Artigo de método

Uma Técnica Simples de Microaspiração para Isolar Células Somáticas de Sêmen Equino Criopreservado como Doadores Nucleares para Clonagem

DOI:

10.3791/69404

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19 de dezembro de 2025

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1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo apresenta uma técnica simples de microaspiração para isolar células somáticas (SCs) viáveis a partir do sêmen criopreservado de equinos. Diferentemente das abordagens tradicionais, essa técnica evita cultivos in vitro prolongados e supera a contaminação por espermatozoides, permitindo o uso imediato na clonagem de células somáticas.

Resumo

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O sêmen é um fluido complexo que, além dos espermatozoides, contém outras populações celulares, incluindo células imunes, células germinativas masculinas imaturas, células epiteliais e fibroblastos. Essas células compartilham a condição diploide, tornando-as candidatas adequadas como doadoras nucleares para clonagem de transferência nuclear de células somáticas (SCNT). A geração de embriões e descendentes viáveis foi demonstrada usando essas células. Métodos eficazes para isolá-los do sêmen incluem centrifugação e técnicas de gradiente osmótico; No entanto, períodos prolongados de cultura in vitro são necessários para estabelecer culturas primárias a partir dessas células isoladas. Além disso, as amostras obtidas continham uma alta carga de espermatozoides, o que interfere no estabelecimento e manutenção das culturas in vitro . Até o momento, culturas primárias só foram estabelecidas com sucesso a partir de amostras frescas de sêmen, enquanto tentativas com sêmen criopreservado têm fracassado consistentemente. Essa limitação restringe significativamente o potencial de gerar clones a partir de amostras de sêmen criopreservadas. O presente estudo propõe uma metodologia simples baseada em microaspiração para isolar células somáticas a partir do sêmen criopreservado de equinos. Essa abordagem permite a rápida recuperação de um número suficiente de células para uso imediato em procedimentos de clonagem SCNT.

Introdução

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A clonagem de transferência nuclear por células somáticas é uma ferramenta inestimável para o resgate e multiplicação de indivíduos de interesse zootécnico e científico. Diversas linhagens celulares foram usadas como doadoras nucleares, incluindo células derivadas de pele, músculo, granulosa, linfócitos e célulasurinárias 1,2,3,4. Curiosamente, o sêmen surgiu como uma alternativa inovadora para a coleta de células somáticas (SCs) para serem usadas como doadores nucleares naclonagem de 5,6. Essa descoberta é particularmente importante para o resgate de indivíduos para os quais apenas o sêmen foi preservado. No entanto, o estabelecimento de culturas primárias a partir de SCs isolados de sêmen congelado não teve sucesso e, até o momento, continua sendo o principal obstáculo para a obtenção de animais clonados dessafonte 7,8,9. Essas células provavelmente se originam de epitélios glandulares e do revestimento dos túbulos, de secreções seminais e—importante—da contaminação seminal com urina, sendo esta última uma fonte bem conhecida de células somáticas com alto potencial proliferativo eindiferenciado 3.

Diversos métodos para isolar os SCs do sêmen foram implementados, incluindo centrifugação5, gradientes osmóticos7, 8, 10 e citometria de fluxo11. No entanto, células somáticas, uma vez isoladas por esses métodos, ainda requerem condições otimizadas para fixação, crescimento eproliferação 8. Os requisitos específicos dessas células tornam a cultura in vitro mais complexa, pois períodos prolongados de incubação são necessários para o estabelecimento das culturas celularesprimárias 9. Além disso, a alta concentração de espermatozoides presentes nas amostras interfere tanto na iniciação quanto na manutenção dessasculturas 5.

Em contraste com as abordagens descritas anteriormente, essa técnica de microaspiração oferece várias vantagens claras. Ele permite a seleção de SCs com base no tamanho e morfologia12 e possibilita a recuperação de núcleos tanto de células viáveis quanto não viáveis, uma estratégia demonstrada com sucesso com tecido congelado semcrioprotetores 13 e células reprodutivas liofilizadas 14,15,16. Importante, os SCs podem ser usados imediatamente após o descongelamento do sêmen, reduzindo assim o risco de erros de ploidia tipicamente associados à cultura in vitro prolongada de células somáticas primárias usadas para clonagem animal17,18. Especificamente, a técnica foca no sêmen equino criopreservado, permitindo a coleta de um número suficiente de SCs para ser usado imediatamente para o SCNT12.

A fabricação de micropipetas e o desenvolvimento de técnicas de microaspiração avançaram significativamente nas últimas décadas. O uso dessas ferramentas possibilita a manipulação precisa de gametas, embriões e suas citoestruturas, criando novas possibilidades no campo da biotecnologia reprodutiva (https://www.jove.com). Técnicas de micromanipulação permitem a avaliação das propriedades mecânicas celulares e fornecem insights valiosos sobre sua condição fisiológica, embora esse campo ainda seja relativamente inexplorado.

Até o momento, nenhuma pesquisa detalhou uma técnica eficaz para isolar SCs do sêmen usando qualquer variante de procedimentos de micromanipulação. Dadas as limitações dos métodos convencionais de isolamento, este estudo propõe um protocolo prático baseado em microaspiração para isolar os SCs a partir do sêmen equino criopreservado, possibilitando seu uso imediato em procedimentos de clonagem somática após a coleta.

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Protocolo

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Amostras de sêmen criopreservadas, preservadas por mais de 19 anos em nitrogênio líquido, foram obtidas de distribuidores comerciais autorizados pelas autoridades veterinárias competentes no México, em conformidade com o Padrão Oficial Mexicano NOM-027-ZOO-1995, que regula o processo zoossanitário do sêmen de animais domésticos. Todas as amostras de sêmen, usadas ou inadequadas para análise, foram desativadas e descartadas seguindo protocolos institucionais de biossegurança e regulamentos aplicáveis, incluindo a NOM-087-ECOL-SSA1-2002 para o manejo de resíduos biológicos-infecciosos no México. O ácido fluorídrico residual (HF) foi neutralizado com segurança sob uma exaustão, transferindo-o lentamente para um recipiente plástico e adicionando gradualmente pequenas porções de CaCO3 ou Ca(OH)2 até que a efervescência cessasse, formando oCaF 2 insolúvel. O pH da suspensão neutralizada foi confirmado entre 6 e 8 antes de ser gerenciada como lixo químico inorgânico, conforme as regulamentações locais. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricação de agulhas de micropipeta para isolamento de células somáticas

  1. Selecione capilares de vidro borosilicato (1,0 mm de divisão extraconjugal × 0,78 mm de divisão de × 100 mm).
  2. Use um puxador de micropipeta para produzir capilares de ponta fina. Ajuste o ponto de corte para variar o diâmetro da ponta.
  3. Insira o capilar no puxador e trave-o firmemente.
  4. Remova a micropipeta cuidadosamente após puxar e coloque-a horizontalmente sobre a microforja.
  5. Alinhe o aquecedor e a micropipeta dentro do campo de visão do microscópio.
  6. Localize o ponto de corte usando a retícula ocular (Figura 1A,B).
  7. Coloque a ponta da micropipeta em contato com a esfera de vidro (no filamento do aquecedor).
  8. Aumente gradualmente o calor até que a ponta derreta na conta.
    1. Desligue o aquecedor.
    2. Deixe a ponta aderir à conta e separe-se.
      NOTA: Não é necessário dobrar a micropipeta; Pode ser usado em sua forma reta. No entanto, se preferido pelo operador, um ângulo pode ser formado (Figura 1C).
  9. Não alise a ponta, pois essa etapa não é necessária para o procedimento.
  10. Limpe as pontas da pipeta mergulhando cada ponta por ~10 s sequencialmente em:
    1. 20% de ácido fluorídrico (HF).
      ATENÇÃO: O ácido fluorídrico é altamente tóxico e corrosivo. Use o equipamento de proteção individual indicado pelo fornecedor. Enfatize o uso de proteção para olhos/rosto, luvas e jaleco, e sempre trabalhe com um exaustor de fumaça.
    2. Água estéril duplamente destilada.
    3. Etanol absoluto.
      NOTA: Para facilitar a lavagem da ponta da pipeta, prepare as soluções mencionadas acima em tubos Corning estéreis de 15 mL.
  11. Secar micropipetas em um forno a 50 °C.
  12. Armazene micropipetas em um recipiente estéril.

2. Configuração por microaspiração

  1. Verifique se o sistema de microaspiração está em condições adequadas de funcionamento, com o joystick de microaspiração centralizado no painel de controle.
  2. Para sistemas que usam óleo, certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro do sistema, pois elas podem afetar a precisão do movimento.
  3. Insira a micropipeta de aspiração de célula somática no manipulador de seguração, no lado dominante da mão do operador.
    NOTA: Substitua a micropipeta por uma nova se a ponta entupiu durante a coleta das células somáticas.

3. Descongelação e diluição do sêmen equino criopreservado

  1. Remova canudos do nitrogênio líquido, exponha ao ar por 10 s e descongele a 37 °C por 30 s.
  2. Primeira diluição do sêmen: Retire uma amostra do sêmen descongelado (250 μL) e dilua com 1,0 mL de meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 0,1 mg/mL de albumina sérica bovina, 12,5 μM β-mercaptoetanol e 1% antibiótico-antimicótico.
    1. Incube a mistura a 37 °C por 30 minutos.
  3. Segunda diluição do sêmen: Pegue 25 μL da primeira diluição, dilua em 975 μL de 1x DPBS suplementado com 0,1 mg/mL de poli(álcool vinílico) (PVA) ou polivinilpirrolidona (PVP), deposite em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL e misture suavemente.
    1. Mantenha essa mistura a 37 °C durante todo o processo de coleta da célula.

4. Preparação de pratos para a coleta dos SCs

  1. Colete os SCs usando duas tampas de potes de cultura de 35 mm de diâmetro.
  2. Prepare a primeira tampa da seguinte forma (tampa #1, Figura 2A).
    1. Pegue 100 μL da segunda diluição de sêmen e deposite-a no centro da tampa (veja Figura 2A).
    2. Faça uma segunda microgota (10 μL) de 1x DPBS suplementada com 0,1 mg/mL de PVA ou PVP sobre a primeira gota (veja a Figura 2A).
    3. Cubra completamente ambas as microgotas com óleo de parafina para evitar a evaporação e manter a estabilidade térmica durante a aspiração do SC.
  3. Prepare a segunda tampa para remover detritos celulares e os espermatozoides acompanhantes (tampa #2, Figura 2B).
    1. Coloque três gotas de 30-50 μL de 1x DPBS suplementadas com 0,1 mg/mL de PVA ou PVP no centro da tampa; Não os cubra com óleo mineral.
      NOTA: Prepare este prato de cultura somente após todas as células somáticas terem sido selecionadas para evitar alterações nas propriedades fisicoquímicas da solução de DPBS devido à exposição ao ar.
  4. Realize todas as etapas de microaspiração sob um microscópio invertido em temperatura ambiente. Evite mudanças repentinas de temperatura.

5. Procedimento de microaspiração para isolar SCs de sêmen equino criopreservado

  1. Coloque a primeira tampa (tampa #1, Figura 2A) no palco do microscópio, pronta para coletar os SCs.
  2. Selecione uma micropipeta com o diâmetro adequado para coletar os SCs e conecte-a ao sistema mecânico de aspiração.
  3. Insira cuidadosamente a micropipeta na microgota e alinhe-a com a parte inferior da tampa da panela. Uma vez que a pipeta tenha aspirado o meio de cultura, inicia-se a captura individual dos SCs.
  4. No fundo do prato, várias morfologias celulares devem ser visíveis (Figura 3).
  5. Posicione a ponta da micropipeta adjacente a cada SC e aspire-os sob pressão negativa. Aspire células ao redor e alongadas, independentemente do tamanho. O volume de aspiração varia entre as capturas dos SCs.
  6. Após capturar 10 células, deposite-as na microgota localizada no topo (10μL) (Figura 2A). Repita essa etapa até obter o número necessário de SCs para o experimento de clonagem.
  7. Segure todas as células somáticas capturadas dentro desse microdrop durante todo o processo de coleta.
  8. Uma vez obtido o número necessário de SCs para clonagem, realize um procedimento simples de lavagem usando microgotas para remover os espermatozoides, detritos celulares e contaminantes microbianos.
  9. Pegue a segunda tampa de prato e realize uma lavagem sequencial em três passos dos SCs (tampa #2, Figura 2B):
    1. Capture as células somáticas com uma micropipeta e deposite-as cuidadosamente na superfície da primeira gota. Deixe-os se acalmar por 3-5 minutos (Figura 2B; Drop #1).
    2. Repita o passo 5.9.1 e deposite-os na segunda gota (Figura 2B; Drop #2).
    3. Repita o passo 5.9.1 e deposite as células somáticas na terceira gota (Figura 2B; Drop #3).
  10. Como etapa final, deposite as células somáticas isoladas em uma microgota final preparada para uso subsequente em procedimentos de transferência nuclear de células somáticas (Figura 4D).
    NOTA: Aspire os SCs no menor volume médio possível durante cada recaptura para minimizar espermatozoides, detritos e contaminantes microbianos.

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Resultados

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A Tabela 1 mostra que a técnica de microaspiração recupera eficientemente células somáticas do sêmen criopreservado de cavalos, com taxas de captura variando de 317,7 ± 9,60 a 424,7 ± 33,65 células/hora em três garanhões. O garanhão #03 teve o maior rendimento, demonstrando a eficácia do método mesmo com amostras armazenadas de longo prazo. Os dados indicam que a técnica isola de forma consistente e eficaz células somáticas do sêmen, e as taxas médias de captura e desvios...

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Discussão

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A micromanipulação de células e gametas possibilitou simplificar técnicas complexas de reprodução assistida. Exemplos disso incluem clonagem somática por Clonagem Feita àMão 21, eclosãoassistida 22, injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)23 e microinjeção pronuclear em zigotos24, entre outros.

O desenvolvimento de métodos eficazes para isolar células s...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Os autores agradecem ao Laboratório de Gestão da Reprodução, Departamento de Produção Agrícola e Animal, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X), pelo apoio técnico e logístico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2 beta MercaptoetanolSIGMAM7522Cultura de células somáticas
1x DPBSGIBCOREF-21600010Manipulação de células somáticas
Etanol absolutoHYCELEL CRISOL 50181-1L73Para fabricação de pipetas
Antibiótico-antimicótico 100xINVITRO SA. Mé xicoCultura de células somáticas
Capilares borosilicatos (1,0 mm de sobredose e vezes 0,78 mm de divisão e 100 mm de comprimento)APARATO DE HARVARD, EUAEC1-30-0035Para fabricação de pipetas
BSASIGMAA3311Cultura de células somáticas
DMEM/F12 médioGIBCOREF-12500-062Cultura de células somáticas
Amostra de sêmen crioppreservado equinoAs amostras de sêmen criopreservado foram obtidas de um distribuidor comercial e foram preservadas por mais de 19 anos em nitrogênio líquido. Todas as amostras congeladas de sêmen equino foram obtidas de distribuidores comerciais autorizados pelas autoridades veterinárias relevantes no México, de acordo com o Padrão Oficial Mexicano NOM-027-ZOO-1995, Processo Zoossanitário de Sêmen de Animais Domésticos.
Refúgio ocularFerramenta para fabricação de pipetasEquipamento necessário
Soro Fetal BovinoGIBCOREF-26140-079Cultura de células somáticas
Ácido hidrofluríricoSIGMA-ALDRICH339261Para fabricação de pipetas
Microscópio óptico invertidoEclipse, TE 200NIKONMicromanipulação de células somáticas
Laboratório  Forno secoFerramenta para fabricação de pipetasEquipamento necessário
MicroforjaFerramenta para fabricação de pipetasEquipamento necessário
Conjunto de micromanipuladores para microscópio invertidoMicromanipulação de célulasEquipamento necessário
Puxador de micropipetaP-97, INSTRUMENTO SUTTERFerramenta para fabricação de pipetasUse as seguintes configurações — Calor: 720; Puxar: 30; Velocidade: 50; Tempo: 220; Pressão
Óleo mineralSIGMAM8410Manipulação de células somáticas
Nunclon  Pratos de cultura celular, Diam. & Times; H 35 mm e horários; 10 mmNUNCLONAgora 153066
PVASIGMAP8136Cultura de células somáticas
PVPSIGMAP5288Cultura de células somáticas
Solução azul de tripan 0,4%GIBCOREF- 15250061Corante celular

Referências

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  1. Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions. Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).
  2. Galli, C., Duchi, R., Moor, R. M., Lazzari, G. Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning. 1 (3), 161-170 (1999).
  3. Olsson, P. O., Yeonwoo, J., Park, K., Yoo, Y. M., Hwang, W. S. Live births from urine derived cells. PLoS One. 18 (1), e0278607(2023).
  4. Vignon, X., et al. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. C R Acad Sci III. 321 (9), 735-745 (1998).
  5. Nel-Themaat, L., et al. Isolation, culture and characterisation of somatic cells derived from semen and milk of endangered sheep and eland antelope. Reprod Fertil Dev. 19 (4), 576-584 (2007).
  6. Kjelland, M. E., Liu, J., Hyatt, D., Kraemer, D. Collection, isolation, and culture of somatic cells from avian semen. Avian Biol Res. 6 (4), 255-260 (2013).
  7. Nel-Themaat, L., et al. Cloned embryos from semen. Part 1: in vitro proliferation of epithelial cells on embryonic fibroblasts after isolation from semen by gradient centrifugation. Cloning Stem Cells. 10 (1), 143-160 (2008).
  8. Liu, J., et al. Evaluation of culture systems for attachment and proliferation of epithelial cells cultured from ovine semen. Anim Reprod Sci. 115 (1-4), 49-57 (2009).
  9. Liu, J., et al. Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen. Theriogenology. 74 (9), 1629-1635 (2010).
  10. Saini, M., et al. Isolation and culture of epithelial cells from stored buffalo semen and their use for the production of cloned embryos. Reprod Fertil Dev. 31 (10), 1581-1588 (2019).
  11. Brom-de-Luna, J. G., Canesin, H. S., Wright, G., Hinrichs, K. Culture of somatic cells isolated from frozen-thawed equine semen using fluorescence-assisted cell sorting. Anim Reprod Sci. 190, 10-17 (2018).
  12. Ramos, B., Rodríguez, A. A., Rosales, A. M., Montiel, A. J., Hernández, J. E. Identification of somatic cell populations in cryopreserved equine semen as a source of donor nuclei for somatic cloning: preliminary results. Reprod Fertil Dev. 37 (1), (2025).
  13. Moulavi, F., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer in Asiatic cheetah using nuclei derived from post-mortem frozen tissue in absence of cryo-protectant and in vitro matured domestic cat oocytes. Theriogenology. 90, 197-203 (2017).
  14. Wakayama, S., Ito, D., Ooga, M., Wakayama, T. Production of mouse offspring from zygotes fertilized with freeze-dried spermatids. Sci Rep. 12 (1), 18430(2022).
  15. Wakayama, S., Ito, D., Hayashi, E., Ishiuchi, T., Wakayama, T. Healthy cloned offspring derived from freeze-dried somatic cells. Nat Commun. 13 (1), 3666(2022).
  16. Loi, P., Fulka, J., Hildebrand, T., Ptak, G. Genome of non-living cells: Trash or recycle. Reproduction. 142 (4), 497-503 (2011).
  17. Wakayama, S., Wakayama, T., Wells, D. N. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-10 (2023).
  18. Lanza, R., et al. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science. 288, 665-669 (2000).
  19. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophys J. 116 (4), 587-594 (2019).
  20. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J Biomech. 33 (1), 15-22 (2000).
  21. Vajta, G., et al. Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulators and carbon dioxide incubators using the handmade cloning (HMC) and the submarine incubation system (SIS). Theriogenology. 62 (8), 1465-1472 (2004).
  22. Alteri, A., et al. Revisiting embryo assisted hatching approaches: A systematic review of the current protocols. J Assist Reprod Genet. 35 (3), 367-391 (2018).
  23. Briski, O., Salamone, D. F. Past, present and future of ICSI in livestock species. Anim Reprod Sci. 246, 106925(2022).
  24. Wall, R. J. Pronuclear microinjection. Cloning Stem Cells. 3 (4), 209-220 (2001).
  25. Selokar, N. L., et al. Hope for restoration of dead valuable bulls through cloning using donor somatic cells isolated from cryopreserved semen. PLoS One. 9 (3), e90755(2014).
  26. Selokar, N. L., et al. Buffalo (Bubalus bubalis) SCNT embryos produced from somatic cells isolated from frozen-thawed semen: Effect of trichostatin A on the in vitro and in vivo developmental potential, quality and epigenetic status. Zygote. 24 (4), 549-553 (2016).
  27. Guevorkian, K., Maître, J. L. Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods Cell Biol. 139, 187-201 (2017).
  28. Duah, E. K., et al. Production of hand-made cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos from nonviable somatic cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 52 (10), 983-988 (2016).
  29. Loi, P., et al. Nuclei of nonviable ovine somatic cells develop into lambs after nuclear transplantation. Biol Reprod. 67 (1), 126-132 (2002).
  30. Fahrudin, M., Otoi, T., Suzuki, T. Developmental competence of bovine embryos reconstructed by the transfer of somatic cells derived from frozen tissues. J Vet Med Sci. 63 (10), 1151-1154 (2001).
  31. Podico, G., et al. Single-layer colloid centrifugation as a method to process urine-contaminated stallion semen after freezing-thawing. J Equine Vet Sci. 87, 102910(2020).
  32. Zhang, Y. T., et al. Evaluation of porcine urine-derived cells as nuclei donor for somatic cell nuclear transfer. J Vet Sci. 23 (2), e40(2022).
  33. Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 23808(2016).
  34. Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: a guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).
  35. Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
  36. Graber, M., Lane, B., Lamia, R., Pastoriza-Munoz, E. Bubble cells: Renal tubular cells in the urinary sediment with characteristics of viability. J Am Soc Nephrol. 1 (7), 999-1004 (1991).
  37. Rahmanian, N., Bozorgmehr, M., Torabi, M., Akbari, A., Zarnani, A. H. Cell separation: Potentials and pitfalls. Prep Biochem Biotechnol. 47 (1), 38-51 (2017).
  38. Håård, M. Use of frozen stallion semen in Europe. Acta Vet Scand Suppl. 88, 123-127 (1992).
  39. Klug, E., Treu, H., Hillmann, H., Heinze, H. Results of insemination of mares with fresh and frozen stallion semen. J Reprod Fertil Suppl. 23, 107-110 (1975).
  40. Pukazhenthi, B., Comizzoli, P., Travis, A. J., Wildt, D. E. Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species. Reprod Fertil Dev. 18 (1-2), 77-90 (2006).
  41. Swanson, W. F., Magarey, G. M., Herrick, J. R. Sperm cryopreservation in endangered felids: developing linkage of in situ-ex situ populations. Soc Reprod Fertil Suppl. 65, 417-432 (2007).
  42. Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: Advancements and problems. Cell Reprogram. 15 (5), 374-384 (2013).

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