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Artigo de método

Modelagem de Macrófagos Associados a Tumores In Vitro: O Papel dos Fatores Secretados na Dinâmica do Microambiente Tumoral

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DOI:

10.3791/69406

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30 de dezembro de 2025

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito apresenta um protocolo in vitro para gerar células macrófagas associadas a tumores, expondo monócitos humanos a meios condicionados de linhagens celulares tumorais.

Resumo

Macrófagos exibem uma plasticidade notável, permitindo que adquiram estados funcionais distintos em resposta a uma variedade de sinais ambientais. Em tumores sólidos, eles frequentemente constituem a população de células imunes mais abundante dentro do microambiente tumoral, onde são chamados de macrófagos associados ao tumor (TAMs). Os TAMs interagem de perto com células malignas, promovendo ativamente a progressão tumoral, angiogênese e evasão imunológica. As células tumorais podem reprogramar macrófagos por meio do contato direto célula-célula e de uma ampla variedade de fatores secretados, moldando sua polarização em pro-fenótipos tumorais. Para estudar esses mecanismos de polarização TAM in vitro, propomos um método que expõe monócitos humanos a fatores solúveis presentes em meios condicionados por linhagem celular tumoral. Esse protocolo permite a geração de macrófagos semelhantes ao TAM sob condições controladas, facilitando a análise de mudanças fenotípicas e funcionais induzidas por sinais derivados do tumor. Nossa abordagem oferece um modelo reprodutível e fisiologicamente relevante para investigar interações tumor-macrófagos, aprofunda nosso entendimento sobre reprogramação de macrófagos e apoia pesquisas em novas estratégias terapêuticas em imunologia e imunoterapia do câncer.

Introdução

Macrófagos são células imunes multifuncionais e inatas cuja notável plasticidade lhes permite adotar fenótipos diversos em resposta a sinaisambientais 1. Dentro de tumores sólidos, os macrófagos frequentemente se tornam a população de células imunes mais abundante e se diferenciam em macrófagos associados a tumores (TAMs)2. Essas células são ativamente reprogramadas pelo microambiente tumoral para apoiar o crescimento tumoral, promover a angiogênese, facilitar a metástase e suprimir respostas imunes antitumorais eficazes. As células tumorais conduzem essa polarização tanto por meio de interações diretas célula-célula quanto por um repertório complexo de fatores secretados, incluindo citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, que remodelam os programas transcricionais e funcionais dosmacrófagos 3. Essa interação dinâmica sustenta o papel central dos TAMs na biologia do câncer e destaca a plasticidade dos macrófagos tanto como um desafio quanto como uma oportunidade para intervençãoterapêutica 2.

A relevância clínica dos TAMs é cada vez mais reconhecida: sua abundância em tumores frequentemente se correlaciona com prognóstico ruim e resistência àsterapias 4,5. Consequentemente, osTAMs 6 emergiram como alvos terapêuticos atraentes. Estratégias voltadas para bloquear o recrutamento, inibir sua sobrevivência ou reprogramá-los para fenótipos inflamatórios e tumoricidas estão atualmente eminvestigação 6. Compreender os mecanismos pelos quais fatores derivados de tumores polarizam os macrófagos em TAMs é, portanto, essencial para o desenvolvimento de imunoterapias eficazes. Embora o bloqueio de pontos de controle imunológico tenha mostrado grande sucesso em muitos tipos de câncer, sua eficácia permanece limitada em outros7. Combinar terapias direcionadas a células T, como anticorpos anti-Proteína Anti-Morte Celular Programada 1 (PD-1) ou Anti-Ligante de Morte Celular Programada 1 (PDL-1), com estratégias de reprogramação de macrófagos pode potencializar a resposta imune antitumoral como um todo.

Modelos experimentais tradicionais para estudar a biologia TAM incluem modelos in vivo de câncer murino, que oferecem um ambiente complexo e fisiologicamenterelevante 8. Esses modelos forneceram insights fundamentais sobre o recrutamento e o funcionamento do TAM. No entanto, diferenças significativas entre espécies na sinalização imune, biologia tumoral e ontogenia dos macrófagos podem limitar a tradução direta para doençashumanas 9,10. Além disso, a complexidade dos sistemas in vivo dificulta o isolamento e o estudo de vias específicas de sinalização ou eventos moleculares que impulsionam a polarização dos macrófagos.

Em contraste, modelos in vitro oferecem condições mais simples e controladas para dissecar esses mecanismos. A abordagem mais amplamente utilizada envolve polarizar macrófagos derivados de monócitos humanos com estímulos definidos: interferon gamma (IFN) e lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) para gerar macrófagos pró-inflamatórios (M1), ou Interleucina 4 (IL-4) e interleucina 10 (IL-10), ou dexametasona, obtendo vários subtipos de macrófagos anti-inflamatórios (M2) 11,12,13,14 . Esses modelos ajudaram a identificar marcadores moleculares e programas transcricionais associados a estados canônicos de polarização dos macrófagos. No entanto, eles não conseguem replicar o ambiente complexo e multifatorial que os macrófagos encontram nos tumores, onde a polarização resulta da influência simultânea de inúmeros mediadores solúveis, sinais metabólicos e interações célula acélula 15,16. Embora a classificação clássica M1/M2 continue útil para descrever estados funcionais de macrófagos, agora está claro que existem muito mais populações de macrófagos do que se pensava anteriormente. O trabalho do grupo do Dr. Ginhoux e de outros, utilizando abordagens transcriptômicas unicelulares, demonstrou a ampla diversidade de subconjuntos de macrófagos encontrados tanto sob condições fisiológicas quanto nadoença 17,18. Isso destaca que os TAMs, embora frequentemente descritos como semelhantes a perfis do tipo M2, não são estritamente equivalentes a macrófagos diferenciados apenas por citocinas canônicas; ao contrário, compartilham certas características, mas também apresentam diferenças distintas e dependentes do contexto.

Para preencher essa lacuna, apresentamos um protocolo in vitro que modela a polarização semelhante ao TAM, expondo macrófagos derivados de monófagos humanos a meios condicionados coletados de linhagens celulares tumorais. Esse método captura a influência do secretoma tumoral, uma mistura rica de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento secretados pelas células cancerígenas. Assim, oferece um sistema relevante e experimentalmente acessível para investigar a reprogramação fenotípica e transcricional dos macrófagos em resposta a fatores solúveis derivados de tumores. Diferentemente de abordagens anteriores em que monócitos eram expostos diretamente a meios condicionados por tumores, este protocolo foca especificamente na reprogramação dos macrófagos, refletindo melhor o comportamento dos macrófagos residentes no microambientetumoral 19,20. Além disso, incorpora um painel otimizado e direto de marcadores de superfície para avaliar a polarização dos macrófagos por citometria de fluxo, o que é fácil de implementar e pode ser expandido conforme as necessidades dopesquisador 14,21. Por fim, como foi demonstrado que o M-CSF prepara monócitos para um fenótiposemelhante ao M2 10,15,22,23,24, deliberadamente o omitimos para garantir que qualquer polarização observada de macrófagos resulte especificamente da exposição a meios condicionados derivados de linhas celulares tumorais.

Essa abordagem possui várias forças: mantém a reprodutibilidade e simplicidade dos sistemas in vitro, utiliza células humanas primárias para maior relevância translacional e reflete melhor a natureza heterogênea e multifatorial do microambiente tumoral do que os modelos de citocinaúnica 25,26,27,28. Além disso, facilita estudos comparativos das respostas dos macrófagos a meios condicionados de diferentes tipos tumorais ou células cancerígenas geneticamente modificadas, e serve como plataforma para testar agentes farmacológicos que podem alterar a polarização TAM. Além de sua aplicabilidade geral, esse método pode ser adaptado a diferentes modelos tumorais selecionando linhas celulares apropriadas ou ajustando a proporção de meios condicionados. No entanto, os usuários devem estar cientes de que a variabilidade entre doadores saudáveis e linhagens celulares tumorais pode afetar a reprodutibilidade, ressaltando a importância de um desenho experimental cuidadoso e da padronização.

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Protocolo

Amostras de sangue periférico foram coletadas de doadores saudáveis após consentimento informado, de acordo com a Declaração de Helsinque. Esse protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional da Universidade de Buenos Aires. Consulte a Tabela de Materiais para detalhes sobre todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.

NOTA: Mantenha condições estéreis durante todo o protocolo, trabalhando em um gabinete de Biossegurança nível 2 (BSL-2), e assegure a viabilidade celular >90%. Para descarte, todos os resíduos biológicos devem primeiro ser descontaminados por imersão em uma solução de hipoclorito de sódio a 10% por pelo menos 30 minutos e, em seguida, colocados no recipiente adequado para descarte de riscos biológicos.

1. Cultura de linhas celulares tumorais e preparação de meios condicionados

  1. Descongele a linhagem celular de câncer de mama humano (ou outro tumor selecionado) MDA-MB-231 triplo negativo a partir do armazenamento de nitrogênio líquido. Imerga imediatamente criotubos contendo linhas celulares em um banho-maria a 37 °C e gire suavemente o frasco para garantir um descongelamento rápido e uniforme. Remova o frasco rapidamente quando estiver quase descongelado.
  2. Transfira as células descongeladas para um tubo de centrifugação de 15 mL contendo 5 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Centrifuge a suspensão da célula a 400 × g por 5 minutos em temperatura ambiente (RT).
    NOTA: O processo de descongelamento deve ser realizado rapidamente para preservar a viabilidade celular.
  3. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda rapidamente a célula em 1 mL de meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) fresco, completo, contendo alta glicose (4,5 g/L), com 10% de soro fetal bovino (FBS), 4 mM de Glutamina e 1 mM de piruvato de sódio. Conte as células do pellet ressuspenso, realizando a seguinte diluição serial em duas etapas:
    1. Primeiro, prepare uma diluição em suspensão 1:5 célula em meio DMEM estéril e depois (1:2) com a coloração de viabilidade Trippan Blue para obter uma diluição final de 1:10.
    2. Use um microscópio óptico para contar as células viáveis dentro do hemocitometro Neubauer (ou câmara de contagem). Conte as células viáveis (apenas as que excluem o corante azul) e determine o número médio de células viáveis por quadrado grande de canto.
    3. Calcule a concentração final usando a seguinte fórmula: Células/mL = (Média de células por quadrado) x (Fator de Diluição) x 10.000.
      NOTA: Resuspenda as células em um volume desejado de meio DMEM completo para obter uma concentração final de 1x 105células/mL.
  4. Seme 2,5 x 105 a 5,0 x 105 células em um frasco de cultura T25 contendo 5 mL de meio DMEM completo. Mantenha a cultura a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% deCO2 até atingir a densidade celular necessária para a colheita.
  5. No dia seguinte à semeadura, verifique a fixação das células ao microscópio. Se mais de 50% das células estiverem flutuando (indicando morte celular), aspire suavemente o meio antigo e substitua-o por 2,5 mL de meio fresco pré-aquecido.
  6. Monitore o crescimento celular diariamente. Quando a cultura atinge aproximadamente 90% de confluência (estimada de 2,3 x 106 células em um frasco de T25), tipicamente em até 5 dias, as células estão prontas para serem subcultivadas (divididas). Para dividir as células em uma proporção de 1:8, siga estes passos:
    1. Remova o meio gasto usando uma pipeta Pasteur estéril.
    2. Enxágue a monocamada celular uma vez com 3 mL de PBS estéril 1x para remover o soro residual, que inibe a tripsina. Aspire e descarte 1x PBS.
    3. Adicione às células 1 mL de solução de ácido etilenediaminetetraacético (EDTA) 0,25% de Tripsina e 1 mM e incube a 37 °C, 5% de CO2 em uma incubadora umidificada por 3 minutos para destacar as células.
      NOTA: O tempo ideal de incubação com Tripsina/EDTA depende da linha celular específica e pode precisar ser ajustado. Verifique as células ao microscópio após 3 minutos para garantir que estejam totalmente descoladas.
    4. Neutralize a atividade enzimática adicionando 3 mL de meio DMEM completo. Imediatamente depois, pipetee suavemente para cima e para baixo para descolar completamente e suspender as células.
  7. Transfira 3,5 mL da suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL e centrifuge-o por 5 minutos a 400 x g na RT.
  8. Remova cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda a célula em 1 mL de meio congelante (que deve conter 90% de FBS mais 10% de dimetil sulfóxido (DMSO)). Transfira e aliquota a suspensão celular em crioviais, garantindo uma concentração de 5 x 105 células por tubo para uso futuro.
    1. O congelamento precisa ser resfriado gradualmente colocando os cryovials em um recipiente Mr. Frosty (ou similar com congelamento de taxa controlada). Transfira o recipiente para um freezer a -80°C e deixe as células congelarem durante a noite. As células podem ser mantidas a -80°C por alguns dias, mas depois devem ser transferidas para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
      NOTA: Mantenha registros detalhados das passagens celulares e use as passagens iniciais para experimentos. Recomenda-se o uso de células com menos de 20 passagens (passages).
  9. Quando novas culturas atingirem novamente ~90% de confluência, aspire e colete o sobrenadante em um tubo cônico de 15 mL. Se quiser manter a cultura contínua, substitua o volume coletado por um meio DMEM novo e completo.
    1. Centrifuge o sobrenadante coletado a 400 × g por 5 minutos a 4 °C para pelletar e remover detritos celulares. Guarde o sobrenadante (o meio condicionado clarificado) e descarte o pellet.
  10. Aliquota o meio condicionado clarificado em porções de 1 mL, rotule os tubos e armazene-os a -20 °C até o uso.
    NOTA: Para controle de qualidade, sempre mantenha um registro da data de coleta condicionada do suporte e se a alíquota foi previamente descongelada. É fortemente recomendado evitar descongelar a mesma alíquota mais de duas vezes. Além disso, utilize o condicionado dentro de um mês após a data de congelamento para garantir sua atividade ideal.

2. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)

NOTA: PBMCs são isolados de 40 mL de anticoagulação do sangue periférico com 3,8% de citrato de sódio. O isolamento é realizado usando um gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (1077) e centrifugação. Todo esse protocolo deve ser realizado em condições estéreis em um gabinete BSL2.

  1. Aliquota a amostra de sangue periférico anticoagulado em um tubo cônico de 15 mL ou 50 mL antes da próxima etapa da centrifugação.
  2. Centrifuge amostras de sangue em baixa velocidade, 200 × g por 15 minutos em RT para separar os componentes sanguíneos. Esse processo gera plasma rico em plaquetas (PRP) como camada superior e a fração celular (glóbulos vermelhos e brancos) abaixo. Use a velocidade da centrífuga: 4 e a desaceleração: 2, quando o máximo for 5.
  3. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante (a fração superior), que é o PRP, e transfira-o para um novo tubo estéril.
    NOTA: Se necessário para experimentos posteriores, o PRP coletado pode ser centrifugado novamente a 600 × g em RT por 10 minutos (aceleração e desaceleração máximas) para remover as plaquetas, e armazenar o plasma sem plaquetas a -20 °C para outros ensaios.
  4. A fração inferior celular obtida da centrifugação inicial no passo 2 deve ser suavemente diluída até um volume final de 2 a 3 vezes usando PBS estéril de 1x à temperatura ambiente. Homogeneize suavemente por inversão da suspensão resultante e use-a para a centrifugação com gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque.
  5. Dispense 15 mL de Ficoll-Hipaque em temperatura ambiente em um tubo estéril de 50 mL.
  6. Cuidadosamente e lentamente sobrepone 30 mL de sangue diluído sobre o Ficoll-Hipaque, garantindo que as duas fases não se misturem.
  7. Centrifuge o tubo com camadas de sangue de Calcol por 25 minutos a 600 × g em RT. Ajuste a centrífuga sem freio (aceleração: 1; Desaceleração: 0).
  8. Use uma pipeta Pasteur estéril para descartar pelo menos 4 mL da fração superior obtida para evitar derramamentos. Depois, use a mesma pipeta para recuperar o anel branco contendo os PBMCs, formado entre a fração superior e a fração transparente de Ficoll-Hipaque. Evite colecionar Ficoll com o anel PBMC.
  9. Transfira o anel PBMC do tubo para um tubo centrífugo estéril de 15 mL com pelo menos 3 mL de PBS 1x.
  10. Encha o tubo de 15 mL com mais PBS 1x e centrifuge a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) por 10 minutos em RT.
  11. Remova o sobrenadante por inversão, encha novamente com 1x PBS e centrifuge a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) por 10 minutos em RT.
  12. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet PBMC em 2 a 3 mL de PBS estéril 1x mais 2% de FBS inativado por calor (1x PBS-2% FBS), depois aumente o volume para 10 mL. Conte as células, preparando uma suspensão 1:5 de células diluída em frio estéril 1x PBS e depois (1:2) em 0,4% de Trippan Blue para obter uma diluição final de 1:10. Use uma câmara celular em um microscópio óptico, conforme descrito no passo 1.3.2 para contagem.
  13. Reduza a rotação da suspensão PBMC a 300 × g por 5 minutos a 8-10 °C. Resuspenda as células em um volume desejado de 1x PBS-2% FBS estéril e frio para obter uma concentração final de 108 células/mL. Deixe essas células a 4 °C até o próximo passo.
    NOTA: Neste ponto, PBMCs coletados podem ser congelados em um frasco criogênico a 108 células/mL em meio congelante (90% FBS-10% DMSO). Armazene a -80 °C em um recipiente Mr. Frosty durante a noite para permitir que as células congelem lentamente. No dia seguinte, transfira as células para uma caixa de armazenamento e deixe-as a -80 °C por alguns dias ou transfira para um tanque de nitrogênio líquido por um longo período de armazenamento, ou continue o protocolo.

3. Classificação de monócitos CD14+ usando esferas magnéticas

NOTA: Monócitos purificados CD14+ são obtidos do PBMC usando um kit de seleção magnéticapositiva de CD14+ humano 11. A porcentagem de células CD14+ no PBMC é dependente do doador, mas pode ser estimada em 10% (variando de 5-20%). Adapte o número inicial de PBMC e os volumes finais de reação com base no número necessário de monócitos para seu experimento. O volume mínimo de reação sugerido é de 100 μL, mesmo processando menos de 1 × 107 PBMC.

  1. Adicione 10 μL do coquetel positivo para cada 100 μL de PBMCs, pipete para cima e para baixo, e deixe no gelo por 15 minutos.
  2. Faça um vórtice na suspensão dos talões por 30 segundos antes do uso. Depois, adicione 10 μL das esferas por cada 100 μL de suspensão PBMC. Misture bem e incube por 15 minutos no gelo.
  3. Adicione 1x PBS - 2% FBS - 1 mM de EDTA em um volume final de 2,5 mL, misture suavemente a suspensão e insira o tubo no ímã e incube por 5 min.
  4. Inverta o ímã (sem remover o tubo) sobre um tubo receptor descartável por 2-3 segundos, evitando qualquer movimento de tremor. Células positivas permanecerão no tubo.
  5. Retire o tubo do ímã e adicione 1x PBS - 2% FBS - 1 mM de EDTA sobre as paredes do tubo até um volume final de 2,5 mL.
  6. Insira o tubo novamente no ímã e incube por 5 minutos.
  7. Inverta o ímã (sem remover o tubo) sobre um tubo receptor descartável por 2-3 segundos, evitando qualquer movimento de tremor. Retire o tubo do ímã e adicione 3 mL de 1x PBS-2% FBS sobre as paredes do tubo para recuperar todas as células.
  8. Leve 10 μL para contar o número de células CD14+ em uma câmara de Neubauer com um microscópio óptico. Dilua com Trypan Blue 1:2.
    NOTA: Calcule o número de células seguindo esta equação: Número de células CD14+ = número de células vivas por quadrante x fator de diluição x 10.000.
  9. Coloque a suspensão da célula CD14+ em um novo tubo estéril de 15 mL e lave as células, centrifugando a 600 × g ( aceleração e desaceleração máximas) por 10 minutos a 4 °C.
  10. Resuspenda células CD14+ com meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) em um volume conveniente para obter 2,5 x 106 células/mL para a próxima etapa, considerando o número de células obtidas.
    NOTA: Mantenha os monócitos CD14+ no gelo até o próximo passo para evitar a fixação dessas células na parede do tubo plástico.

4. Diferenciação de macrófagos

  1. A placa purificou monócitos CD14+ em 2,5 x 105 células suspensas em 250 μL de meio RPMI completo (10% FBS-1% PS) por poço em uma placa tratada com 48 poços.
    NOTA: Também pode ser feito com metade do número de células em uma placa tratada com 96 poços.
  2. Adicione água estéril aos poços vazios ao redor para reduzir a evaporação durante a incubação da placa.
  3. Incubar células por 5 dias a 37 °C com 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada sem perturbação, monitorando diariamente morfologia, diferenciação e viabilidade.
    NOTA: Embora o M-CSF (25 ng/mL) possa ser adicionado para diferenciação, confirmamos que nosso protocolo utiliza apenas 10% de FBS de alta qualidade para obter macrófagos M0 após cinco dias de cultura. Recomendamos especificamente evitar o M-CSF devido ao seu potencial de estimular monócitos em direção a um fenótiposemelhante ao do M2 10,22.

5. Exposição de macrófagos a meios condicionados e análise

  1. No quinto dia de diferenciação, remova suavemente 50% (125 μL) do meio de cada poço e substitua por:
    1. 125 μL de meio completo RPMI fresco (controle),
    2. 125 μL de meio condicionado por linhagem celular tumoral (por exemplo, de MDA-MB-231), ou
    3. 125 μL de meio completo DMEM (controle para meios condicionados).
      NOTA: Para otimização inicial com novas linhas celulares tumorais, teste uma variedade de concentrações de meios condicionados (por exemplo, 10%, 25% e 50%). Esse intervalo é sugerido para garantir a viabilidade dos macrófagos e as mudanças na diferenciação. Escolha a maior concentração de meios condicionados que mostrem alta viabilidade de macrófagos.
  2. Continue a incubação até o dia 7.
    NOTA: No dia 5, são obtidos macrófagos M0, e depois mais 2 dias de cultura na presença de meio condicionado são suficientes para induzir a expressão de marcadores de polarização superficial. Marcadores de superfície de polarização são determinados por citometria de fluxo, de forma semelhante, ao usar citocinas padronizadas para gerar macrófagos M1 ouM2 11,14.
  3. Avalie diariamente a viabilidade e morfologia dos macrófagos sob o microscópio.
    NOTA: Monitore a diferenciação de macrófagos diariamente durante o período de cultivo de 7 dias. A adesão celular é usada como indicador de uma cultura saudável e viável. Uma proporção maior de células fusiformes indica aumento da diferenciação e polarização no grupo de tratamento com meio condicionado (CM), como mostrado na Figura 2.

6. Colheita de macrófagos para avaliação de marcadores de polarização por citometria de fluxo

NOTA: Opcionalmente, para expandir ainda mais a caracterização do fenótipo dos macrófagos associados a tumores, isole RNA para medir a expressão de genes associados à polarização (por exemplo, TGM2, IRF-4 e CXCL10) por reação em cadeia quantitativa da polimerase (qPCR) ou colete os supernadantes de cultura para medição da produção canônica de citocinas (por exemplo, TNFα, IL-6 e IL-10) por meio de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), conforme relatado pelo nosso grupo11, 14.

  1. Descarte aspirando suavemente com uma pipeta Pasteur estéril ou despoje o volume total do médio de cultura de cada poço e adicione 200 μL de tampão frio 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA para a colheita celular.
  2. Incube por 10 a 15 minutos no gelo e depois adicione 200 μL de 1x PBS-2% FBS para diluir o buffer EDTA. Colete os macrófagos pipetando para cima e para baixo (ainda no gelo) por mais 5 minutos até que todas as células se soltem.
    NOTA: Esta etapa é crucial para obter um bom número de macrófagos viáveis. É importante não estender o tempo de exposição ao EDTA mais do que o recomendado para preservar a viabilidade celular. Verifique as células ao microscópio após o término do procedimento para garantir que estejam totalmente descoladas.
  3. Colete macrófagos em um microtubo de 1,5 mL e lave-os com 1 mL de 1x PBS-2% FBS por centrifugação a 400 × g por 5 minutos a 8-10 °C.
  4. Resuspenda o pellet de macrófagos com 200 μL de 1x PBS-5% FBS e transfira-os para uma microplaca de fundo arredondado de 96 poços para bloqueio inespecífico em RT por 15 minutos. Centrifuge as células a 400 x g por 5 minutos a 8-10 °C.
  5. Descarte o sobrenadante invertendo rapidamente a placa.
  6. Prepare o coquetel apropriado de anticorpos conjugados diretamente em 1x PBS - 2% FBS usando um fator de diluição 1:50 para cada anticorpo. Tinga cada amostra com 50 μL do coquetel de anticorpos e incube por 30 minutos no escuro, no gelo.
    NOTA: Coquetel de anticorpos: CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 μg/mL), hladr-pe (40 μg/mL) e CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). A concentração de anticorpos pré-titruada está listada na Tabela 1; os números de catálogo podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
  7. Lave os macrófagos corados adicionando 150 μL de 1x PBS e centrifuge a 400 × g por 5 minutos a 8-10 °C.
  8. Descarte o sobrenadante invertendo rapidamente a placa.
  9. Para medir a viabilidade celular, adicione 100 μL do corante de viabilidade fixável Zombie Violet (1:1.000 em 1x PBS) e incube no escuro por 30 minutos no gelo.
  10. Lave as células tingidas adicionando 100 μL de 1x PBS e centrifuge a 400 x g por 5 minutos a 8-10 °C. Repita o procedimento de lavagem usando 200 μL de 1x PBS.
  11. Corriga resuspendendo a célula com 20 μL de paraformaldeído fresco preparado a 1% e incubando-as por 20 minutos no gelo e no escuro.
    NOTA: Paraformaldeído a 1% foi usado para fixação, sem permeabilização. Opcional: O componente fixador comercial (do kit de fixador/permeabilização BD) também pode ser usado para esta etapa11.
  12. Lave as células adicionando 180 μL de 1x PBS-2% FBS e centrifuge a 400 x g por 5 minutos a 8-10 °C. Repita o procedimento de lavagem usando 200 μL de 1x PBS-2% FBS.
  13. Descarte o sobrenadante por inversão de placa e resuspenda o pellet em 200 μL de PBS 1x para levar ao equipamento de citometria de fluxo para medição.
    NOTA: Se amostras coloridas e fixas não puderem ser processadas pela citometria de fluxo no mesmo dia, armazene-as a 4 °C e proteja-as da luz. Analise as amostras o mais rápido possível nos dias seguintes.
  14. Analise os resultados da citometria de fluxo usando o software FlowJo. A estratégia de gate começa excluindo detritos usando espalhamento frontal e lateral (FSC/SSC). Subsequentemente, selecione macrófagos vivos como células violetas zumbi-CD11b⁺.
    NOTA: Como a autofluorescência nos macrófagos depende do doador, é essencial usar controles derivados do mesmo doador para cada experimento.

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Resultados

Geramos células semelhantes a macrófagos associados a tumores (TAM) triplo negativos ao tratar macrófagos derivados de monócitos com meio condicionado (CM) a 50% da linhagem celular MDA-MB-231. Monócitos foram separados de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de seis doadores saudáveis independentes e diferenciados seguindo nosso protocolo. A preparação de MC utilizou células MDA-MB-231 em confluência de 90% (Figura 1). O CM foi ...

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Discussão

O protocolo descrito aqui oferece uma abordagem reprodutível e prática para estudar a polarização semelhante a macrófagos associada a tumores, expondo macrófagos derivados de monófagos humanos a meios condicionados por linhagem celular tumoral. Esse sistema captura a influência dos fatores solúveis secretados pelas células tumorais, que são conhecidas por desempenhar um papel fundamental na reprogramação dos macrófagos no microambientetumoral 7,9,10,15,...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

Reconhecemos o apoio financeiro fornecido pela Agência Nacional para a Promoção da Ciência e Tecnologia (ANPCyT-FONCYT) por meio das bolsas PICT 2021 I-INVI-00034 (para DR), PICT 2021-I-A-00807 (para E.A.C.S.) e PICT 2021-I-A-00716 (para A.E.E.). Também agradecemos ao Conselho Nacional de Pesquisa Científica e Técnica (CONICET) pela bolsa PIP 2022-0763 e à Universidade de Buenos Aires pelo PIDAE 2022, concedido à A.E.E.

M.C.L. foi bolsista Legado Peruilh pela Faculdade de Medicina da Universidade de Buenos Aires e é bolsista de doutorado ANPCyT-FONCYT. D.R., E.A.C.S. e A.E.E. são investigadores de carreira no CONICET.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 488 mouse anti-humano   CD206 Clone de anticorpos 15-2BioLegend, San Diego, CA, EUA.Cat# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 mouse clone anticorpo anti-humano CD64 10.1BioLegend, San Diego, CA, EUA.Cat# 305012; RRID:AB_528867
Citofixo/Citoperma BDBD em Biociências, San Jose, CA, EUACat# 554714Kit fixativo/permeabilização
Eagle Medium Modificado (DMEM) da Dulbecco, glicose altaGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA & NBSP;Cat# 11965092
Kit de Seleção Positiva EasySep para Humanos CD14; Coquetel EasySep Positive Selection; Nanopartículas magnéticas EasySep; Ímã de Separação FácilSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadáCat# 18058
Citômetro FACS Canto  Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nova Jersey, EUA.
Soro fetal bovino, qualificado, Nova Zelândia & nbsp;Gibco & Trade;   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA & NBSP;Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Ciências da Vida, EUACat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow space citometer Sysmex Partec, Alemanha
Clone de anticorpos HLA-DR anti-PE L243BioLegend, San Diego, CA, EUA.Cat# 307605; RRID:AB_314683
Clone de anticorpos de rato PE/Cy7 para rato e rato anti-rato M1/70BioLegend, San Diego, CA, EUA.Cat# 101216; RRID:AB_312799
Clone de anticorpos anti-humanos CD163 de camundongo PerCP/Cy5.5BioLegend, San Diego, CA, EUA.Cat# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 MédioGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA & NBSP;Cat# 11875119
Solução de piruvato de sódioSigma-Aldrich Merck, San Luis, MO, EUA. Cat#  S8636
Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelhoGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA & NBSP;Cat# 25200056
Kit de Viabilidade Corrigível Zombie VioletBioLegend, San Diego, CA, EUA.Cat# 423113

Referências

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

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