Coloração com peroxissomos em células de mamíferos usando sondas específicas de peroxissomos

Resumo

As sondas PeroxiSPY são usadas para detectar peroxissomos em células de mamíferos. Aqui demonstramos como usar as sondas para colorir peroxissomos em células vivas e fixas.

Resumo

Peroxssomos são organelas onipresentes com papéis essenciais na saúde humana, e sua disfunção leva a uma variedade de distúrbios genéticos. A visualização dos peroxissomos é fundamental para identificar disfunção dos peroxissomos; No entanto, o progresso tem sido limitado pela falta de sondas específicas para peroxissomos. Ao desenvolver o PeroxiSPY, sondas específicas para peroxissomos que imitam metabólitos naturais de peroxismosmos, possibilitamos a detecção, rastreamento e quantificação em tempo real da dinâmica dos peroxissomos em células vivas de mamíferos. Além disso, a aplicação dessa técnica em células de pacientes com distúrbios peroxissomos revela fenótipos patológicos. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a detecção de peroxissomos em células vivas de mamíferos, bem como para a detecção de peroxissomos após a coloração em células fixas. Demonstramos como colorir peroxissomos em células vivas usando sondas específicas para peroxissomos, focando na preparação das células, no momento do procedimento, reprodutibilidade e na resolução de problemas. Essas sondas permitem a detecção rápida, específica e não tóxica de peroxissomos em células vivas, oferecendo um método único e quantitativo para avaliar a função dos peroxissomos e sua disfunção em distúrbios relacionados a peroxissomos.

Introdução

O peroxissomo é o organelo eucariótico mais abundante, com algumas células ultrapassando mil^{peroxissomos 1}. Suas funções são críticas para o desenvolvimento do organismo e adaptação^{metabólica 1,2}, evidenciadas por uma série de distúrbios peroxissomos humanos, tipicamente condições neurodegenerativas incuráveis e neurometabólicas em crianças^{pequenas 3,4}. Até onde sabemos, anteriormente havia falta de métodos seletivos disponíveis para marcar peroxissomos em células e tecidos vivos. Essas ferramentas são inestimáveis para aplicações de pesquisa e diagnóstico, permitindo a medição direta e quantitativa de vários aspectos da formação e função dos^{peroxissomos 6}. Essas sondas são suficientemente versáteis para, por um lado, fornecer uma leitura quantitativa da função dos peroxissomos nas células e, por outro lado, serem empregadas em ensaios de eficácia translacional ou como diagnósticos para distúrbios de^{peroxissomos 6}. A coloração por peroxiSPY é uma técnica rápida, específica e não citotóxica para detecção não invasiva de peroxissomos de células vivas. Aqui, descrevemos como colorir peroxissomos em linhagens celulares de mamíferos usando sondas peroxissomas (as sondas também demonstraram coloração peroxissomal específica em embriões de peixe-zebra, mas não são adequadas para coloração de peroxissomos em células de Arabidopsis thaliana ^{da planta 6}). A coloração pode ser feita em menos de 10 minutos. A sonda pode então ser detectada por horas ou fixada usando um protocolo de fixação de paraformaldeído para imunocoloração adicional.

Protocolo

1. Coloração de células vivas

1. Preparação de cultura celular para imagem de células vivas (duração: 24 h)
   NOTA: O estudo seguiu os protocolos padrão de cultivo celular para todos os experimentos. As linhagens celulares foram mantidas em DMEM ou DMEM/F12 para SH-SY5Y, suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina, a 37 °C e 5% de_CO2. Alguns sistemas de imagem são sensíveis à composição do meio. Se o microscópio detectar o sinal do vermelho de fenol no meio, use alternativas sem vermelho de fenol. Além disso, se o microscópio não estiver equipado com uma câmara de_CO2 , substitua o meio por um meio contendo HEPES (pH 7,4).
   1. Um dia antes do experimento, divida as células em uma placa de imagem com fundo de vidro para alcançar uma confluência de 30-70% no dia seguinte.
      NOTA: Neste protocolo, foram usadas placas de 4 poços de 35 mm.
      1. (Crítico) Não use células famintas ou estressadas para se dividir durante o experimento. Certifique-se de que as linhas celulares tenham mudanças de novo substrato regularmente (pelo menos a cada 2-3 dias) e sejam divididas antes de atingirem 90% de confluência. O objetivo é ter uma linha celular saudável para garantir uma coloração uniforme.
         NOTA: Algumas células, por exemplo, células-tronco, exigem revestimento de vidro com uma camada apropriada, por exemplo, Matrigel, que não interfere na coloração.
2. Preparação do sistema de imagem (duração: 1h)
   NOTA: A imagem de organelos e dinâmica de organelos requer alta resolução espacial. Para esse protocolo, foi utilizado um microscópio confocal equipado com um módulo fotomultiplicador GaAsP, uma câmara de_CO2 e uma unidade de controle de temperatura. A imagem foi realizada usando um modo de varredura galvanômica bidirecional com um objetivo CFI Plan Apo Lambda 60x óleo NA 1.42, e um laser de 561 nm (50 mW) foi usado para a sonda 555. Use um laser de 640 nm ou equivalente para a sonda de 650. Peroxissomos foram visualizados em linhagens celulares humanas. O tempo de incubação com as sondas pode variar para diferentes linhagens celulares. Recomenda-se otimizar o tempo visualizando as células em diferentes pontos de tempo após a coloração (Figura 2A).
   1. Inicie o sistema confocal. Certifique-se de que o_CO2 e a temperatura (37 °C) estejam estabilizados por 20 minutos antes de iniciar a coloração e apresentar as células ao microscópio.
      NOTA: (Crítico) É essencial verificar se as células permanecem saudáveis durante todo o experimento por meio de inspeção visual e que o pH e a temperatura do meio são mantidos. Isso pode ser alcançado utilizando unidades de controle para parâmetros e inspecionando visualmente a coloração do meio, caso seja usado vermelho fenol. Para isso, podem ser usados controladores de temperatura e_CO2 .
   2. Configure o software do microscópio confocal. Inicie o software e ligue o laser de 561 nm para a coloração da sonda de 555. Ajuste os parâmetros de aquisição e potência do laser. Esse protocolo usa 1% de potência de laser, HV (ganho) de 100 e resolução de 10²4 a 10²4 pixels com zoom 3 para capturar imagens das células.
3. Coloração com peroxsomo (Duração: 1-5 min)
   1. Pipete uma aliquota da sonda para uma concentração final de trabalho de 1 μM, por exemplo, para 0,5 mL de meio, pipete 0,5 μL da sonda.
   2. Selecione o poço a tingir e etiquete-o do lado de fora com uma caneta de marcação.
   3. Do poço escolhido, pipete-se toda a (0,5 mL) do meio e dispense-a em um tubo microcentrífuga contendo a alíquota da sonda da etapa 1.3.1.
      NOTA: É fundamental remover todo o meio do poço nesta etapa para garantir uma coloração uniforme.
   4. Pipete para cima e para baixo 3 vezes para misturar o meio e a sonda. Aspire toda a mistura na pipeta.
      NOTA: Mistura por vórtice pode ser usada em vez de pipetar.
   5. Dispense a mistura de volta ao poço escolhido, gota por gota, garantindo que a pipeta esteja em contato com a parede do poço. Ao adicionar a mistura de volta ao poço, inicie um temporizador de 10 minutos.
   6. Feche a tampa, adicione uma gota de óleo de imersão no objetivo (esse protocolo usa 60× de óleo na objetiva) e posicione a placa no microscópio para a imagem.
      NOTA: Recomenda-se otimizar a concentração da sonda para cada linhagem celular para garantir uma coloração uniforme. Recomenda-se testar a 0,25, 0,5, 1 e 2 μM por 5-20 minutos; concentrações mais baixas normalmente coram com fundo mais baixo (Figura 2A). Dependendo da linhagem celular e da sensibilidade do detector do microscópio, as células coloridas podem ser imagens desde apenas 5 minutos após a adição da sonda até 24 horas após a adição. Em alguns casos, por exemplo, na imagem de células-tronco, a visualização das células pode ser realizada por mais de 180 minutos após a adição da sonda sem alteração no sinal. A qualquer momento, o suporte pode ser alterado para lavar a sonda. Isso levará a uma perda gradual da coloração em cerca de 30 minutos para HEK293T células.
4. Imagem confocal de peroxissomos em células vivas (duração: 10 min-3 h)
   1. Uma vez que a placa esteja posicionada no microscópio, ajuste o foco nas células do poço que está corada e comece a fazer a imagem.
   2. Uma vez que as células estejam em foco, ajuste o ganho (HV ou sensibilidade do detector) e as configurações de potência do laser usando as diretrizes padrão de instalação de microscópios confocais.
   3. Encontre e posicione (Zoom-in) no grupo de células. Após focar nas células, ajuste os parâmetros de aquisição para a qualidade de imagem desejada.
      1. Defina os parâmetros de imagem para aquisição de imagem: 0,5-1% de potência do laser, 100 HV (ganho) no software NIS-Elements. Verifique se a imagem não está supersaturada (se estiver, altere a intensidade e o ganho).
      2. Selecione o tamanho da varredura. Adquirir imagens 1024 1024 px, velocidade de varredura (1/2-1/4), média de linha (2), zoom (3) que seja apropriado para a imagem em análise.
         NOTA: Os peroxsomos se movem durante a aquisição da imagem, o que pode resultar em artefatos. Os parâmetros recomendados são otimizados para minimizar as trilhas de movimento, garantindo qualidade suficiente das imagens para quantificação. Ao criar um time-lapse, certifique-se de que intervalo, duração e loops estejam especificados antes de iniciar o vídeo. As sondas são fotográficas.
   4. Adquira e salve todas as imagens com etiquetas acessíveis (aqui, o formato .nd2 NIS-Elements Nikon Software é utilizado).

2. Coloração de células fixas

1. Preparação de cultura celular para imagem de células vivas (duração: 24 h)
   NOTA: Protocolos padrão de cultivo celular foram seguidos para todos os experimentos. As células Huh7 foram mantidas em DMEM/F12 suplementadas com 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, a 37 °C e 5% de CO₂.
   1. Um dia antes do experimento, divida as células em uma placa com coberturas para alcançar uma confluência de 30-70% no dia seguinte.
      NOTA: Semear 50.000 células/poço em placas de 12 poços com escorregas de cobertura de 18 mm, ou 15.000 células/poço em placas de 24 poços com escorregas de cobertura de 13 mm.
2. Coloração com peroxsomo (Duração: 1-5 min)
   1. Dilua a sonda com novo meio até uma concentração final de trabalho de 4 μM em um tubo vazio de microcentrífuga sensível à luz, por exemplo, para 0,5 mL de meio, pipete 2 μL da sonda (solução padrão: 1 mM).
   2. Selecione o poço para tingir e etiquete-o do lado de fora com uma caneta de marcação.
   3. Do poço escolhido, aspire todo (0,5 mL) do meio e substitua pelo meio sonda do passo 2.2.1. Dispense o meio sonda no poço escolhido, gota a gota, garantindo que a pipeta esteja em contato com a parede do poço.
   4. Ao adicionar a mistura de volta ao poço, incube as células a 37 °C por 10-15 minutos.
      NOTA: A partir deste momento, as células são sensíveis à luz e devem ser cobertas com papel alumínio.
3. Fixação pós-coloração e peroxissomos de imagem em células fixas
   1. Após a coloração, remova cuidadosamente o meio e lave as células duas vezes com soro salino tamponado com fosfato (PBS).
   2. Aplique solução de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS em temperatura ambiente por 20 minutos.
   3. Remova cuidadosamente o PFA para dentro de um recipiente de lixo especificamente designado. Lave as células uma vez com PBS.
      ATENÇÃO: A PFA é tóxica e deve ser descartada de acordo com as regulamentações institucionais.
   4. Para prosseguir com a imunofluorescência, siga os passos abaixo
      1. Adicione 0,5% de Triton-X (diluído em PBS) para permeabilizar as células. Deixe por 2,5 minutos.
      2. Remova cuidadosamente o Triton-X. Lave as células duas vezes, por 10 minutos com PBS.
      3. Bloqueie com solução de albumina sérica bovina (BSA) a 5% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
      4. Prossiga com o procedimento padrão de imunofluorescência.

Resultados

As sondas PeroxiSPY são projetadas para imitar substratos naturais de peroxissomos - ácidos graxos ramificados e de cadeia muito^{longa 5}. Portanto, a coloração resultará em uma importação dependente da subfamília D da Binding Subfamily D (ABCD) do trifosfato de adenosina (ATP) a partir do citoplasma para os peroxissomos ^5,6,7. Dependendo do estado metabólico celular, o transporte ABCD dependente de ATP pode importar as sondas de forma eficiente e rápida, o que resultará em uma alta relação peroxissoma para citoplasma de intensidade de fluorescência (Figura 1A). Passos críticos para garantir uma alta proporção incluem evitar a inanição das células, substituindo regularmente o meio celular e evitando o crescimento das células em alta confluência.

Para verificar a especificidade da coloração com peroxissomos, recomenda-se incluir vários controles (Figura 1B,C). Análise de colocalização com um marcador peroxissomal de referência, por exemplo, marcador de importação de proteína - GFP-SKL (Figura 1B,C). Além disso, se linhas celulares deficientes em peroxissomos estiverem disponíveis, por exemplo, PEX19 KO, a coloração estará ausente nessas células (Figura 1B^)5,8.

Sondas de peroxossomo podem ser usadas para medir a densidade dos peroxissomos (Figura 1C)^5,9, e estão sendo desenvolvidas para avaliar importação de substrato, dinâmica de peroxissomos e interações. Para a imagem quantitativa, é importante padronizar o procedimento de coloração, o momento da aquisição da imagem (por exemplo, 10-20 minutos após a coloração), a preparação da linhagem celular e os parâmetros de aquisição. Algumas linhagens celulares requerem otimização da concentração da sonda, bem como do tempo de tempo para melhorar a intensidade do sinal dos peroxissomos em relação ao fundo citosólico, por exemplo, 250 nM e 20 min funcionam melhor para células COS-7 (Figura 2A). As células metabolizam as sondas, o que leva a uma redução gradual da coloração de peroxissomos ao longo do tempo; no entanto, a proporção de peroxissomo para citoplasma pode melhorar ao longo de 24 horas (Figura 2B). Além disso, desenvolvemos um procedimento de fixação, que permite a co-coloração com anticorpos e a visualização dos peroxissomos em um momento posterior (Figura 2C,D).

Figura 1: Imagem de células vivas de peroxismos. (A) Esquema da coloração. (B) Microscopia confocal de células WT e PEX19 KO HEK293T que superexpressam GFP-SKL e são coloridas com a sonda peroxissoma vermelha (1 μM por 10 minutos). Barras de escala - 1 μm e 10 μm. O perfil representativo de intensidade é mostrado. (C) Microscopia confocal de fibroblastos humanos superexpressando GFP-SKL e colorida com PeroxiSPY (1 μM por 10 min). Barras de escala - 1 μm e 10 μm. O perfil representativo de intensidade é mostrado. (D) Microscopia confocal de células SW13 (Córtex Adrenal), SH-SY5Y (Neuroblastos), CCL-136 (Miócitos), HaCat (Ceratinócitos), U2OS (Osteoblastos) e HEK293T (Rim Embrionário Humano) colorida com a sonda peroxissoma vermelha (1 μM por 10 min). Barras de escala - 2 μm e 10 μm. A quantificação foi realizada usando Fiji conforme descrito^{anteriormente 9} e mostra o número de peroxissomos por micrômetro quadrado, média ± SEM, N = 100 células agrupadas a partir de 3 repetições biológicas, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Teste de Kruskal-Wallis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Otimização por imagem por peroxissomo e coloração de células fixas. (A) Microscopia confocal de células COS-7 (rim do macaco verde africano) coradas com a sonda peroxissoma vermelha conforme o protocolo (1 μM por 10 min; antes da otimização) e sob condições otimizadas (250 nM por 20 min; após a otimização). Barra de escala - 10 μm. A intensidade média dos pixels dos peroxssomos e do citosol foi quantificada usando Fiji e expressa como uma razão. N = 7 células (antes da otimização) e 21 células (após a otimização). Média ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, teste de Shapiro-Wilks. (B) Microscopia confocal de células de HEK293T coradas com a sonda peroxissomo vermelha (1 μM) por 15 minutos e 24 horas. A quantificação mostra intensidade de fluorescência dos peroxissomos e citoplasma, bem como a razão entre peroxissomo e citoplasma, média ± SEM, N = 680 peroxissomos agrupados a partir de 3 repetições biológicas, **** - p < 0,0001, teste de Shapiro-Wilks. (C) Microscopia confocal de células Huh7 coradas com sondas peroxissomas usando o protocolo de fixação. Peroxissomos foram co-coloridos com anticorpo primário anti-PEX14 (1:100 em solução bloqueante, incubação de 1 h em RT) e anticorpo secundário (1:1000 em solução bloqueante, anti-Alexa Fluor 488 anti-Coelho de Cabra, incubação de 1 hora na RT). Imagens representativas de confocais são apresentadas. Barras de escala - 10 μm. (D) A quantificação mostra as mudanças na intensidade da fluorescência dos peroxissomos durante a fixação e permeabilização, realizadas em células HEK293T segundo o protocolo, média ± SEM, N = 100 células agrupadas a partir de três repetições biológicas, **** - p < 0,0001, teste de Shapiro-Wilks. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Essa detecção simples de peroxissomos pode ser feita em menos de 10 minutos em células animais. A coloração PeroxiSPY permite visualização, quantificação e rastreamento de peroxissomos em células vivas e está disponível como um vermelho (Tabela de Materiais) e uma sonda^{vermelha 5} (Tabela de Materiais). A coloração fornece uma visualização peroxissoma semelhante à de uma coloração clássica baseada em sinal de direcionamento peroxissomo (PTS1)^{l 10} (Figura 1B), sem necessidade de superexpressão. Os fluoróforos são fotostáveis e podem ser usados para imagens de superresolução e aquisição a longo prazo da dinâmica dos peroxissomos em diferentes condições^{experimentais 5,9,11}. Além disso, as sondas são sensíveis ao funcionamento dos peroxissomos; portanto, podem ser usados para detectar e quantificar a patologia dos^{peroxissomos 5} para aplicações de pesquisa e diagnóstico. A coloração com peroxsomos depende do metabolismo dos peroxissomos e da capacidade dos peroxissomos de importar e oxidar ácidos graxos. Portanto, é importante otimizar a concentração e o momento das linhas celulares utilizadas. Aqui apresentamos um procedimento padrão que funciona para as linhas celulares que testamos; no entanto, o momento da coloração pode ser estendido para 24 horas sem a perda da razão de intensidade de fluorescência peroxosomo-citoplasma (Figura 2B).

As sondas foram testadas em muitas linhagens celulares de mamíferos (Figuras 1 e Figura 2) e em células e embriões 5 de peixe-zebra^, demonstrando especificidade para peroxissomos e facilidade de uso. Essas sondas não foram testadas em outras linhagens celulares animais, e as condições, assim como as concentrações das sondas, precisarão ser otimizadas para elas. As sondas não coram peroxissomos nas células de Arabidopsis thaliana ^{das plantas 5}.

Alguns problemas e suas respectivas soluções para solução de problemas são discutidos aqui. Se a proporção peroxissomo para citoplasma estiver muito baixa (baixa coloração de peroxissoma), certifique-se de que as células estejam recém-divididas e depois divida-as novamente para a coloração. Use confluência de 30-70% para a coloração. Otimize a concentração da sonda (concentração muito alta levará ao excesso da capacidade de peroxissomo para absorver as sondas) e o tempo de captação (por exemplo, veja a Figura 2A). Use um prato de fundo de vidro de 35 mm (a coloração em placas de 96 poços é mais desafiadora devido à mistura em volume reduzido). Certifique-se de que as sondas sejam adicionadas ao tubo da microcentrífuga e bem misturadas com o meio antes de serem adicionadas às células. Diferentes linhagens celulares e condições variadas afetam a coloração. Por fim, lavar a sonda reduzirá o fundo; no entanto, o sinal será gradualmente perdido, reduzindo o tempo em que a imagem pode ser realizada de forma eficaz.

Se não houver peroxssomos visíveis, certifique-se de que a sonda foi misturada com o meio. Aumente a concentração da sonda (por exemplo, para 2 μM). Introduza um marcador peroxissomal adicional para garantir que os peroxissomos possam ser visualizados. Se houver variação de célula para célula na coloração, é importante remover todo o meio e misturá-lo cuidadosamente com a alíquota antes de adicioná-lo novamente às células. Isso garante uma mancha uniforme. Se ainda houver variação, é possível que a população celular seja heterogênea em sua capacidade de importação de substratos peroxossomos. A sincronização das células por divisão regular auxilia na coloração uniforme. Se nenhum sinal for detectado, verifique se as configurações do laser nos microscópios são compatíveis com os parâmetros de excitação/emissão da sonda. Se o fundo fora da célula estiver muito brilhante, lave as sondas para remover esse fundo; no entanto, o sinal será gradualmente perdido, reduzindo a janela de tempo em que a imagem pode ser realizada de forma eficaz. Além disso, a fixação pode ser usada para reduzir o fundo. Se o sinal pós-fixação for muito fraco, verifique se o sinal se perde após a adição do Triton-X 100. Essa etapa pode ser modificada ou removida dependendo da aplicação posterior. Reduza as etapas de lavagem.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-PEX14	Proteintech	10594-1-AP
Microscópio Confocal	Nikon	A1r	Qualquer microscópio confocal com um objetivo de alta NA, por exemplo, 60x NA1.4 de óleo
DMEM	Pan Biotech	P04-03590	Mídia de cultura celular
Placas de imagem com fundo de vidro	Cellvis	D35C4-20-1.5-N
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488	ABCAM	ab150081
HEK293T	ATCC	CRL-3216
PeroxiSPY555	Espirocromo	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650	Espirocromo	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2