Method Article

Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) aumentam significativamente em várias doenças. Os LDN são geralmente isolados por meio de classificação de células. Apresentamos um método prático para obter LDN puro e viável. Após a centrifugação do sangue periférico com gradiente de densidade, as células são incubadas com microesferas magnéticas e, em seguida, o LDN é separado por meio de colunas magnéticas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neutrófilos, importantes leucócitos da imunidade inata, têm sido tradicionalmente considerados uma população celular homogênea. No entanto, evidências recentes mostraram que os neutrófilos existem em várias subpopulações. Uma dessas subpopulações são os neutrófilos de baixa densidade (LDN). Os LDN são encontrados em pequeno número no sangue de indivíduos saudáveis, mas seus números aumentam significativamente em doenças como lúpus eritematoso sistêmico, distúrbios autoimunes, câncer e infecções. Nesses casos, o LDN pode participar da patogênese da doença. A única maneira de isolar o LDN é através da centrifugação com gradiente de densidade do sangue periférico. No entanto, após a centrifugação, o LDN co-purifica com células mononucleares. Assim, estudar essa subpopulação de neutrófilos é um desafio. Não existe uma metodologia padrão para separar o LDN das células mononucleares. Normalmente, os LDN são separados por classificação de células em um citômetro de fluxo. No entanto, este método requer longos tempos de classificação (horas) para obter células puras suficientes para estudos funcionais adicionais. Isso afeta seriamente a viabilidade e a função das células. Aqui, propomos um método prático para obter um grande número de LDN puro e viável em um curto espaço de tempo. Após a centrifugação com gradiente de densidade, a fração de células mononucleares é incubada com microesferas magnéticas anti-CD66b e, em seguida, os LDN são separados através de colunas magnéticas em < 30 min. As LDN purificadas (células CD66b+ ) são marcadas com anticorpos monoclonais contra CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b e CD98 e são analisadas por citometria de fluxo para confirmação. Os LDN purificados são completamente funcionais, conforme indicado por sua capacidade de produzir espécies reativas de oxigênio e formar armadilhas extracelulares de neutrófilos. Este novo método de purificação resulta em LDN com alta pureza (mais de 90%) e viabilidade (mais de 96%) em um curto período de tempo. Este método pode ser facilmente ampliado para obter um grande número de LDN puro para avaliar as funções do LDN em diferentes doenças por meio de análises bioquímicas ou outras análises ômicas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neutrófilos, os leucócitos predominantes no sangue humano1, são os principais participantes do sistema imunológico inato. Eles chegam em grande número aos tecidos com inflamação ou infecção2. Lá, os neutrófilos ativam várias funções efetoras, como fagocitose 3,4, degranulação 5,6 e formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs)7. Além disso, os neutrófilos também participam da resposta imune adaptativa8. A visão clássica dos neutrófilos os considera como células homogêneas produzidas na medula óssea com respostas pré-determinadas9,10. No entanto, estudos recentes revelam que os neutrófilos são células heterogêneas com múltiplos estados fenotípicos e funcionais tanto em estados saudáveis quanto em condições de doença 11,12,13,14,15.

Dentre várias subpopulações de neutrófilos, os neutrófilos de baixa densidade (LDN) têm atraído muito interesse por causa de suas propriedades intrínsecas e por aumentarem em número em várias doenças 16,17,18. Os LDN foram encontrados no sangue de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) em 198619. Eles foram detectados após o processo de separação de leucócitos em um gradiente de densidade 20,21. Após a centrifugação do sangue ou plasma rico em leucócitos em um meio de densidade (por exemplo, Ficoll-Paque), monócitos e linfócitos (conhecidos como células mononucleares do sangue periférico [PBMC]) formam uma faixa na parte superior (baixa densidade) do tubo. Os neutrófilos sedimentam no fundo do tubo. Entre os PBMC, alguns neutrófilos também foram encontrados; estes são LDN (Figura 1). Um pequeno número de LDN está no sangue de indivíduos saudáveis22. No entanto, os números de LDN aumentam significativamente em condições de imunossupressão múltipla e inflamação crônica, incluindo LES23,24, sepse25, psoríase26, asma27, artrite idiopática juvenil28, vasculite associada ao anticorpo anticitoplasma de neutrófilo (ANCA)29, infecção por HIV30, malária31 e tuberculose32. Embora o número de LDN aumente em todas as patologias mencionadas, o LDN tem sido estudado principalmente no contexto do LES17. O LDN do sangue de pacientes com LES parece ter maior capacidade de formar TNEs33, secretar grandes quantidades de mediadores pró-inflamatórios34 e ativar células T24. No entanto, em outras condições, como câncer, os LDN consistem em neutrófilos maduros e imaturos35, com propriedades supressoras de células T 36,37,38. Da mesma forma, em pacientes com COVID-19, o LDN também suprime a proliferação de células T39, mas, ao contrário do LES, o LDN parece produzir menos NETs39. Portanto, a origem, composição e propriedades funcionais do LDN ainda são controversas.

Como os LDN são encontrados junto com o PBMC, estudá-los é tecnicamente complicado. Para explorar completamente as propriedades do LDN em diferentes patologias, é necessário purificá-las. Um procedimento comum de separação de LDN é a classificação de células fluorescentes 22,40,41,42,43,44,45. No entanto, a classificação de células requer muito tempo para a separação de células. Isso pode levar à perda de células ou baixa recuperação se o tempo de classificação não for suficiente. Além disso, as células são submetidas a estresse excessivo, causando resultados variáveis ao estudar a função dessas células. O longo tempo de triagem também aumenta o custo dos procedimentos experimentais e requer pessoal especializado.

Aqui, apresentamos um método rápido e eficiente para obter um grande número de LDN humano puro e viável em um tempo muito curto. Após a centrifugação com gradiente de densidade, os LDN são separados por classificação magnética de células (MACS; Figura 1). A principal vantagem deste método de purificação é que os LDN são separados com alta pureza (mais de 90%) e viabilidade (mais de 96%). Além disso, os LDN purificados são completamente funcionais, conforme indicado por sua capacidade de gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) e liberar NETs. Este protocolo pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório interessado em biologia de neutrófilos para separar rapidamente o LDN do sangue de pessoas com múltiplas doenças, a fim de estudar mais essas células.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos deste protocolo seguem as diretrizes do Comitê de Bioética em Pesquisa com Seres Humanos do Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Todos os participantes forneceram consentimento informado.

1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e neutrófilos do sangue humano

  1. Obtenha cerca de 10 mL de sangue de um voluntário adulto saudável por punção venosa. Adicione 10 U/mL de heparina como anticoagulante.
    CUIDADO: Descarte a agulha em um recipiente de descarte de agulhas de risco biológico. Seringas e outros materiais em contato com o sangue devem ser colocados em uma bolsa e autoclavados antes do descarte.
  2. Em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL, adicione 2 mL de dextrano T500 a 6% em PBS. Em seguida, adicione 10 mL de sangue, drenando-o pela lateral do tubo. Inverta o tubo algumas vezes para misturar o sangue e o dextrano.
  3. Deixe o tubo descansar por 45 min, enquanto os eritrócitos sedimentam. O plasma rico em leucócitos aparece acima da camada eritrocitária.
  4. Em outro tubo de centrífuga de 15 mL, adicione 5 mL de meio de gradiente de densidade. Pipetar cuidadosamente o plasma, sem tocar nos eritrócitos, e colocá-lo sobre o meio. Duas fases separadas devem ser formadas.
  5. Centrifugue o tubo a 516 x g por 20 min a 4 °C. As células mononucleares (PBMC) formam uma banda entre o plasma e as camadas médias. Os neutrófilos formam um pellet na parte inferior (Figura 1).
  6. Isolamento de PBMC
    1. Elimine por aspiração o plasma no topo do PBMC sem tocar nas células. Colete as células da banda entre o plasma e o meio. Certifique-se de aspirar o mínimo de meio possível.
    2. Coloque as células em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL. Adicione 20 mL de PBS. Centrifugar o tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e raspe o tubo para separar as células. Adicione 10 mL de PBS frio para ressuspender as células. Conte o PBMC usando uma câmara de Neubauer.
      NOTA: Não use uma pipeta para ressuspender as células, pois isso pode danificá-las.
  7. Isolamento de neutrófilos
    1. Remova o meio de gradiente de densidade. Separe as células raspando o tubo e adicione 10 mL de PBS frio.
    2. Coloque as células em um tubo de centrífuga novo de 50 mL e centrifugue a 400 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e separar as células como descrito no passo 1.6.3.
  8. Para eliminar os eritrócitos residuais, adicione 10 mL de solução hipotônica fria (NaCl 0,2%, BSA 1%, Hepes 20 mM, pH = 7,4) e misture suavemente por exatamente 1 min.
  9. Adicione rapidamente 10 mL de solução hipertônica fria (NaCl a 1,6%, BSA a 1%, HEPES a 20 mM, pH = 7,4) para tornar a solução isotônica.
  10. Conte os neutrófilos usando uma câmara de Neubauer (pureza > 95%). Pulverizar as células centrifugando como no passo 1.6.2. e ressuspendê-los em PBS frio. Mantenha o tubo no gelo.
    NOTA: É relatado que a meia-vida dos neutrófilos in vitro é de 8 a 12 h 46,47,48. Em nossa experiência com este protocolo, os neutrófilos mantêm suas funções por aproximadamente 6 a 8 h.

2. Purificação de neutrófilos de baixa densidade (LDN)

  1. Centrifugue PBMC a 400 x g por 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 120 μL de tampão de lavagem a frio (1% BSA em PBS).
  2. Adicione 35 μL de microesferas magnéticas CD66b. Incubar a mistura no escuro a 4 °C durante 30 min. Misture suavemente a cada 10 minutos para evitar a agregação celular.
  3. Adicione 1 mL de tampão de lavagem a frio. Coloque as células em uma microcentrífuga e gire a 400 x g por 3 min.
  4. Remova o sobrenadante, separe o pellet celular raspando o tubo e ressuspenda as células em 1 mL de tampão de lavagem.
  5. Coloque uma coluna de separação magnética em um ímã. Adicione 0,5 mL de tampão de lavagem à coluna e deixe-o passar pela coluna.
  6. Transfira as células (1 mL) para a coluna. Deixe o buffer passar pela coluna gota a gota.
  7. Adicione 0,5 mL de tampão de lavagem na coluna e deixe passar. Adicione mais 0,5 mL de tampão de lavagem na coluna.
  8. Remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo de microcentrífuga. Adicione 1 mL de tampão de lavagem à coluna.
  9. Insira o êmbolo no topo da coluna e aplique pressão suavemente para eluir as células. Remova o êmbolo e coloque a coluna em cima de um novo tubo de microcentrífuga.
  10. Adicione mais 1 mL de tampão de lavagem. Insira o êmbolo no topo da coluna e aplique pressão suavemente para eluir as células.
  11. Coloque os dois tubos em uma microcentrífuga e gire-os a 800 x g por 3 min. Finalmente, ressuspenda as células (LDN) de ambos os tubos em 1 mL de PBS frio. Mantenha no gelo.
    NOTA: Os primeiros 2 mL de fluxo contínuo contêm o restante do PBMC. Essas células podem ser usadas para outros estudos.

3. Citometria de fluxo multicolorida

  1. Ressuspenda as células purificadas a 1 x 106 células/mL em tampão de marcação (1% FBS em PBS). Adicione 250 μL de células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Adicione os anticorpos correspondentes contra as moléculas da membrana de neutrófilos (para obter detalhes, consulte a Tabela de Materiais). Incube as células por 30 min a 4 °C, protegendo-as da luz.
  3. Adicione 1 mL de PBS. Coloque os tubos em uma microcentrífuga e gire-os a 800 x g por 3 min.
  4. Aspire o sobrenadante, quebre o pellet celular batendo no tubo e ressuspenda as células em 0,5 mL de paraformaldeído a 1%.
  5. Manter as células protegidas da luz a 4 °C, até serem analisadas por citometria de fluxo. Analise as células por citometria de fluxo, capturando 10.000 eventos por amostra. Execute a classificação de células conforme descrito anteriormente22.
    CUIDADO: O paraformaldeído é um irritante para a pele e o trato respiratório. Certifique-se de não respirar os vapores.

4. Detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS)

  1. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicione 2,5 x 105 células. Coloque os tubos em uma microcentrífuga e gire a 800 x g por 3 min.
  2. Aspire o sobrenadante, raspe o tubo para separar as células e ressuspenda as células em 100 μL de 15 μM de di-hidrorodamina 123 em PBS.
  3. Incubar as células protegidas da luz a 37 °C durante 20 min. Adicione 1 mL de PBS.
  4. Coloque os tubos em uma microcentrífuga e gire a 800 x g por 3 min. Aspire o sobrenadante, raspe o tubo para separar as células e ressuspenda-as em 100 μL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) 50 nM em PBS.
  5. Incubar as células protegidas da luz a 37 °C durante 45 min. Adicione 1 mL de PBS.
  6. Coloque os tubos em uma microcentrífuga e gire-os a 800 x g por 3 min. Aspire o sobrenadante, raspe o tubo para separar as células e ressuspenda-as em 0,5 mL de paraformaldeído a 1% em PBS.
  7. Manter as células a 4 °C protegidas da luz até serem analisadas por citometria de fluxo. Analise as células por citometria de fluxo, capturando 10.000 eventos por amostra.

5. Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs)

  1. Coloque as lamínulas em alvéolos de uma placa de 12 poços e cubra-as com 10 μg/ml de poli-L-lisina. Incubar a placa durante a noite a 4 °C com agitação suave.
  2. Remova a poli-L-lisina e lave as lamínulas com PBS, incubando a placa por 5 min em temperatura ambiente com agitação suave. Lave as lamínulas com PBS mais duas vezes.
  3. Remova o PBS e deixe as lamínulas secarem, colocando a placa dentro de uma capela de fluxo laminar por 2 h.
  4. Ressuspenda LDN a 1 x 106 células/mL em meio RPMI-1640 com 5% de FBS. Pegue 350 μL (3,5 x 105 células) da suspensão celular e coloque-os em um poço da placa de 12 poços contendo as lamínulas.
  5. Manter a placa durante 30 min numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C. Adicione 3,5 μL de 5 μM de PMA diluído em PBS a cada poço (a concentração final de PMA é de 50 nM).
  6. Manter a placa durante 4 h numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C. Adicione 350 μL de paraformaldeído a 8% em PBS e mantenha a placa durante a noite em uma incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C.
  7. Coloque um filme transparente sobre um suporte de tubo de ensaio conforme descrito anteriormente49, de modo que os poços sejam formados nos orifícios do tubo.
  8. Encha cada poço com as várias soluções para lavar ou manchar as lamínulas, formando uma grande gota. Retire as lamínulas e coloque-as de cabeça para baixo sobre uma gota de água por 5 min. Da mesma forma, lave as lamínulas mais três vezes com água.
  9. Coloque as lamínulas de cabeça para baixo em uma gota de tampão de bloqueio (5% BSA em PBS) e incube por 20 min em temperatura ambiente.
  10. Transfira as lamínulas para uma gota do anticorpo primário correspondente (por exemplo, antielastase ou anticitrulina) no tampão de bloqueio e incube por 60 min em temperatura ambiente.
  11. Lave as lamínulas 2x em 0,01% Tween-20 em PBS. Transferir as lamínulas para uma gota do anticorpo secundário correspondente em tampão de bloqueio contendo 150 nM DAPI e incubar durante 60 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz.
  12. Lave as lamínulas 2x em 0,01% Tween-20 em PBS. Coloque uma gota de meio de montagem antidesbotamento em uma lâmina de vidro e coloque as lamínulas de cabeça para baixo.
  13. Sele as lamínulas ao redor do perímetro com esmalte. Armazene as corrediças montadas a 4 °C, protegidas da luz. Visualize NETs usando um microscópio de fluorescência.

6. Detecção de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs)

  1. Ressuspender as células a 5 x 105 células/mL em Sytox Green 500 nM, diluído em meio RPMI-1640 com 5% de FBS.
  2. Pegue 100 μL (5 x 104 células) da suspensão celular e coloque-os em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.
  3. Manter a placa durante 20 min numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C. Adicionar a cada poço 20 μL de PMA 300 nM diluído em meio RPMI-1640 (a concentração final de PMA é de 50 nM).
  4. Transfira a placa para um leitor de microplacas pré-aquecido. Incubar a placa a 35 °C durante 4 h, efectuando medições de fluorescência a partir do fundo da placa de 5 em 5 minutos (utilizando os filtros de excitação de 485 nm e de emissão de 528 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) em indivíduos saudáveis representam cerca de 5% da PBMC (Figura 2A). O protocolo descrito aqui normalmente fornece LDN puro (> 90%). As células também são recuperadas de forma eficiente (rendimento em torno de 98%) com alta viabilidade (> 95%; Figura 2B). Para comparação, os LDN também foram purificados por classificação de células ativadas por fluorescência, conforme descrito anterio...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geralmente, os neutrófilos eram considerados células homogêneas. No entanto, evidências recentes mostraram que os neutrófilos podem existir como células com diferentes estados de ativação e/ou múltiplos fenótipos. Assim, várias subpopulações de neutrófilos podem existir 13,14,15. Uma subpopulação de neutrófilos, os neutrófilos de baixa densidade (LDN), adquiriu grande interesse devido às suas pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores afirmam que este estudo foi realizado sem quaisquer vínculos comerciais ou financeiros que pudessem ser percebidos como um potencial conflito de interesses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a César Díaz-Godínez (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) por sua ajuda com a microscopia fluorescente para visualizar TNEs. Esta pesquisa foi financiada pela bolsa PAPIIT IN205523 da Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), México, e pela bolsa CF-2023-I-610 da Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), México.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Anticorpo policlonal anti-citrulina do coelhoAbCamab100932Diluição 1/50
Placa de cultura de tecidos de 96 poçosColega; Corning, Inc.3596
Anticorpo IgG1 do camundongo Alexa Fluor 488 antihumano CD11bBioLegend3013170,25 & mu; g/mL
Anticorpo IgM de camundongo Alexa Fluor 647 anti-humano CD66bBioLegend3051090,05 & mu; g/mL
Anticorpo anti-camundongo IgG (H+L), Alexa Fluor 488Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-11001Diluição 1/50
Anticorpo monoclonal IgG1 de camundongo anti-neutrófilo elastaseSanta Cruz BiotecnologiaSC-5554910 & micro; g/mL
Anticorpo anti-Rabbit IgG (H+L) de burro, Alexa Fluor 555Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-31572Diluição 1/50
Anticorpo IgG1 de camundongos anti-humano CD62L APCBioLegend3048090,03 & mu; g/mL
Anticorpo IgG1 de camundongos CD14 anti-humano APC/Cyanine7BioLegend3671070,25 & mu; g/mL
Attune NxT flow citômetro Thermo Fisher Scientific, Inc.(lasers azul/vermelho)
Albumina sérica bovina (BSA) Fração VMP Biomédicos810025
Anticorpo IgG1 do camundongo Brilliant Violet 510 anti-humano CD33BioLegend3666090,30 & mu; g/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
Dextran T500Farmacosmos Ar-condicionado5.51005E+11
Dihidrorodamina-123Anaspec, Inc.AS-85711
Classificador de células FACSBecton Dickinson Modelo FACSAria
Soro fetal bovino (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
Anticorpo IgG1 do camundongo anti-humano CD98 do FITCBioLegend3156030,30 & mu; g/mL
FlowJo SoftwareBecton DickinsonVersão 10, 2019
Microscópio invertido de fluorescênciaOlympusModelo IX-70
HeparinaInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HepesSigma AldrichH7006
Microesferas de Quimerismo CD66b da MACSprepMiltenyi Biotec130-111-552
ÍmãMiltenyi Biotec130-042-102
Coluna de separação magnéticaMiltenyi Biotec130-042-201
MicrocentrífugaEppendorfModelo 5415C
Leitor de microplacasBioTek InstrumentsSinergia de Modelos HT
ParaformaldeídoSigma Aldrich158127
Anticorpo IgG1 de camundongo PE anti-humano CD10BioLegend3122030,05 & mu; g/mL
Anticorpo IgG2a de camundongo anti-PEBD Pharmingen550868Diluição 1/40
Anticorpo IgG1 do camundongo anti-humano PE/Cianano5BioLegend3230130,25 & mu; g/mL
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma AldrichP8139
poli-L-LisinaSigma AldrichP2658
Centrífuga refrigeradaEppendorfModelo 5702R
Meio de cultura de tecidos RPMI-1640Gibco23400-021
SYTOX GreenMolecular Probes, Inc.S-7020
Pré-adolescente-20 & nbsp;Sigma AldrichP2287
VectashieldLaboratórios VectorH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
  2. Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  3. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A fundamental process in immunity. Biomed Res Int. 2017, 9042851(2017).
  4. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  5. Faurschou, M., Borregaard, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 5 (14), 1317-1327 (2003).
  6. Lacy, P., Eitzen, G. Control of granule exocytosis in neutrophils. Front Biosci. 13, 5559-5570 (2008).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Leukoc Biol. 108 (1), 377-396 (2020).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Lawrence, S. M., Corriden, R., Nizet, V. The ontogeny of a neutrophil: Mechanisms of granulopoiesis and homeostasis. Microbiol Mol Biol. Rev. 82 (1), e00057-e00117 (2018).
  11. Aroca-Crevillén, A., Vicanolo, T., Ovadia, S., Hidalgo, A. Neutrophils in physiology and pathology. Annu Rev Pathol. 19, 227-259 (2024).
  12. Hellebrekers, P., Vrisekoop, N., Koenderman, L. Neutrophil phenotypes in health and disease. Eur J Clin Invest. 48 (Suppl 2), e12943(2018).
  13. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nat Rev Immunol. 19 (4), 255-265 (2019).
  14. Qu, J., Jin, J., Zhang, M., Ng, L. G. Neutrophil diversity and plasticity: Implications for organ transplantation. Cell Mol Immunol. 20 (9), 993-1001 (2023).
  15. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Front Physiol. 9, 113(2018).
  16. Silvestre-Roig, C., Fridlender, Z. G., Glogauer, M., Scapini, P. Neutrophil diversity in health and disease. Trends Immunol. 40 (7), 565-583 (2019).
  17. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  18. Ning, X., Wang, W. M., Jin, H. Z. Low-density granulocytes in immune-mediated inflammatory diseases. J Immunol. 2022, 1622160(2022).
  19. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheum. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  20. Böyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  21. García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J Vis Exp. (74), e50410(2013).
  22. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  23. Midgley, A., Beresford, M. W. Increased expression of low-density granulocytes in juvenile-onset systemic lupus erythematosus patients correlates with disease activity. Lupus. 25 (4), 407-411 (2016).
  24. Rahman, S., et al. Low-density granulocytes activate T cells and demonstrate a non-suppressive role in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 78 (7), 957-966 (2019).
  25. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low-density subpopulations and CD10 (calla) negative neutrophils in severely infected patients. Surg Today. 22, 322-327 (1992).
  26. Lin, A. M., et al. Mast cells and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in psoriasis. J Immunol. 187 (1), 490-500 (2011).
  27. Fu, J., Tobin, M. C., Thomas, L. L. Neutrophil-like low-density granulocytes are elevated in patients with moderate to severe persistent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 113 (6), 635-640 (2014).
  28. Ramanathan, K., et al. Neutrophil activation signature in juvenile idiopathic arthritis indicates the presence of low-density granulocytes. Rheumatology (Oxford). 57 (3), 488-498 (2018).
  29. Grayson, P. C., et al. Neutrophil-related gene expression and low-density granulocytes associated with disease activity and response to treatment in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis. Arthritis Rheumatol. 67 (7), 1922-1932 (2015).
  30. Cloke, T., Munder, M., Taylor, G., Müller, I., Kropf, P. Characterization of a novel population of low-density granulocytes associated with disease severity in HIV-1 infection. PLoS One. 7, e48939(2012).
  31. Rocha, B. C., et al. Type I interferon transcriptional signature in neutrophils and low-density granulocytes is associated with tissue damage in malaria. Cell Rep. 13 (12), 2829-2841 (2015).
  32. Deng, Y., et al. Low-density granulocytes are elevated in mycobacterial infection and associated with the severity of tuberculosis. PLoS One. 11 (4), e0153567(2016).
  33. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
  34. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  35. Sagiv, J. Y., et al. Phenotypic diversity and plasticity in circulating neutrophil subpopulations in cancer. Cell Rep. 10 (4), 562-573 (2015).
  36. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The multifaceted roles neutrophils play in the tumor microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (December), 125-158 (2015).
  37. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  38. Vanhaver, C., et al. Immunosuppressive low-density neutrophils in the blood of cancer patients display a mature phenotype. Life Sci Alliance. 7 (1), e202302332(2023).
  39. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).
  40. Cabrera, L. E., et al. Characterization of low-density granulocytes in COVID-19. PLoS Pathog. 17 (7), e1009721(2021).
  41. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils and neutrophil extracellular traps (nets) are new inflammatory players in heart failure. Can J Cardiol. 40 (9), 1524-1535 (2024).
  42. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils contribute to subclinical inflammation in patients with type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1674(2024).
  43. Jones, B. E., et al. Anca autoantigen gene expression highlights neutrophil heterogeneity, where expression in normal-density neutrophils correlates with anca-induced activation. Kidney Int. 98 (3), 744-757 (2020).
  44. Li, Y., et al. The proportion, origin, and pro-inflammation roles of low-density neutrophils in SFTS disease. BMC Infect. Dis. 19 (1), 109(2019).
  45. Martin, K. R., et al. Cd98 defines a metabolically flexible, proinflammatory subset of low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Clin Transl Med. 13 (1), e1150(2023).
  46. Murphy, M. P., Caraher, E. Mcl-1 is vital for neutrophil survival. Immunol Res. 62 (2), 225-233 (2015).
  47. Nauseef, W. M. Neutrophils, from cradle to grave and beyond. Immunol Rev. 273 (1), 5-10 (2016).
  48. Pérez-Figueroa, E., Álvarez-Carrasco, P., Ortega, E., Maldonado-Bernal, C. Neutrophils: Many ways to die. Front Immunol. 12, 631821(2021).
  49. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  50. Emmendörffer, A., Hecht, M., Lohmann-Matthes, M. L., Roesler, J. A fast and easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorhodamine 123. J Immunol Methods. 131 (2), 269-227 (1990).
  51. Pioch, J., Blomgran, R. Optimized flow cytometry protocol for dihydrorhodamine 123-based detection of reactive oxygen species in leukocyte subpopulations in whole blood. J Immunol Methods. 507, 113308(2022).
  52. Liu, X., et al. Pad4 takes charge during neutrophil activation: Impact of pad4 mediated net formation on immune-mediated disease. J Thromb Haemost. 19 (7), 1607-1617 (2021).
  53. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  54. Alemán, O. R., Mora, N., Cortes-Vieyra, R., Uribe-Querol, E., Rosales, C. Transforming growth factor-β-activated kinase 1 is required for human fcγriiib-induced neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 7, 277(2016).
  55. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent net release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  56. Sanchez Gonzalez, A., Bardoel, B. W., Harbort, C. J., Zychlinsky, A. Neutrophil methods and protocols. , Humana Press - Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  57. Mishalian, I., Granot, Z., Fridlender, Z. G. The diversity of circulating neutrophils in cancer. Immunobiology. 222 (1), 82-88 (2017).
  58. Wright, H. L., Makki, F. A., Moots, R. J., Edwards, S. W. Low-density granulocytes: Functionally distinct, immature neutrophils in rheumatoid arthritis with altered properties and defective TNF signalling. J Leukoc Biol. 101 (2), 599-611 (2017).
  59. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of mdsc: Assays, problems and potential solutions. Cancer Immunol Immunother. 68 (4), 631-644 (2019).
  60. Kimberly, R. P., Ahlstrom, J. W., Click, M. E., Edberg, J. C. The glycosyl phosphatidylinositol-linked FCγRIII PMN mediates transmembrane signaling events distinct from FCγRII. J Exp Med. 171 (4), 1239-1255 (1990).
  61. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Fc receptors: Cell activators of antibody functions. Adv Biosci Biotech. 4, 21-33 (2013).
  62. Unkeless, J. C., Shen, Z., Lin, C. W., Debeus, E. Function of human fcγriia and fcγriiib. Semin Immunol. 7 (1), 37-44 (1995).
  63. Ghaemdoust, F., Keshavarz-Fathi, M., Rezaei, N. Natural killer cells and cancer therapy, what we know and where we are going. Immunotherapy. 11 (14), 1231-1251 (2019).
  64. Lanier, L. L., Le, A. M., Civin, C. I., Loken, M. R., Phillips, J. H. The relationship of CD16 (leu-11) and leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 136 (12), 4480-4486 (1986).
  65. Huizinga, T. W., et al. The pi-linked receptor fcriii is released on stimulation of neutrophils. Nature. 333 (6174), 667-669 (1988).
  66. Jongstra-Bilen, J., Harrison, R., Grinstein, S. Fcγ-receptors induce mac-1 (cd11b/cd18) mobilization and accumulation in the phagocytic cup for optimal phagocytosis. J Biol Chem. 278 (46), 45720-45729 (2003).
  67. Tak, T., et al. Human CD62Ldim neutrophils identified as a separate subset by proteome profiling and in vivo pulse-chase labeling. Blood. 129 (26), 3476-3485 (2017).
  68. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Exp Cell Res. 342 (2), 200-209 (2016).
  69. Schröder, A. K., Uciechowski, P., Fleischer, D., Rink, L. Crosslinking of CD66 b on peripheral blood neutrophils mediates the release of interleukin-8 from intracellular storage. Hum Immunol. 67 (9), 676-682 (2006).
  70. Skubitz, K. M., Campbell, K. D., Skubitz, A. P. Cd66a, cd66b, cd66c, and cd66d each independently stimulate neutrophils. J Leukoc Biol. 60 (1), 106-117 (1996).
  71. Basic principle of magnetic cell separation. , Miltenyi Biotec. https://www.miltenyibiotec.com/UN-en/products/macs-cell-separation/basic-principle-of-magnetic-cell-separation.html?query=:relevance:allCategoriesOR:10000089 (2025).
  72. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci. Rep. 12 (1), 3667(2022).
  73. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  74. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J Clin Invest. 126 (5), 1612-1620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Low Density NeutrophilsMagnetic MicrobeadsNeutrophil PurificationDensity GradientPeripheral BloodFlow CytometryMononuclear CellsReactive Oxygen SpeciesNeutrophil Extracellular TrapsCD66b Marker

Related Articles