação e visualização de dados
Trim-galoreAltos Labs, Instituto de Ciências de Cambridgev0.6.10Adaptador e acabamento de base de baixa qualidade usando multi-rosca
Ubuntu 20.04Desenvolvimento e teste do pipeline
ucsc-bedgraphtobigwig Kent Lab, Universidade da Califórnia Santa Cruzev482Ferramentas para gerar trilhas de sinal de grandes empresas

Referências

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