Um protocolo para construir um modelo de camundongo de fibrose miocárdica hipertensiva usando angiotensina II

Summary

A infusão contínua de angiotensina II (Ang II) via bombas osmóticas é um dos métodos clássicos para a construção de modelos animais de fibrose miocárdica hipertensiva. Este protocolo otimizou sistematicamente o processo de construção deste modelo e elaborou os pontos-chave de implante da bomba osmótica, posicionamento e ajuste da concentração de Ang II.

Abstract

A infusão contínua de angiotensina II (Ang II) por meio de bombas osmóticas é uma abordagem amplamente utilizada para o estabelecimento de modelos animais de fibrose miocárdica hipertensiva. No entanto, essa técnica apresenta certas limitações nos relatos atuais, como a instabilidade da Ang II, o posicionamento impreciso da bomba e a falta de um procedimento padronizado. Os relatórios atuais sobre a metodologia de estabelecimento permanecem relativamente limitados. Este protocolo otimizou sistematicamente o estabelecimento de modelos de fibrose miocárdica hipertensiva induzida por bomba osmótica de Ang II em camundongos, incluindo a preparação padronizada da solução de Ang II, calibração de dosagem, implante subcutâneo preciso de bombas osmóticas e padrões quantitativos para indicadores de avaliação de modelos. Os resultados experimentais demonstraram que a fibrose miocárdica hipertensiva induzida por bomba osmótica de Ang II em camundongos com altas taxas de sobrevivência. Os níveis de pressão arterial sistólica (PAS) estabilizaram-se em 160 mmHg após sete dias de implante subcutâneo. Os camundongos modelo reduziram significativamente as frações de ejeção do ventrículo esquerdo e aumentaram as dimensões diastólicas finais do ventrículo esquerdo. Em comparação com o grupo de cirurgia simulada, a deposição de colágeno no tecido intersticial miocárdico hipertensivo e nas regiões perivasculares aumentou. Este estudo, baseado em um pequeno tamanho de amostra (n = 6), validou preliminarmente a viabilidade de estabelecer um modelo de camundongo de fibrose miocárdica hipertensiva usando Ang II combinada com uma bomba osmótica e estabeleceu um sistema quantitativo de verificação de fenótipo.

Introduction

A fibrose miocárdica (FM), um dos principais desfechos patológicos da hipertensão, é caracterizada pela deposição excessiva de fibras colágenas dentro do miocárdio danificado ou comprimido. Representa uma das formas mais importantes de lesão de órgãos-alvo mediada pela hipertensão e contribui para a disfunção cardíaca progressiva ^1,2. O estabelecimento de modelos animais apropriados é essencial para o avanço da pesquisa mecanicista e o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a fibrose miocárdica hipertensiva. A angiotensina II (Ang II), um efetor central do sistema renina-angiotensina, desempenha um papel fundamental na patogênese da hipertensão³. A indução baseada em Ang II tornou-se, portanto, uma abordagem amplamente utilizada para estabelecer modelos de hipertensão em camundongos.

Os métodos atuais para a construção de modelos animais de hipertensão incluem principalmente indução cirúrgica, indução farmacológica e modelos espontâneos transgênicos. A indução cirúrgica normalmente usa técnicas como constrição da artéria renal, constrição da aorta ascendente ou constrição do arco aórtico para aumentar artificialmente a resistência ao fluxo sanguíneo, induzindo pressão arterial elevada⁴. Embora esses métodos possam estabelecer rapidamente estados de hipertensão adequados para estudar processos de remodelação cardíaca relacionados à carga de estresse, eles envolvem procedimentos complexos com inúmeras complicações pós-operatórias. A indução farmacológica geralmente utiliza injeção intraperitoneal ou administração oral para elevar a pressão arterial em animais experimentais⁵. Embora a tecnologia seja relativamente simples, a estabilidade do modelo permanece suscetível à interferência da dosagem do medicamento, frequência de administração e respostas ao estresse dos animais. Modelos transgênicos, como ratos espontaneamente hipertensos e camundongos hipertensos BPH / 2J, que exibem fenótipos estáveis de hipertensão, são amplamente utilizados na pesquisa de hipertensão hereditária. No entanto, seus mecanismos patogênicos singulares limitam sua capacidade de simular hipertensão clínica induzida por múltiplos fatores.

Mais recentemente, modelos de hipertensão baseados na infusão contínua de Ang II via bombas osmóticas subcutâneas ganharam popularidade. Este método permite a liberação sustentada de Ang II a uma taxa constante, mantendo concentrações sanguíneas estáveis por longos períodos para imitar de perto os processos patológicos e replicar a fibrose miocárdica hipertensiva de camundongo ^6,7,8. No entanto, limitações importantes permanecem, principalmente no que diz respeito à padronização do protocolo e resultados fibróticos inconsistentes, que podem ser influenciados por fatores como técnica de implantação da bomba e respostas específicas do animal⁹. Para resolver essas lacunas, este estudo refina o modelo baseado em bomba osmótica Ang II, padroniza as principais etapas e fornece um protocolo visualizado. Essas melhorias aumentam a reprodutibilidade e a aplicabilidade prática, oferecendo uma referência valiosa para estudos futuros sobre fibrose miocárdica hipertensiva.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde, e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal da Southwest Medical University (número de aprovação SWMU2020317).

1. Preparação da solução de Ang II e enchimento da bomba osmótica

1. Selecione 12 camundongos C57BL / 6J machos de grau SPF (consulte a Tabela de Materiais) pesando 20 ± 1 g, selecionando animais de 8 semanas de idade por sua uniformidade de desenvolvimento para controlar fatores de confusão relacionados à idade. Divida os camundongos em um grupo de cirurgia simulada e um grupo modelo usando um método de randomização simples, com 6 camundongos em cada grupo.
2. Meça o peso corporal inicial do camundongo e determine a dose de Ang II (ver Tabela de Materiais) como 1,46 mg / kg / d.
   NOTA: De acordo com o experimento preliminar, 1,46 mg / kg / d é a dose ideal de Ang II. Esta dose mantém de forma confiável a pressão arterial sistólica em aproximadamente 160 mmHg, induzindo efetivamente fibrose miocárdica patológica e garantindo a sobrevivência dos animais durante todo o estudo de 4 semanas.
3. Adicione 2,45 mL de solução salina estéril a 0,9%, pré-resfriada a 4 ° C, a 10 mg de pó liofilizado Ang II. Misture bem a solução e mantenha-a no gelo para uso imediato.
4. Execute o procedimento no gelo usando uma seringa para extrair a solução de Ang II e, em seguida, injete sequencialmente 200 μL (concentração de 3,91 mmol / L) em cada uma das seis câmaras da bomba osmótica (consulte a Tabela de Materiais).
5. Ative o acionamento de pressão osmótica imergindo a bomba em solução salina estéril a 37 °C por 48 h.
   NOTA: Encha as bombas osmóticas para o grupo de cirurgia simulada com um volume igual de solução salina. Como a Ang II é fotossensível, o procedimento deve ser realizado sob proteção total contra a luz durante todo o processo.

2. Implantação das bombas osmóticas e construção do modelo ⁶

1. Preparo e anestesia de animais
   1. Jejue os ratos por 4 h com livre acesso à água. Em seguida, pesar cada camundongo e calcular a dose anestésica apropriada (80 mg/kg de pentobarbital sódico)¹⁰.
   2. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal da dose calculada de pentobarbital sódico.
      NOTA: O manuseio do pentobarbital requer conformidade com os regulamentos, operação em capela de exaustão, uso de equipamento de proteção e rotulagem do líquido residual para descarte separado.
2. Remova os pelos da pele dorsal sobre a região que se estende da base da cauda até a área dorsal média usando uma navalha ou creme depilatório.
3. Desinfete completamente a área raspada três vezes com etanol 70%¹¹.
4. Usando um bisturi, faça uma incisão subcutânea de 0,5 cm dentro da área desinfetada.
5. Através da incisão, use uma pinça para separar sem corte o tecido subcutâneo em direção à parte posterior do pescoço, criando uma bolsa.
6. Oriente o corpo da bomba com a ponta do cateter apontando para a cabeça do mouse. Em seguida, prenda a ponta com pinça hemostática e insira a bomba por via subcutânea nessa direção.
7. Após o implante da bomba, suturar o tecido subcutâneo com suturas absorvíveis 6-0 interrompidas e fechar a incisão da pele com suturas cirúrgicas. Em seguida, coloque o mouse em um tapete térmico pré-aquecido a 37 °C até que ele se recupere totalmente da anestesia (aproximadamente 5-10 min).
8. Infundir continuamente a solução preparada de Ang II na dose predeterminada (1,46 mg/kg/d) através das bombas osmóticas durante 28 dias.
9. Após a conclusão do período de perfusão de 28 dias, recolher todos os dados experimentais. Em seguida, anestesiar os camundongos da mesma maneira que foi feito para anestesias anteriores, ou seja, seguindo os procedimentos descritos nas etapas 2.1.1-2.1.2, e sacrificá-los por luxação cervical.

3. Medição da pressão arterial

1. Pré-aquecimento do equipamento (consulte a Tabela de Materiais): Defina a plataforma de aquecimento para 37-38 °C para garantir a vasodilatação nos vasos sanguíneos da cauda do rato.
2. Segure suavemente o mouse e coloque-o no suporte de retenção, garantindo que a cauda se projete livremente pelo orifício traseiro. Em seguida, limpe bem a cauda exposta com uma bola de algodão embebida em álcool.
3. Coloque um manguito inflável na base da cauda. Posicione o sensor de pulso aproximadamente 5-10 mm distal ao manguito na seção da cauda média a inferior.
4. Ative o dispositivo e aguarde a estabilização da forma de onda do pulso antes de prosseguir.
5. Inicie o ciclo de medição. O sistema inflará automaticamente o manguito a uma pressão superior a 200 mmHg para ocluir o fluxo sanguíneo e, em seguida, desinflará lentamente a 2-3 mmHg por s. O sensor detecta o reaparecimento da onda de pulso à medida que o fluxo é retomado, determinando a pressão sistólica.
6. Meça a pressão arterial sistólica (PAS) em intervalos de 7 dias após a modelagem, para um total de cinco medições. Para cada mouse em cada ponto de tempo, registre três leituras sequenciais, permitindo um período de descanso de 2 minutos entre medições consecutivas.
7. Após as medições, retorne o mouse à sua gaiola com comida e água. Limpe o suporte e a luva traseira para evitar contaminação cruzada.

4. Medição da função cardíaca

1. No dia 28 de modelagem, anestesiar todos os camundongos experimentais com pentobarbital sódico (80 mg/kg de pentobarbital sódico).
2. Posicione o mouse em decúbito dorsal em uma plataforma de temperatura constante.
3. Realize ecocardiografia transtorácica usando um sistema de ultrassom (consulte a Tabela de Materiais). Conecte os membros do mouse aos eletrodos na plataforma para monitorar os sinais do eletrocardiograma (ECG).
4. Obtenha imagens de eixo curto ao nível do músculo mamário por meio de ultrassom no modo M para visualizar o coração e analisar a função cardíaca. Capture três imagens por camundongo e calcule a média dos dados para análise subsequente da dimensão diastólica interna do ventrículo esquerdo (LVIDd), diâmetro sistólico interno do ventrículo esquerdo (LVIDs), encurtamento fracionário do ventrículo esquerdo (LVFS) e fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF).
   NOTA: Mantenha o contato da sonda com a parede torácica sem comprimir a cavidade torácica; Assegurar a conduta de recolha em modo M perpendicular ao septo ventricular; realizar medições contínuas por ≥ 3 ciclos cardíacos para obter valores médios.

5. Coloração de Masson

1. Amostragem e fixação cardíaca
   1. Anestesiar o camundongo com pentobarbital sódico (80 mg/kg de pentobarbital sódico). Em seguida, fazer uma incisão longitudinal de aproximadamente 1,5 cm na cavidade torácica com tesoura, ligar os principais vasos cardíacos e extirpar rapidamente o coração para evitar lesão por tração¹².
   2. Enxágue imediatamente o coração excisado com PBS pré-resfriado para remover o sangue e enxugar suavemente o excesso de umidade usando papel de filtro limpo. Em seguida, faça um corte transversal ao longo do músculo papilar para obter um corte de tecido de 3 mm de espessura.
   3. Para fixação, mergulhe as amostras de coração em paraformaldeído a 4% por mais de 48 h, garantindo uma proporção mínima de volume tecido-fixador de 1:10.
2. Remova o tecido cardíaco do fixador de paraformaldeído a 4%. Em seguida, sob uma capela de exaustão, corte o tecido em fatias finas com uma espessura de 4 μm com uma faca cirúrgica e transfira os cortes para um de desidratação¹³.
3. Carregue as seções de tecido no desidratador e execute as seguintes etapas: etanol 70%, etanol 80%, etanol 95% por 1 h cada; 100% etanol I & II por 45 min cada; xileno I e II por 30 min cada.
4. Incorpore o tecido em parafina e, em seguida, solidifique os blocos em uma placa fria pré-resfriada a -20 ° C.
5. Use um micrótomo de parafina para obter cortes longitudinais de 4 μm de espessura dos blocos de tecido embebidos em parafina. Em seguida, mergulhe sequencialmente os cortes nas seguintes soluções por 5 min cada para desparafinizar e reidratá-los: xileno I, xileno II, etanol absoluto, etanol 95%, etanol 80%, etanol 70% e, finalmente, água destilada.
6. Mergulhe o tecido na solução preparada de coloração de hematoxilina de ferro de Weigert por 8 min. Em seguida, enxágue repetidamente com água destilada para remover o excesso de solução de coloração. Diferenciar em solução de diferenciação ácida de etanol por 5 s, seguido de azulamento em solução azulada de Masson por 5 min. Por fim, enxágue com água destilada¹⁴.
7. Manchar as secções com vermelho carmim durante 10 min, aplicando aproximadamente 200-300 μL por lâmina para garantir uma cobertura completa e uniforme do tecido. Em seguida, enxágue as seções em ácido acético glacial a 0,2% por 1 min.
8. Trate as seções com solução de ácido fosfomolíbdico por aproximadamente 5 min ou até que as fibras musculares fiquem vermelhas. Em seguida, core as seções com um volume suficiente de solução de azul de anilina para cobrir completamente o tecido (normalmente 200-300 μL por lâmina) por 5 min. Por fim, enxágue as seções com solução de ácido acético glacial a 0,2%¹⁵.
9. Desidratar as seções por meio de uma série graduada de etanol. Prossiga para limpar os tecidos com xileno usando três imersões de 1-2 min cada.
10. Monte as seções aplicando uma pequena quantidade de resina neutra e cobrindo com uma lamínula.
11. Exame microscópico (ver Tabela de Materiais): Observe os tecidos corados por Masson com aumento de 40×, 20× e 10×. Fotografe cada slide para preservar imagens representativas.
    NOTA: Descarte todos os resíduos de acordo com os protocolos de segurança institucionais. Colete a solução de diferenciação ácida e o ácido acético glacial em barris resistentes à corrosão, neutralize os resíduos de alta concentração a pH 6-8 e não misture com soluções alcalinas. Armazene o etanol em barris à prova de explosão em local fresco, longe de fontes de fogo. Segure o xileno em barris marrons, opere em uma capela de exaustão com equipamento de proteção usado e não misture ácidos (substâncias) com etanol. Coloque os tecidos animais em recipientes rotulados, feche-os e armazene-os em condições de congelamento¹⁶. Por fim, transfira todos os resíduos para instituições profissionais qualificadas para descarte; proibir estritamente a mistura de resíduos ou descartá-los casualmente.

6. Análise estatística

1. Colete todos os dados numéricos e analise usando o GraphPad Prism 9.0.
2. Use o teste t de amostra independente para analisar as diferenças entre os grupos.
3. Defina a significância estatística como **P < 0,01 para altamente significativo e *P < 0,05 para significativo.

Results

Doze camundongos foram implantados por via subcutânea com bombas osmóticas e sobreviveram. Todos os grupos modelo desenvolveram hipertensão (n = 6). Sete dias após o implante, a média da PAS no grupo modelo excedeu 160 mmHg (Figura 1A). Nos dias 14, 21 e 28, a PAS no grupo modelo manteve-se consistentemente acima de 160 mmHg. Em contraste, o grupo de cirurgia simulada manteve níveis normais de PAS (aproximadamente 90-110 mmHg) durante todo o experimento sem elevação significativa.

Discussion

Esse protocolo otimizou as principais etapas envolvidas na infusão contínua de Ang II para induzir fibrose miocárdica hipertensiva usando uma bomba osmótica e detalhou os aspectos críticos, como o posicionamento de implantação da bomba osmótica e a configuração da concentração de Ang II. A bomba modelo 2004 foi escolhida por sua duração de 4 semanas, e a dose de Ang II foi calculada com base na taxa nominal de infusão, levando em conta a variabilidade mínima entre os lotes. A eficácia de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ang II	Sigma-Aldrich Corporation	Sigma, A9525
Máquina de anestesia animal	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R530
Ventilador animal	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R415
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Versão 9.0
Monitor inteligente de pressão arterial não invasivo	Nippon Soft Dragon Co., Ltd	Softron, BP-98A
Microscópio óptico	Yijingtong Optical Technology (Shanghai) Co., Ltd	OLYMPUS, SZ61TR
Solução e Kit de Coloração Tricolor Masson	Beijing Soleibao Technology Co., Ltd	Solarbio, G1340
Mouses	Chengdu Dossy Exprimental Animals CO., Ltd	C57BL/6J
Bombas osmóticas	ALZA Corporation	Alzet, Modelo 2004
Sistemas de imagem por ultrassom	FUJIFILM VisualSonics Corporation, Canadá	FUJIFILM, Vevo 3100