Artigo de investigação

Investigação de um dispositivo LED de luz azul para suprimir patógenos de feridas usando um modelo de pele sintética à base de colágeno

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DOI:

10.3791/69403

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24 de fevereiro de 2026

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1School of Engineering Technology and Applied Sciences (SETAS), Centennial College, 2Cofan Thermal/Violumas

Neste artigo

Resumo

Um dispositivo LED de luz azul de 405 nm demonstra eficácia antimicrobiana contra uma ampla gama de patógenos de feridas quando avaliado em um modelo de pele sintética à base de colágeno. Essa abordagem simplificada in vitro oferece uma alternativa reprodutível e eticamente viável para avaliação em fases iniciais de terapias antimicrobianas baseadas em luz.

Resumo

O manejo convencional de feridas está cada vez mais desafiado pelo aumento da resistência antimicrobiana e pelos efeitos colaterais citotóxicos dos agentes tradicionais. A fototerapia, especialmente usando luz azul (BL), oferece uma alternativa promissora não invasiva e sem contato. Este estudo avaliou a eficácia e segurança antimicrobiana de um dispositivo BL-LED de 405 nm contra um amplo espectro de patógenos de feridas medicamente importantes, utilizando um modelo sintético de pele à base de colágeno, enfatizando a novidade de aplicar essa plataforma para testes antimicrobianos baseados em luz. Essa pele sintética proporciona um ambiente mais realista, imitando a estrutura e topografia da pele humana. O mapeamento de uniformidade da luz mostrou irradiância consistente em um diâmetro de 10 cm (30,14 ± 0,78 mW/cm2). O dispositivo alcançou uma redução substancial dos logaritariths microbianos dependentes da fluência, de até 3,5 a 27 J/cm2, demonstrando eficácia consideravelmente maior do que a relatada em estudos semelhantes. Sua atividade de amplo espectro foi confirmada contra patógenos ESKAPE e Candida albicans, uma vantagem significativa para o manejo de infecções polimicrobianas de feridas. Um achado chave foi a suscetibilidade diferencial entre as espécies, com Klebsiella pneumoniae apresentando a maior suscetibilidade, enquanto Staphylococcus aureus mostrou-se a mais resistente. Isso provavelmente se deve a variações na estrutura do envelope microbiano e no conteúdo de moléculas fotossensíveis, que afetam as espécies reativas de oxigênio (ROS). Experimentos de transmissão óptica e análises de superfície versus colônia embutida não revelaram significância estatística, sugerindo a possível aplicação do BL para inibir patógenos sob a pele. A espectroscopia infravermelha confirmou que a exposição ao BL, mesmo em fluências altas (108 J/cm 2), não causou degradação química ou conformacional detectável da matriz de colágeno, ao contrário dos efeitos prejudiciais observados com o controle germicida UV-C. Por fim, uma avaliação única em uma câmara de aerossol demonstrou que o tratamento com BL reduziu a deposição microbiana nas superfícies em mais de 95%, destacando seu potencial para mitigar infecções nosocomiais. Esses achados demonstram a adequação de substratos que imitam a pele como alternativa acessível para avaliar o BL em testes pré-clínicos, eliminando assim a necessidade de modelos animais.

Introdução

As infecções nas feridas representam um desafio persistente e um fardo significativo para o sistema global de saúde, afetando a qualidade de vida dos pacientes. A cicatrização das feridas é frequentemente complicada por infecções microbianas que atrasam o fechamento das feridas cutâneas, resultando em lesões e feridas crônicas predominantemente em populações idosas e diabéticas. Estratégias convencionais de manejo de feridas dependem de antibióticos, antissépticos, produtos químicos e agentes bioativos naturais que suprimem principalmente os organismos causadores de feridas. Embora esses métodos tradicionais sejam eficazes para acelerar o processo de cicatrização ao reduzir células inflamatórias e aumentar o número defibroblastos, eles estão associados a muitos efeitos colaterais. Muitos antimicrobianos tópicos usados em curativos geralmente não são amigáveis para a pele e podem levar a efeitos indesejáveis, como desidratação da pele, irritação dos tecidos e efeitos citotóxicos nas células necessárias para o processo de cicatrizaçãoda ferida 2. A resistência antimicrobiana (RAM), amplamente relatada devido ao uso excessivo deantimicrobianos 3, principalmente o uso de antibióticos sistêmicos, ameaça a viabilidade a longo prazo dos tratamentos farmacológicos existentes. Considerando essas limitações da prática clínica existente, enfatiza-se a necessidade de alternativas mais seguras e sustentáveis para o manejo de feridas, especialmente os métodos sem contato e sem dor, como a fototerapia.

A fototerapia, aproveitando o espectro visível da luz, tem ganhado progressivamente destaque como uma intervenção promissora não invasiva e não farmacológica para diversas aplicações dermatológicas e terapêuticas. Suas aplicações vão desde o rejovenimento geralda pele e aprimoramentos cosméticos até tratamentos direcionados para condições como acne e terapias anti-envelhecimento. Entre os comprimentos de onda visíveis (400-760 nm), a luz azul, tipicamente variando de 400 nm a 480 nm, tem despertado grande interesse científico e clínico devido ao seu potencial terapêuticomultifacetado 5. Em contraste com a radiação ultravioleta (UV), especialmente a banda UV-C (100-280 nm), amplamente utilizada para desinfecção superficial devido às suas propriedades germicidas, mas apresenta riscos bem documentados de danos ao DNA, carcinogênese e câncer de pele, a luz azul é classificada como radiação não ionizante. Essa diferença fundamental torna a luz azul inerentemente mais segura para os tecidoshumanos 5, pois ela não possui energia para danificar diretamente o DNA celular ou induzir efeitos mutagênicos.

A atividade antimicrobiana da luz azul foi relatada tanto contra bactériasGram-positivas 6 quantoGram-negativas 7 . Alguns ensaios clínicos foram realizados para validar o uso da terapia de luz azul contra infecções ou distúrbioscomuns 8, por exemplo, a supressão do Propionibacterium acne que causa acnevulgar 9, e o tratamento para infecções estomacais10 causadas por Helicobacter pylori. No entanto, ensaios clínicos que investigam a eficácia antimicrobiana de infecções de feridas não foram relatados. Um número crescente de estudos recentes in vitro demonstra que a luz azul-violeta (400-420 nm) é capaz de inativar múltiplos patógenos ESKAPE enquanto mantém citotoxicidade mínima para células demamíferos 11. Recentemente, a luz azul na faixa de 410-430 nm demonstrou modular a atividade dos fibroblastos e a deposição de colágeno, promover a proliferação celular, regular respostas inflamatórias e gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) por meio da excitação endógena de porfirina que desregula as célulasbacterianas 12, tornando-a uma candidata promissora para aplicações de cicatrização de feridas.

No entanto, a complexidade da cicatrização de feridas, determinada por múltiplas variáveis incluindo variância individual, tipo de ferida e condições fisiológicas e patológicas pré-existentes, representa desafios significativos para a pesquisa. O teste direto in vivo das terapias de feridas continua sendo complicado devido à variabilidade biológica, considerações éticas e à complexidade dos ambientes das feridas. Modelos animais, embora comumente utilizados, frequentemente não representam com precisão a fisiologia da pele humana e são limitados por rigorosos requisitosregulatórios 13. Estudos de cicatrização envolvendo ensaios clínicos são raros e frequentemente raramente representativos devido ao tamanho reduzido da amostra, exigindo grandes amostras estatísticas, controles robustos e aprovações éticas rigorosas. Para superar essas barreiras, modelos in vitro que replicam propriedades da pele humana surgiram como plataformas eficazes para triageminicial 14. Sistemas sintéticos à base de colágeno, como o VITRO-Skin, imitam a pele humana em pH, retenção de umidade e textura superficial, sendo ideais para testar intervenções externas sob condiçõescontroladas 15. Embora vários estudos tenham demonstrado efeitos antimicrobianos de amplo espectro da luz azul, a maioria utilizou culturas de caldo, placas de ágar ou modelos animais, com aplicação limitada em substratos semelhantes à pele.

Aproveitando o potencial demonstrado da luz azul e as vantagens dos modelos in vitro , o estudo atual visa testar a eficácia de um dispositivo de Diodo Emissor de Luz (LED) operando em um comprimento de onda máximo de 405 nm para suprimir patógenos comuns de feridas. Introduzimos uma metodologia inovadora de avaliação para avaliar a eficácia da cicatrização de feridas, baseada em um modelo simplificado de microbioma aplicado à pele sintética à base de colágeno. Também compara a eficácia antimicrobiana e o impacto na topografia da pele da luz azul gerada por diodo emissor de luz (LED-BL) contra a fluência germicida UV-C. Embora esse método não tenha a complexidade dos sistemas biológicos, adota uma abordagem pragmática que permite experimentos altamente controlados e reprodutíveis que contornam a variabilidade e as complexidades éticas associadas a estudos in vivo e ensaios clínicos, acelerando assim a avaliação preliminar e a triagem inicial de intervenções terapêuticas inovadoras semelhantes. A inovação central deste trabalho está na aplicação de um modelo de pele baseado em colágeno como uma plataforma reprodutível e controlável para avaliar a eficácia antimicrobiana à luz azul, acompanhada por penetração óptica, uniformidade e análises de segurança baseadas em FTIR.

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Protocolo

1. Preparação de amostras de pele sintética

Uma folha de modelo sintético de pele à base de colágeno (VITRO-Skin) foi cortada em amostras retangulares medindo 5,0 cm × 2,5 cm sob condições assépticas em um armário de biossegurança. Cada amostra era colocada em uma placa de Petri estéril e armazenada a 4 °C até o uso. Antes da inoculação, as amostras foram equilibradas à temperatura ambiente e hidratadas em uma câmara de umidade conforme as instruções do fabricante para imitar o nível de hidratação da pele humana.

2. Preparação de culturas microbianas

Cepas de referência da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Acinetobacter baumannii (ATCC 19606), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) e Candida albicans (ATCC 10231), foram usados. Colônias individuais foram inoculadas em 5 mL de Caldo de Soja Tripptico (TSB) sob condições assépticas. Culturas bacterianas foram incubadas a 35 °C por 24 horas, e culturas fúngicas foram incubadas a 22 °C por 5 dias. Após a incubação, a turbidez foi ajustada para 0,5 McFarland Standard (aproximadamente 1,5 × 10⁸ CFU/mL) usando Soro Tamponado Fosfatado Estéril (PBS) para ensaios antimicrobianos.

3. Inoculação de modelos de pele sintética

Cada seção de pele sintética hidratada foi inoculada com 100 μL de suspensão microbiana e distribuída uniformemente usando um espalhador descartável estéril. As superfícies inoculadas foram secas ao ar por 15 minutos em uma câmara estéril sob condições laboratoriais ambientes (22-24 °C, 60%-70% HR). As amostras foram distribuídas em três grupos: controle não tratado (Grupo A), fonte de luz (LED de luz azul, 405 nm), irradiação (Grupo B) e irradiação com LED UV-C (265 nm) (Grupo C). A Figura 1 mostra a representação esquemática dos experimentos na avaliação da eficácia antimicrobiana da fonte de luz usando o modelo de pele sintética.

4. Configuração da fonte de luz e irradiação

Um dispositivo LED de luz azul de 405 nm foi montado em um dissipador de calor de alumínio para evitar o acúmulo de calor e garantir a irradiação termicamente segura de amostras sintéticas de pele (Figura 2). A irradiância era medida no plano exato de tratamento usando um medidor de potência óptica calibrado, com a altura da sonda ajustada para levar em conta a espessura do sensor. A irradiância de trabalho foi padronizada para 30 mW/cm² ajustando a distância de tiro do LED.

A uniformidade da iluminação em todo o campo de tratamento foi verificada medindo a irradiância em 16 pontos espaçados uniformemente, resultando em uma média de 30,14 ± 0,78 mW/cm² (Figura 3). Para comparação inicial dos efeitos germícidas, tratamentos UV-C foram realizados usando uma fonte LED de 265 nm que forneceu 3 mW/cm² a uma distância de 20 cm por 2 minutos.

A fluência foi calculada como irradiância × tempo de exposição e correspondia a 27 J/cm² para luz azul (30 mW/cm² × 900 s) e 3,6 J/cm² para UV-C.

Para ensaios antimicrobianos, amostras sintéticas hidratadas inoculadas com suspensões microbianas foram colocadas assépticamente em placas de Petri estéreis (tampas removidas) e posicionadas diretamente sob o LED de luz azul. As amostras atribuídas ao grupo de irradiação (Grupo B) foram expostas continuamente até que a fluência alvo fosse atingida (15 min). A duração de exposição de 15 minutos (27 J/cm²) foi selecionada com base em experimentos preliminares de time-kill, que demonstraram eficácia antimicrobiana consistente entre espécies, representando uma duração prática de exposição para potenciais aplicações clínicas ou no ponto de cuidado. A temperatura de cada amostra era monitorada a cada 5 minutos usando um termômetro infravermelho sem contato para confirmar que não havia aquecimento significativo durante a iluminação. O monitoramento de temperatura não revelou aumento mensurável na temperatura superficial (>2 °C) durante a irradiação de luz azul, confirmando que os efeitos antimicrobianos observados não foram térmicos.

5. Eficácia antimicrobiana da luz azul, LED e UV-C contra patógenos de feridas

Após o tratamento, cada amostra sintética de pele foi transferida para um tubo estéril de 15 mL contendo 9,0 mL de PBS (pH 7,4). Os tubos foram cuidadosamente vórtices por 1 minuto para deslocar microrganismos aderentes à superfície. Diluições seriadas de dez vezes foram preparadas, e alíquotas de 100 μL foram placadas em ágar de soja tríptico (TSA) para bactérias e ágar de Sabouraud Dextrose (SDA) para fungos. Placas foram incubadas (bactérias a 35 °C por 24 horas; fungos a 22 °C por 5 dias) e unidades formadoras de colônia (CFUs) foram enumeradas. A redução microbiana foi quantificada usando as seguintes equações:

Redução logarítmica =log 10(A) - log10(B)

Redução Percentual = ((A - B)/A) × 100

Onde A = contagem de CFU do controle; B = Contagem de UFC de amostras tratadas.

Os controles negativos consistiram em placas apenas de meio e PBS para verificar a esterilidade, enquanto amostras inoculadas não tratadas foram usadas para comparar a eficácia do tratamento. Placas controle positivas consistiam em suspensões microbianas do ATCC inoculadas para confirmar a viabilidade da cultura. Todas as etapas experimentais foram realizadas em condições assépticas.

6. Eficácia antimicrobiana dependente do tempo da irradiação de luz azul

Para avaliar o efeito dependente da fluência, as durações de exposição à luz azul foram definidas para 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min e 30 min. A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio da enumeração da CFU conforme acima, permitindo a análise das relações dependentes da dose.

7. Eficácia do LED com luz azul em uma câmara aerossolizada simulando condições nosocomiais

Uma câmara de aerossol acrílico personalizada, sob condições ambientais controladas, foi usada para simular a exposição nosocomal pelo ar (Figura 4). Suspensões microbianas aerossolizadas (~1,5 x 106 CFU/mL) foram introduzidas usando nebulizador, e amostras sintéticas de pele foram expostas por 30 minutos. A luz azul era direcionada para as amostras durante toda a exposição (10 μW/cm², distância de 20 cm). No experimento de controle, condições de exposição idênticas foram aplicadas, mas o dispositivo BL-LED permaneceu desligado. As densidades celulares microbianas dentro da câmara de aerossol foram monitoradas usando medições de atividade de precipitação, nas quais as placas de ágar foram colocadas dentro da câmara antes da exposição. Células microbianas viáveis aderidas às amostras sintéticas da pele (2 cm x 2 cm) foram quantificadas usando análise padrão de contagem de placas, conforme descrito acima. Essa baixa irradiância (10 μW/cm²) foi selecionada para imitar condições reais de iluminação ambiente em ambientes de saúde, onde a irradiação contínua de alta intensidade não é viável.

8. Transmissão óptica e testes de colônias embutidas

  1. Transmissão óptica através de substrato sintético de pele
    Para quantificar a penetração da luz azul através da pele sintética, a irradiância foi medida usando um medidor de potência óptica calibrado posicionado no plano de tratamento. A intensidade BL (405 nm, 30 mW/cm²) foi registrada com e sem amostras sintéticas hidratadas colocadas horizontalmente entre o LED e o detector. A transmissão (%) foi calculada como a razão entre irradiância transmitida (com pele) e irradiância incidente (sem pele).
    A transmissão em condições aquosas foi avaliada usando um espectrofotômetro UV-Vis. Uma tira sintética hidratada para a pele foi inserida verticalmente em uma cubeta padrão de poliestireno preenchida com água desionizada. A cuveta cheia de água servia apenas como vazio. A absorção em 405 nm foi registrada, e a porcentagem de transmissão foi calculada usando %T = 10(-A) × 100.
  2. Validação funcional usando ensaio de colônia embutida
    Ensaios de redução microbiana em colônias de superfície e de colônia embutida foram realizados como um correlato funcional da transmissão, onde amostras foram inoculadas em uma superfície, mas irradiadas do lado oposto (inferior) para simular microrganismos residindo sob a superfície da pele. As CFUs foram quantificadas conforme descrito acima na seção sobre eficácia antimicrobiana.

9. Espectroscopia FT-IR para degradação sintética da pele após exposição à luz azul e UV-C

Para avaliar possíveis alterações químicas e estruturais na matriz sintética da pele à base de colágeno devido à exposição à luz, foi realizada espectroscopia de Transformada de Fourier no Infravermelho (FT-IR). Amostras sintéticas de pele (2 cm × 2 cm) foram hidratadas conforme as instruções do fabricante, de forma idêntica às amostras usadas nos ensaios de redução microbiana. Amostras hidratadas foram expostas a luz azul de 405 nm (30 mW/cm²) ou UV-C de 265 nm (3 mW/cm²) por 15 minutos (exposição padrão, 27 J/cm²) ou 60 minutos (condição de estresse no pior caso). Após a irradiação, as amostras foram suavemente aplicadas para remover a umidade superficial e imediatamente analisadas por FT-IR.

10. Medição ATR-FTIR

Os espectros eram adquiridos usando um espectrofotômetro IR equipado com um software de análise compatível. Todas as amostras foram analisadas usando o módulo iD7 de Reflectância Total Atenuada (ATR). Para isolar alterações espectrais atribuíveis à irradiação, (1) Foi realizada uma comparação espectral direta entre controles não tratados e amostras irradiadas. (2) Comparações subtraídas pela linha de base foram realizadas usando a amostra controle não tratada como referência de fundo antes de escanear as amostras irradiadas, permitindo visualização apenas dos picos novos ou alterados.

Essa abordagem dupla reduz o ruído topográfico e melhora a detecção de mudanças sutis nas regiões de amida e impressão digital. Nível de hidratação, espessura da amostra e orientação foram padronizados em todas as amostras para reduzir a variabilidade espectral. Cada condição de exposição (controle, BL-15 min, BL-60 min, UV-15 min, UV-60 min) foi escaneada em triplicado.

11. Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados usando triplicados biológicos independentes, salvo indicação em contrário. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DS) ou como média com intervalos de confiança (IC) de 95%, conforme indicado nas legendas das figuras. A normalidade da distribuição dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro-Wilk. Comparações par a par entre dois grupos (por exemplo, luz azul vs. UV-C, colônias de superfície vs. embutidas) foram realizadas usando testes t de Student bicaudais sem pareamento. Para comparações envolvendo mais de duas condições ou pontos de tempo, foi aplicada uma análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida de testes post-hoc apropriados. O teste estatístico específico usado para cada comparação é indicado na legenda correspondente da figura. Um valor p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

Eficácia antimicrobiana da luz azul, LED e UV-C contra patógenos de feridas
O dispositivo LED de luz azul (405 nm), operado a uma intensidade de 30 mW/cm² por 15 minutos, demonstrou eficácia antimicrobiana significativa contra todos os patógenos de feridas testados em modelos de pele sintética (Figura 5). Entre as espécies testadas, Klebsiella pneumoniae apresentou a maior suscetibilidade à luz azul, com uma redução média de 3,4 ...

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Discussão

Este estudo demonstra o potencial antimicrobiano significativo de um dispositivo LED de Luz Azul (BL-LED) de 405 nm contra um painel de patógenos de feridas clinicamente relevantes testados em modelos sintéticos de pele à base de colágeno. A exposição ao BL-LED em uma fluência de 27 J/cm² alcançou uma redução de até 3,5 logaritaritários na carga microbiana (Figura 6), superando o desempenho antimicrobiano relatado em vários estudos anteriores 6,7,17,18,...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado (W24-21) pela "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Canadá. Os suprimentos microbianos e as instalações BSL-2 foram fornecidos pela "Applied Biological and Environmental Sciences (ABES), Centennial College, Canadá. Os autores apreciam a orientação fornecida por Andrew Baer e Gillian Goring em espectroscopia FT-IR e pela equipe da sala de preparação por sua ajuda na preparação e esterilização da mídia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acinetobacter baumannii  ATCC O Centro Global de BiorecursosATCC 19606
Luz azul - Diodo de Emissão de Luz  ViolumasN/ABL-LED é um protótipo, portanto não possui número de catálogo & nbsp;
Candida albicans  ATCC O Centro Global de BiorecursosATCC 10231
Enterobacter aerogenesATCC O Centro Global de BiorecursosATCC 13048
Escherichia coliATCC O Centro Global de BiorecursosATCC 25922
Transformada de Fourier Infravermelho   (FT-IR) Espectrofotômetro Nicolet iS5Termo CientíficaIQLAADGAAGFAHDMAZAO software OMNIC é usado para análise
Módulo de Transmissão de Feixe Direto FT-IR Nicolet iS5 iD1 (Adaptador Base)Termo CientíficaIQLAADGAAGFAJAMAYX
FT-IR Nicolet iS5 iD7 Módulo de Refração Interna Atenuada por DiamanteTermo CientíficaIQLAADGAAGFAJAMBFN
Incubador Percival Scientific & nbsp;9330.01.06L
Teromômetro IRThermo Fisher Scientific   06-664-254
Klebsiella pneumonia  ATCC O Centro Global de BiorecursosATCC 13883
Soro Tamponado com FosfatoThermo Fisher Scientific   AM9624Número de catálogo PBS (Thermo Fisher Scientific) & nbsp;
Pseudomonas aeruginosaATCC O Centro Global de BiorecursosATCC 27853
Ágar de Sabouraud DextroseBD Difco & nbsp;DF0109-17-1Número de catálogo SAB (BD Difco)
Staphylococcus aureus  ATCC O Centro Global de BiorecursosATCC 25923
Ágar de Soja TripptoBD DifcoDF0369-17-6Número do catálogo TSA (BD Difco)
Caldo de Soja TripticoBD Difco & nbsp;DF0370-17-3Número do catálogo TSB (BD Difco)
UV-LEDViolumasN/AUV-LED é um protótipo, portanto não possui número de catálogo  
Espectrofômetro UV-VIZ (Varredura UV Genesys 10)Thermo Scientific & nbsp;335907P
Vitro-SkinMEDELINKSKU24000Vitro-Skin

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