Modelagem da Metástase Cerebral: Análise Padronizada da Colonização Metastática e Padrões de Crescimento Histológico por Injeção Intracortical Estereotáxica

Resumo

A técnica de injeção intracraniana estereotáxica permite a implantação precisa e localizada de células tumorais no córtex do camundongo, tornando-se um modelo poderoso para estudar a colonização metastática do cérebro.

Resumo

As metástases cerebrais são uma complicação comum e devastadora de tumores sólidos avançados, frequentemente associadas a prognóstico ruim, declínio neurológico e redução da qualidade de vida. A incidência de falência do sistema nervoso central (SNC) e morte neurológica está aumentando rapidamente, mas os mecanismos que impulsionam os estágios finais da metástase cerebral, como disseminação secundária, recolonização e a contribuição do padrão histológico de crescimento (HGP) como possível parâmetro substituto, permanecem pouco compreendidos.

O modelo padronizado de injeção intracortical estereotáxica permite a implantação precisa e reprodutível de células tumorais, ou populações mistas incluindo componentes estromais ou imunes, diretamente no córtex cerebral do camundongo. Esse protocolo também apoia a criação de um arquivo tecidular pré-clínico, oferecendo uma plataforma robusta para investigar aspectos essenciais da colonização do SNC, tais como: crescimento metastático, dinâmica de crescimento específica do HGP e mecanismos fisiopatológicos que contribuem para a falha neurológica. Além disso, esse modelo suporta testes farmacológicos em um contexto clinicamente relevante e reprodutível.

Diferentemente dos métodos sistêmicos de injeção (por exemplo, veia caudal ou intracardia), que são otimizados para estudar etapas metastáticas iniciais, mas resultam em taxas variáveis e frequentemente baixas de colonização cerebral, o modelo estereotáxico garante um crescimento metastático consistente, específico do cérebro, e possibilita a investigação dos estágios finais da metástase do SNC. Comparado a sistemas ex vivo , como organoides ou culturas de fatias cerebrais, o modelo estereotáxico in vivo preserva a vascularização, a sinalização sistêmica e toda a complexidade do cenário imunológico do cérebro, apoiando estudos de longo prazo sobre progressão tumoral e resposta terapêutica.

Ao fornecer uma plataforma reprodutível e clinicamente relevante, nosso modelo avança a capacidade do campo de identificar marcadores prognósticos, explorar estratégias terapêuticas e compreender os mecanismos da metástase cerebral em estágio tardio.

Introdução

As metástases cerebrais são uma complicação comum e devastadora em pacientes com tumores sólidos, frequentemente associadas a prognóstico ruim, declínio neurológico significativo e redução da qualidade^{de vida 1,2,3}. Em particular, a falência do sistema nervoso central (SNC) e a morte neurológica tornaram-se desfechos cada vez mais frequentes em cânceres como pulmão, mama e ^melanoma 4,5,6,7. A falência do SNC no contexto das metástases cerebrais pode ocorrer de diversos mecanismos, incluindo efeito de massa local, edema peritumoral, hemorragia intracraniana e disseminação meníngea, que podem atuar de forma independente ou sinérgica para, em última instância, resultar em morte^{neurológica 8}.

Apesar de sua importância clínica, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à falência do SNC e aos estágios finais da progressão metastática permanecem pouco compreendidos. Processos como disseminação alternativa, disseminação secundária e recolonização raramente são o foco de investigação^{dedicada 8}. Tanto estudos clínicos quanto pré-clínicos frequentemente limitam suas análises a desfechos como número de metástases cerebrais, tamanho ou sobrevivência geral (SO), negligenciando assim insights mecanicistas críticos e as verdadeiras causas do declínio neurológico e da morte.

Nesse contexto, nós e outros identificamos padrões distintos de crescimento histológico (HGPs) em metástases cerebrais que se correlacionam com desfechos^{clínicos 9,10,11}. Três HGPs principais foram descritos: i) não infiltrativos, marcados por uma borda tumoral bem demarcada, frequentemente cercada por uma borda astrocítica reativa; ii) infiltrativo epitelial, onde agrupamentos de células tumorais infiltram o parênquima cerebral adjacente sem contenção astrocítica; e iii) infiltrativo difuso, caracterizado por infiltração generalizada de células tumorais individuais ou pequenos aglomerados, causando uma astrogliose^{extensa 10,12}.

Clinicamente, HGPs infiltrativos estão associados a um prognóstico significativamente pior em comparação com padrões não^{infiltrativos 9,10,11}. Além disso, os HGPs parecem refletir aspectos-chave da dinâmica do crescimento tumoral e dos mecanismos que levam à morte neurológica. Enquanto metástases não infiltrativas normalmente se expandem como uma única lesão e restringem estruturas vitais no cérebro, lesões infiltrativas apresentam disseminação secundária (começando pela lesão existente e não pelo tumor primário) dentro do SNC, contribuindo para danos generalizados e destruição completa de órgãos (dados não publicados). Lesões infiltrativas também podem recolonizar as meninges, contribuindo para a metástase meníngea e complicando ainda mais o curso da^{doença 10,13}. Apesar de sua relevância clínica, os HGPs das metástases cerebrais e os estágios finais da colonização do SNC, incluindo a disseminação secundária e a recolonização do mesmo órgão, permanecem pouco estudados, em grande parte devido à falta de modelos experimentais adequados.

Para preencher essa lacuna, apresentamos um modelo estereotáxico de injeção intracraniana que permite a implantação precisa e reprodutível de células tumorais ou misturas celulares compostas por células tumorais e um ou mais tipos celulares não tumorais no córtex cerebral de camundongos experimentais. Este modelo supera limitações importantes dos modelos de metástase sistêmica e oferece uma plataforma robusta para investigar aspectos essenciais da colonização do SNC, tais como: interações tumor-células imunes durante a^{colonização 14}, o impacto de misturas celulares pré-tratadas¹⁵, crescimento^{metastático 16}, dinâmicas específicas de crescimento do HGP e mecanismos fisiopatológicos que contribuem para a falha neurológica (dados não publicados). Além disso, este modelo suporta testes farmacológicos em um contexto reprodutível e clinicamente^{relevante 14,15}.

Esse protocolo oferece uma estrutura metodológica detalhada para implementar o modelo de injeção estereotáxica para estudar HGPs em metástase cerebral. Também apoia o desenvolvimento de um arquivo estruturado de amostras pré-clínicas e uma biblioteca digital de tecidos para investigação sistemática da biologia da colonização do SNC em estágio avançado. Nosso objetivo é possibilitar a identificação de biomarcadores prognósticos e potencialmente preditivos, contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas aprimoradas e aprimorar nossa capacidade de prever respostas agudas e crônicas do parênquima cerebral e do sistema imunológico. Por meio dessa abordagem, buscamos fornecer uma plataforma padronizada para um estudo sistemático da colonização do SNC e da progressão metastática.

Protocolo

Todos os procedimentos animais descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Governo da Baixa Francônia (número da permissão: RUF-55.2.2-2532-2-1678). Este protocolo foi desenvolvido para a injeção intracortical, estereotáxica, de células tumorais em camundongos adultos sintéticos (10-12 semanas de idade), como modelo para colonização metastática do cérebro. Quaisquer alterações no protocolo devem ser discutidas com o responsável pelo bem-estar animal designado.

1. Procedimentos pré-operatórios

1. Aclimatação de animais
   NOTA: Os camundongos devem ser aclimatados por pelo menos 7 dias antes do início dos procedimentos experimentais.
   1. Hospedar animais experimentais em grupos sob condições laboratoriais padrão (22 ± 2 °C, 50-60% de umidade relativa, ciclo de 12 horas de luz/escuro) com acesso ad libitum a comida e água.
   2. Para promover o bem-estar e reduzir o estresse, forneça enriquecimento ambiental na forma de material de ninho, abrigos e blocos de roer.
   3. Manuseie os animais uma vez ao dia (3-5 minutos por sessão) durante o período de aclimatação para familiarizá-los com o contato humano. Além disso, realize procedimentos simulados que simulem aspectos-chave da cirurgia futura, incluindo pesagem e exposição ao sistema de anestesia, sem realizar nenhuma intervenção invasiva. Essas sessões visam habituar os animais ao ambiente procedural e minimizar a variabilidade relacionada ao estresse.
2. Exame físico (exame pré-cirúrgico)
   NOTA: Antes da injeção de células tumorais, todos os animais devem passar por um exame físico e neurológico completo para excluir quaisquer anomalias pré-existentes não relacionadas ao estudo. Animais que apresentem déficits ou anomalias devem ser excluídos do estudo. O exame físico pode ser realizado no dia anterior à injeção.
   1. Realize uma inspeção física completa avaliando a saúde geral, incluindo condição do pelagem, postura, respiração, marcha, peso corporal e comportamento geral.
   2. Avalie a função neurológica usando o Teste do Fio Pendurante para avaliar a força de pega e a coordenação. Para realizar o Teste do Fio Suspenso, suspenda um fio horizontal (aproximadamente 2 mm de diâmetro) entre dois suportes, com plataformas de escape posicionadas nas extremidades, cerca de 30 cm acima de uma superfície acolchoada. Coloque o rato no centro do fio e permita que ele segure o fio com as patas dianteiras. Solte o mouse e comece a cronometrar imediatamente. Termine o teste quando o mouse alcançar uma das plataformas ou cair. Considere um mouse bem-sucedido se ele chegar à plataforma dentro de 60 s; Registre como falha se cair ou não alcançar a plataforma dentro desse limite de tempo.
3. Preparação das estações de trabalho
   1. No dia da cirurgia (dia 0), instale quatro estações de trabalho dedicadas, conforme descrito abaixo, para garantir um fluxo de trabalho eficiente e manter a técnica estéril durante todo o procedimento.
      NOTA: Use materiais cirúrgicos estéreis (subcamadas, compressas de gaze, pontos, etc.) e instrumentos cirúrgicos autoclavados (bisturi, fêpceps, tesouras, espátula, etc.).
      1. Estação de trabalho #1 - Preparação pré-cirúrgica dos animais: Use esta estação para pesar os camundongos, preparar a solução anestésica e administrar a anestesia. Prepare uma superfície limpa contendo uma balança, duas gaiolas com cama (designe uma para camundongos anestesiados), uma seringa de 1 mL cheia com a solução anestésica e pomada para os olhos.
      2. Estação de trabalho #2 - Configuração pré e pós-cirurgia: Use esta estação para realizar a incisão no couro cabeludo, selar o crânio e suturar a ferida. Prepare uma superfície limpa contendo um bisturi, uma seringa de 10 mL com 0,9% de NaCl, cera óssea, espátula, material para sutura, pinças e tesouras, cotonetes, desinfetante (70% etanol), uma seringa de 1 mL com analgésicos e uma almofada térmica ou uma plataforma de aquecimento similar.
      3. Estação de trabalho #3 - Preparação de células tumorais: Use esta estação para preparar a solução das células tumorais antes da inoculação. Prepare uma superfície limpa contendo uma caixa de gelo com uma seringa Hamilton de 10 μL e um tubo Eppendorf com suspensão celular em meio de matriz extracelular (ECM), uma pipeta com pontas de 100 μL para ressistência de células, e três vasos para limpeza da seringa Hamilton após inoculação de células tumorais contendo água destilada, 70% de etanol e 0,9% de NaCl.
      4. Estação de Trabalho #4 - Injeção estereotáxica: Use esta estação para realizar a injeção estereotáxica de células tumorais no córtex cerebral. Prepare uma superfície limpa contendo a estrutura estereotáxica para pequenos animais, uma broca dentária de precisão, pinças grandes e cotonetes.
4. Preparação da suspensão de células tumorais
   NOTA: Todos os procedimentos para a preparação da suspensão de células tumorais devem ser realizados em um armário certificado de segurança biológica (capuz Classe II), utilizando equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jaleco, luvas e proteção ocular, para garantir a esterilidade e proteger o pessoal contra possíveis riscos biológicos.
   1. Tripsinize células usando 1 mL de tripsina 1x EDTA.
      NOTA: Recomenda-se o uso de células tumorais na fase de crescimento exponencial.
   2. Determine a contagem celular com precisão usando um método de contagem apropriado (por exemplo, hemocitômetro ou contador automático de células).
   3. Prepare uma suspensão celular contendo 1 x 10³ células em 3 μL de meio ECM por animal. Use uma mistura 2:1 de ECM e meio de cultura padrão contendo 10% de FCS e outros suplementos conforme apropriado. Aumente o volume da suspensão e o número de células de acordo com o número de animais (por exemplo, para 10 camundongos, prepare 10 × 10³ células em meio ECM de 30 μL).
      NOTA: O número de células injetadas deve ser cuidadosamente ajustado para cada linhagem celular.
   4. Mantenha a suspensão da célula no gelo até a injeção, por um máximo de 2 horas.

2. Procedimentos intraoperatórios

1. Anestesia de camundongos
   1. Pese cada camundongo usando uma balança de precisão e calcule o volume necessário de anestésico com base no peso corporal.
   2. Administrar o volume calculado do anestésico intraperitonealmente.
      NOTA: Use um regime anestésico que cubra todo o procedimento (aproximadamente 2 horas). Por exemplo: cetamina 10% (cloridrato de cetamina, 100 mg/mL; 100 mg/kg de peso corporal) combinada com Domitor (medetomidina cloridrato, 1 mg/mL; 0,25 mg/kg de peso corporal), ou um protocolo equivalente.
   3. Uma vez confirmada a profundidade adequada da anestesia, coloque o rato em uma almofada térmica pré-aquecida (mantida entre 37-38 °C) para apoiar a termorregulação e aplique pomada ocular para proteger a córnea do ressecamento.
      NOTA: Confirme a profundidade suficiente da anestesia beliscando suavemente a pata traseira com pinças. Prossiga com a cirurgia apenas se não houver reflexo de abstinência.
2. Preparação do couro cabeludo e incisão
   1. Administre lidocaína pré-operatório para administrar anestesia local no local da incisão. Use uma solução de lidocaína a 1% (5 mg/mL) e injete aproximadamente 0,05-0,1 mL subcutâneo ao longo da linha de incisão planejada. Deixe pelo menos 2-3 minutos para o anestésico fazer efeito antes de prosseguir com a incisão no couro cabeludo.
   2. Desinfete cuidadosamente o couro cabeludo usando uma solução à base de iodo.
   3. Estique a pele até o máximo e faça uma incisão na linha média de cerca de 3-4 mm ao longo do crânio usando um bisturi estéril.
   4. Usando o mesmo bisturi, raspe suavemente o periósteo para expor a superfície do crânio.
3. Configuração do quadro estereotáxico, identificação de coordenadas e craniotomia
   1. Prenda a cabeça do mouse no quadro estereotáxico usando barras auriculares.
   2. Usando o braço estereotáxico, localize o Bregma (a interseção dos pontos coronal e sagital do crânio) e depois mova o braço estereotáxico 2 mm para frente e 1 mm lateral (direito) para o local de injeção alvo no córtex frontal, conforme indicado na Figura 1B , e marque com um marcador cirúrgico.
      NOTA: Se houver um vaso sanguíneo no local de injeção pretendido, a localização pode ser ajustada em até 0,5 mm para evitar hemorragia.
   3. Perfure cuidadosamente o crânio usando uma broca dentária de precisão, tomando cuidado para não penetrar na dura-mãe.
   4. Confirme a abertura sondando suavemente com pinças estéreis para sentir a busca de avanços.
4. Injeção de células tumorais
   NOTA: Trabalhe rapidamente durante essa etapa, pois a ECM começa a solidificar à temperatura ambiente, o que pode interferir na precisão e consistência da injeção.
   1. Ressuspenda completamente a suspensão das células tumorais, pipetando para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme.
      NOTA: Evite o vórtice para evitar a formação de bolhas de ar.
   2. Coloque 3 μL da suspensão da célula em uma seringa Hamilton de 10 μL e coloque-a no quadro estereotáxico usando o suporte apropriado.
   3. Posicione cuidadosamente a agulha da seringa sobre o orifício da rebarba.
      NOTA: Certifique-se de que o bisel da agulha esteja voltado para a esquerda para aumentar a reprodutibilidade durante a injeção.
   4. Insira a agulha verticalmente no tecido cerebral até uma profundidade de 3,5 mm. Quando essa profundidade for atingida, retire lentamente a agulha em 0,5 mm para ajudar a evitar o refluxo da suspensão celular durante e após a injeção.
   5. Injete os 3 μL de suspensão de células tumorais lentamente durante um período de 1 minuto. Após o volume total ser administrado, mantenha a agulha no lugar por mais 2 minutos para permitir que as células e a ECM se estabilizem, minimizando qualquer risco de refluxo.
   6. Retire cuidadosamente a seringa e retire o rato do quadro estereotáxico.
5. Suturas e recuperação da anestesia
   1. Enxágue suavemente o crânio com uma solução estéril de NaCl 0,9%.
   2. Seque e fele o buraco da rebarba usando cera óssea.
   3. Feche a incisão no couro cabeludo usando 3 a 4 pontos, garantindo que cada ponto seja amarrado com três nós apertados próximos às bordas da ferida para uma cicatrização adequada.
   4. Marque as orelhas do rato com um padrão de perfuração auricular correspondente ao número de identificação designado.
   5. Reaplique pomada ocular se necessário para evitar o ressecamento da córnea durante a recuperação. Imediatamente depois, o rato retorne a uma almofada térmica pré-aquecida (mantida entre 37-38 °C) para apoiar a termorregulação e facilitar a recuperação suave da anestesia.
      NOTA: Recomenda-se que os camundongos sejam acolhidos individualmente durante a recuperação para evitar lesões causadas por interações entre animais acordados e em recuperação.
   6. Limpe e desinfete bem a seringa Hamilton enxaguar a agulha e o barril três vezes consecutivamente: primeiro com água destilada, depois com etanol 70% e, finalmente, com solução estéril de NaCl 0,9%.
   7. Após a limpeza, guarde a seringa Hamilton no gelo até o próximo uso.

3. Procedimentos pós-operatórios

1. Analgesia pós-operatória
   1. Administrar analgésicos por via subcutânea enquanto o camundongo ainda está sob anestesia para garantir alívio imediato da dor pós-operatória.
      NOTA: Use analgésicos adequados para esse tipo de procedimento. Por exemplo, Carprofeno com 10 mg/kg de peso corporal.
   2. Quando o camundongo estiver totalmente acordado e recuperar a função motora normal, transfira-o para uma gaiola limpa com cama fresca. Monitore brevemente o animal quanto ao comportamento normal e aos padrões respiratórios.
   3. Após a recuperação completa, administre analgesia por meio de água potável (por exemplo, metamizol a 200 mg/kg de peso corporal) por pelo menos 24 horas após a cirurgia.
      NOTA: Para estimular a ingestão de água, adoçe a água com 0,5% de sacarose. Embrulhe as garrafas em papel alumínio para proteger a solução da luz e substitua-as diariamente. Rotule cada frasco para acompanhar a ingestão de analgésicos. Se não forem consumidos analgésicos por meio de água potável ou se houver sinais de dor, administre Carprofeno (10 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea a cada 12 horas até a recuperação total.
2. Monitoramento de camundongos
   1. Monitore todos os camundongos de perto a cada 24 horas durante as primeiras 48 horas após a cirurgia, avaliando a função motora e o comportamento. A partir do terceiro dia, monitore camundongos pelo menos a cada 3 dias, incluindo medições de peso corporal.
   2. Se forem observados sinais de sofrimento ou comportamento anormal (por exemplo, atividade motora prejudicada, comportamento incomum), realize o Teste do Fio Pendurado, conforme descrito anteriormente. Se o mouse passar no teste, continue monitorando e repita o teste dia sim, dia não.
   3. Eutanasiar os camundongos imediatamente (ver Seção 3.4) ao atingir um dos critérios humanos predefinidos: perda de peso > 20% em relação ao peso corporal inicial (dia 0), falha no Teste do Fio Suspenso ou sofrimento moderado sustentado com duração de até 48 horas.
3. Tratamento terapêutico (opcional)
   1. Após a recuperação pós-operatória completa, pode ser iniciado um regime terapêutico dependendo do desenho experimental. Se for esse o caso, defina claramente o momento do início do tratamento no protocolo do estudo e adapte o plano de monitoramento para refletir os efeitos esperados e potenciais efeitos colaterais da intervenção terapêutica.
      NOTA: O tratamento não deve começar até que os animais demonstrem comportamento normal, peso estável e ausência de sinais de sofrimento pós-operatório.
4. Eutanásia e coleta de tecidos
   NOTA: Os ratos devem ser eutanasiados imediatamente após atingir os objetivos humanos pré-definidos ou em pontos de tempo experimental designados, conforme exigido pelos objetivos específicos da pesquisa.
   1. Anestesie o rato usando um método apropriado (veja o passo 2.1.2).
   2. Abra a cavidade torácica e realize perfusão transcárdica com 10-20 mL de NaCl estéril gelado a 0,9%, seguido por 10-20 mL de paraformaldeído gelado (PFA).
      NOTA: Se tecido fresco for necessário para aplicações posteriores (por exemplo, isolamento de RNA ou FACS), omita a etapa de perfusão do PFA.
   3. Colete o cérebro e outros órgãos de interesse.
      NOTA: Os órgãos podem ser congelados rapidamente em nitrogênio líquido, fixados em formalina para processamento de FFPE ou usados diretamente para análises a jusante.
5. Análise post-mortem estruturada
   NOTA: Para confirmar o crescimento metastático e caracterizar características histopatológicas associadas, a análise post-mortem do tecido cerebral deve ser realizada utilizando amostras nativas (frescas congeladas) e fixas (FFPE).
   1. Dissecação de tecidos
      1. Dissecar o cérebro no nível do local da injeção, conforme indicado no esquema fornecido na Figura 1C.
      2. Manter a porção anterior para processamento fresco congelado (FF). Divida essa porção em hemisférios injetados (i.) e não injetados (n.i.).
      3. Preserve a porção central para fixação de formolão e embedding de parafina (FFPE).
      4. Descarte a porção posterior, incluindo o cerebelo e o tronco encefálico.
   2. Processamento de amostras
      1. Congele rapidamente a porção anterior em nitrogênio líquido e armazene amostras de FF a -80 °C até novo uso.
      2. Fixe a porção central em 5-7 mL de PFA a 4% em temperatura ambiente por 48 horas antes do processamento com FFPE.
         NOTA: A fixação de PFA deve ser realizada em uma exaustor químico usando EPI adequado para evitar exposição a vapores tóxicos.
   3. Quantificação da carga metastática (amostras FF)
      1. Isole o RNA total usando um kit ou protocolo de extração apropriado, otimizado para tecido cerebral.
         NOTA: O isolamento de RNA deve ser realizado em um gabinete de segurança biológica usando EPI apropriado para evitar contaminação e exposição a reagentes perigosos.
      2. Realize PCR quantitativa (qPCR) usando um marcador específico de célula tumoral, como Ck8.
         NOTA: Alvos adicionais (por exemplo, marcadores imunes ou de células estromais) podem ser avaliados selecionando marcadores gênicos apropriados. O sequenciamento de RNA (RNA-seq) pode ser usado como alternativa para análise em todo o transcriptoma.
      3. Calcule a carga tumoral relativa normalizando o gene de interesse (GOI, por exemplo, Ck8) a um gene de manutenção (HK).
   4. Análise histológica (amostras FFPE)
      1. Incorpore tecido fixado com formol na parafina.
      2. Seccione as amostras em fatias de 3 μm de espessura usando um micrótomo.
         NOTA: O uso de microtomos deve ser realizado por profissionais treinados com EPI apropriado, utilizando a proteção da lâmina quando não for cortada e descartando as lâminas em recipientes para objetos cortantes para garantir a segurança.
      3. Realizar coloração padrão de Hematoxilina e Eosina (H&E) e imunohistoquímica (IHC) usando anticorpos relevantes, como Ck8 (células tumorais), Cd3 (células T), Iba1 (microglia/macrófagos) e Gfap (astrócitos).
         NOTA: Os procedimentos de H&E e IHC devem ser realizados em uma área bem ventilada ou exaustor de fumo para garantir a segurança e prevenir exposição a produtos químicos.
      4. Escaneie digitalmente todas as lâminas coradas usando um scanner de slides de alta resolução para construir uma biblioteca digital de tecidos.
      5. Avalie o padrão histológico de crescimento (HGP) da metástase cerebral seguindo o protocolo^{publicado 10,12}.

Resultados

O protocolo de injeção estereotáxica (Figura 1) pode ser aplicado tanto a modelos de camundongos sintéticos quanto a modelos de xenoenxerto, incluindo cepas do tipo selvagem ou geneticamente modificadas, dependendo da questão científica. Qualquer linha celular adequada capaz de crescer no cérebro pode ser utilizada. Exemplos de linhagens celulares de tumores murinos que podem colonizar o cérebro incluem, mas não se limitam a, as células tumorais de mama 4T1 e 410.4, as células do câncer colorretal CMT93 e a linhagem de melanoma B16-F10. O tempo necessário para as células tumorais estabelecerem metástases no cérebro varia conforme a linhagem celular, variando de alguns dias a várias semanas, e a penetrância também é variável. Recomendamos o uso de um modelo com penetrância de ~70%, o que significa que pelo menos 7 em cada 10 animais desenvolvem metástases dentro de um período experimental máximo de 20 semanas (Figura 2A). Cada linhagem celular deve ser otimizada individualmente e o número de células injetadas cuidadosamente titulado.

Como exemplo, comparamos dois modelos sintéticos de metástase cerebral para câncer de mama intimamente relacionados: 410.4 e seu derivado 4T1. Apesar de sua semelhança genética¹⁷, essas linhagens celulares apresentam comportamentos metastáticos e padrões de crescimento no cérebro marcadamente diferentes¹⁶. Embora ambos alcancem uma carga metastática semelhante (Figura 2B), cada um apresenta um curso temporal único (Figura 2C) e HGPs claramente distintos (Figura 2D). Para avaliar e comparar sistematicamente a eficiência da colonização entre diferentes linhagens celulares, desenvolvemos o Índice de Colonização, uma fórmula matemática que integra o número de células injetadas, o tempo mediano de sobrevivência e o sucesso da colonização (Figura 2E-G).

Ao realizar a injeção estereotáxica pela primeira vez ou testar uma nova linhagem celular, é essencial avaliar cuidadosamente os padrões de crescimento e comparar os resultados entre animais, cirurgias e experimentadores para garantir a reprodutibilidade. Uma etapa crítica é a injeção de células tumorais, durante a qual pode ocorrer vazamento da suspensão celular. Isso pode resultar em localização tumoral enganosa, particularmente a semeadura iatrogênica das células tumorais no crânio e/ou nas meninges, potencialmente levando a metástase meníngea falsamente positiva que não representa verdadeira colonização intracerebral com disseminação meníngea secundária subsequente. Esses cenários estão ilustrados na Figura 3.

Figura 1: Procedimentos pré, intra e pós-operatórios para a injeção estereotáxica intracortical-celular de células tumorais em camundongos. Visão geral esquemática do procedimento. (A) A fase pré-operatória inclui aclimatação animal, avaliação de saúde, preparação do local cirúrgico e suspensão de células tumorais. (B) A fase intra-operatória envolve indução da anestesia, incisão do couro cabeludo, colocação no corpo estereotáxico, craniotomia precisa, injeção de células tumorais no córtex cerebral usando coordenadas estereotáxicas, fechamento da ferida e recuperação da anestesia. (C) A fase pós-operatória inclui administração de analgésicos, monitoramento rotineiro para avaliar a recuperação pós-cirúrgica, estado geral de saúde e desenvolvimento de sintomas neurológicos (Teste de Fio Suspenso), seguida de eutanásia e coleta de órgãos. Uma análise post-mortem estruturada é incluída para avaliar a carga metastática em tecido fresco congelado (FF) via qPCR e para avaliar padrões histológicos de crescimento em amostras de FFPE a partir de uma biblioteca digital de lâminas. As principais etapas procedurais são ilustradas sequencialmente para enfatizar o tempo e o fluxo de trabalho cirúrgico. Imagem criada no BioRender. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Resultados representativos do crescimento metastático em modelos camundongos de metástase cerebral após injeção estereotáxica de células de câncer de mama 4T1 e 410,4. (A) Imagens macroscópicas mostrando a ausência de crescimento tumoral em camundongos controle Balb/C injetados por ECM (Control) e a presença de lesões metastáticas visíveis em camundongos injetados com suspensões de células tumorais em ECM (Met). (B) Quantificação da carga metastática em camundongos controle injetados por ECM (CTRL) e camundongos com metástases cerebrais derivadas de células de câncer de mama 4T1 e 410.4. A carga metastática foi avaliada por qPCR usando Ck8 como marcador tumoral, com Gapdh e Pgk1 como genes de manutenção (HK). Os dados são apresentados como valores médios com pontos de dados individuais. A análise estatística foi realizada usando ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett (n = 5; ****P < 0,0001). (C) Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier comparando a sobrevivência geral (OS) de camundongos injetados estereotaticamente com ECM sozinho (controle, preto), 4T1 (laranja) ou 410,4 (azul) células tumorais. A análise estatística foi realizada usando o teste de Log-rank (Mantel-Cox) (4T1 vs 410,4; n = 10; ***P < 0,001). (D) Imagens histológicas representativas de metástases cerebrais derivadas de células 4T1 e 410,4, ilustrando diferenças nos padrões de crescimento, incluindo HGPs epiteliais infiltrativos em forma de coorte e de fio, respectivamente. As seções do tecido foram coradas com um anticorpo anti-citoceratina 8. (E) Análise comparativa da eficiência da colonização usando o Índice de Colonização (CI). Os valores de IC 4T1 (laranja) e 410,4 (azul) são mostrados. (F) Fórmula usada para calcular o IC. (G) Tabela resumindo os parâmetros incluídos no CI para ambos os modelos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Exemplos representativos de resultados bem-sucedidos e subótimos de injeção estereotáxica. (A,C) Imagens macroscópicas mostrando crescimento metastático em diferentes locais: (A) crescimento tumoral no crânio e meninges resultantes de injeção incorreta e vazamento de células tumorais, e (C) metástase parênquimatosa bem-sucedida após injeção intracortical adequada. (B,D) Seções histológicas correspondentes confirmando (B) crescimento tumoral intrameníngeo com infiltração subsequente no parênquima cerebral e (D) disseminação secundária para as meninges a partir de uma metástase parênquima estabelecida. As seções do tecido foram coradas com um anticorpo anti-citoceratina 8. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

A técnica de injeção intracraniana estereotáxica permite a entrega precisa e localizada de células tumorais ou misturas celulares diretamente no córtex cerebral de camundongos experimentais. Quando combinado com uma análise post-mortem estruturada, esse modelo é particularmente valioso para estudar estágios avançados da metástase cerebral, incluindo crescimento metastático, disseminação intra-orgânica secundária e a possível causa da morte. Em contraste, métodos de injeção sistêmica (por exemplo, veia caudal ou injeção intracardíaca) são mais adequados para investigar as etapas iniciais da cascata metastática, como a sobrevivência de células tumorais na circulação, extravasamento e semeadura em órgãos distantes. No entanto, essas abordagens não são específicas do cérebro e normalmente resultam em taxas baixas e inconsistentes de colonização^cerebral 18,19,20.

Modelos sistêmicos também apresentam alta variabilidade biológica, especialmente em relação a quais regiões cerebrais são afetadas, tornando os estudos terapêuticos desafiadores e exigindo grandes coortes de animais. Além disso, os animais frequentemente desenvolvem metástases extracranianas, que podem levar à descontinuação precoce do^{ensaio 19}. Essas limitações reduzem significativamente sua utilidade para estudar metástases cerebrais em estágio avançado. Além disso, a disseminação secundária e a recolonização são particularmente difíceis de investigar usando modelos sistêmicos, pois distinguir entre disseminação primária (originária do tumor primário) e disseminação secundária (originada de uma metástase já estabelecida) é quase impossível. Além disso, uma análise post-mortem estruturada, especialmente para avaliar o crescimento macro-metastático e os HGPs das metástases cerebrais, é limitada nesses contextos.

Comparado a sistemas ex vivo, como organoides derivados do paciente (PDOs) e coculturas organotípicas de fatias^cerebrais 21,22,23,24, a injeção estereotáxica oferece várias vantagens críticas. Embora modelos ex vivo preservem aspectos da arquitetura cerebral nativa e possam incluir células imunes residentes e infiltradas de pacientes ou doadores, eles carecem de vascularização, sinalização sistêmica e toda a complexidade do microambiente tumoral in vivo, particularmente a infiltração adicional de células T ou outras células imunes derivadas da medula sanguínea^{ou óssea 23}. Essas limitações restringem sua aplicação a estudos de curto prazo e contextos simplificados, como triagem de drogas ou ensaios básicos de interação celular-cérebro metastático. Em contraste, a abordagem estereotáxica apoia estudos de longo prazo sobre progressão tumoral, resposta imune e intervenção terapêutica em um organismo vivo e intacto. Importante destacar que a avaliação dos sintomas neurológicos como um desfecho humano permite uma medida clinicamente relevante do início macro-metastático. Isso torna o modelo ainda mais reflexivo do curso da doença humana, o que é especialmente valioso em pesquisa translacional. Embora envolva o uso de animais, levantando considerações éticas abordadas pela adesão às 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento), esse modelo atualmente não pode ser totalmente substituído por alternativas ex vivo. Sua capacidade de replicar todo o contexto fisiológico da metástase cerebral o torna indispensável para avançar nosso entendimento sobre dinâmicas metastáticas e fisiopatologia específica do SNC.

Apesar de suas inúmeras vantagens, o modelo de injeção estereotáxica apresenta algumas limitações que devem ser consideradas. Uma preocupação principal é o possível vazamento da suspensão das células tumorais durante a injeção, o que pode resultar em padrões de crescimento enganosos. Em particular, a adesão não intencional das células tumorais às meninges pode levar à metástase^{meníngea iatrogênica 8}, o que não reflete com precisão o curso natural da disseminação metastática nessa linha celular específica. Para garantir a confiabilidade dos dados, os padrões de crescimento de uma determinada linhagem celular tumoral devem ser consistentemente comparados entre animais, procedimentos cirúrgicos e experimentadores. Para minimizar o vazamento celular tumoral, propomos o uso da matriz extracelular (ECM), pois sua consistência semelhante a gel e capacidade de solidificar na temperatura corporal a tornam uma ferramenta útil. No entanto, a ECM também apresenta desafios, incluindo a necessidade de manuseio rápido durante a injeção para evitar solidificação prematura. Outra consideração em nosso protocolo é que as células tumorais são injetadas em uma mistura de ECM e meio contendo soro. Embora a FBS aumente o enfràtimento das células tumorais ao fornecer nutrientes que normalmente são limitados no cérebro, ela também pode promover inflamação. Se isso for uma preocupação, mídias sem soro ou soluções salinas balanceadas (por exemplo, HBSS ou PBS) podem ser usadas como alternativas.

Além disso, a injeção estereotáxica é tecnicamente mais exigente do que outros métodos, como a injeção intravenosa (i.v.). Exige treinamento específico para garantir a reprodutibilidade, e o procedimento é significativamente mais demorado, normalmente levando de 15 a 30 minutos por animal, em comparação com 3 a 5 minutos para injeções intravenosas. Essa duração maior limita o número de animais que podem ser processados por sessão, o que pode representar um desafio para estudos terapêuticos que exigem grandes coortes para alcançar poder estatístico. No entanto, essa limitação pode ser efetivamente resolvida distribuindo as injeções ao longo de vários dias, o que não só aumenta a flexibilidade experimental e a viabilidade, mas também introduz uma valiosa variabilidade biológica, refletindo diferenças mais realistas entre indivíduos tanto no comportamento das células tumorais quanto na resposta do hospedeiro.

Por fim, é importante notar que esse modelo ignora etapas anteriores da cascata metastática, como discutido anteriormente. O modelo experimental apropriado deve ser selecionado com base na questão de pesquisa e na fase específica da metástase estudada. Para investigar a colonização cerebral em estágio avançado, a injeção intracortical estereotáxica permanece o padrão ouro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alicate para orelhas de animais	LabArt
Bepanthen & reg; Pomada para olhos e nariz	Bayer Vital GmbH	1578675
Cera óssea	B.Braun	210434
Cotonetes	Hartmann	143213
Extrato de Membrana Baseal (ECM) de Cultrex	B& D	3432-005-01
Desinfetante	B.Braun	107190
Broca	Bilaney Consultants GmbH	D #76
Tesoura de olho	Hermle	501
Seringa Hamilton (10µ Volume L)	VWR	5491135
Bolsa térmica	Intergastro	258122
Ensaio de Nase/Barra de Dente do Rato (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
Tesoura de olho Noyes	Hermle	545
Paur 60° dica não noptore Mouse Ear Bars	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
Bisturi	PFM Medicina AG	17027
Pinça padrão de Semkin	Hermle	710
Sutura de poliamida Seralon (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	Serag-Wiessner GmbH	V0053491
Broca Estereotáxica - Jacobs Chuck - 18000rpm	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
Estereotáxico sem adaptador Rat	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963 % 920
Disco de seringa para 5& 10µ I Hamilton	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
Portaagulhas TC Mayo-Heear 160mm	Hermle	6425