Artigo de método

Caracterização Morfologica da Regeneração Anterior em Diopatra claparedii

DOI:

10.3791/69421

⸱

13 de março de 2026

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1Faculty of Science and Marine Environment, Universiti Malaysia Terengganu, 2STEM Foundation Centre, Universiti Malaysia Terengganu

Neste artigo

Resumo

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Esse protocolo fornece uma estrutura focada para caracterizar o processo de regeneração anterior em Diopatra claparedii, servindo como um passo crítico para futuros estudos regenerativos.

Resumo

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Poliquetos possuem a capacidade de regenerar segmentos anteriores e posteriores após lesão ou autoamputação, oferecendo um sistema manejável para estudar a reparação de feridas e o padrão tecidual. Para apoiar estudos comparativos e mecanicistas na regeneração de anélides, este estudo apresenta um protocolo para induzir e caracterizar a regeneração anterior em Diopatra claparedii (D. claparedii). O protocolo descreve etapas para manuseio de espasmes, imobilização e amputação precisa, seguidas por pontos de observação programados para documentar a progressão morfológica ao longo da regeneração. D. claparedii foi cuidadosamente removido de seus tubos usando um bastão de ponta romba e imobilizado em cloreto de magnésio a 4% para induzir relaxamento. A amputação anterior foi realizada noquarto quetigre sob estereomicroscópio, e o processo de regeneração foi monitorado nos dias 1, 6, 15, 30 e 60 após a amputação. O procedimento permite indução consistente da regeneração anterior e captura características morfológicas-chave durante o fechamento precoce da ferida, formação do blastema e restabelecimento do segmento. Ao fornecer um fluxo de trabalho reprodutível e referência morfológica para D. claparedii, esse protocolo oferece uma base prática que apoia futuras investigações que visam relacionar observações morfológicas a processos celulares ou moleculares subjacentes na regeneração de aneleídeos.

Introdução

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Poliquetos compõem quase 65% de todas as espécies de anélidos descritas, tornando-os um dos grupos mais diversos de invertebradosmarinhos 1. Uma lista de verificação recente e atualizada de espécies de poliquetas (Annelida) registrou um total de 57 espécies pertencentes a 47 gêneros em 30 famílias das águas costeiras da Malásia, sendo a maioria das espécies (53 espécies) relatadas na MalásiaPeninsular 2. Entre elas, Diopatra claparedii (D. claparedii) Grube, 1878, ou localmente conhecida como ruat sarung, é uma das espécies de poliquetas comercialmente exploradas na Malásia. É encontrada predominantemente ao longo de bancos de lama na costa oeste da Malásia Peninsular, incluindo sítios como Jeram Beach, Selangor 2,3.

D. claparedii pertence à família Onuphidae e é um poliqueto sedentário que vive em tubos, conhecido por sua capacidade de regenerar tanto segmentos anteriores quanto posteriores do corpo. Isso inclui componentes dos sistemas nervoso central eperiférico 4. Seu plano corporal segmentário bem definido e sua acentuada capacidade regenerativa fazem do D. claparedii um modelo invertebrado promissor e fácil de tratar para investigar a regeneração de tecidos em sistemas biológicos relativamente complexos. A escolha de D. claparedii como organismo-modelo para estudos de regeneração se deve à sua relevância ecológica, importância regional e às lacunas atuais no conhecimento científico em torno de sua capacidade regenerativa. Essa espécie é comercialmente capturada e amplamente usada como isca de pesca na Malásia, indicando que é bem conhecida pelas comunidades locais e não consideradarara 2,3. Assim, investigar a regeneração em D. claparedii tem valor prático e econômico, pois as descobertas podem ajudar a disseminar conhecimento científico para os atores locais, ao mesmo tempo em que podem informar estratégias para apoiar a sustentabilidade populacional por meio de uma melhor compreensão dos mecanismos regenerativos.

Além disso, D. claparedii apresenta uma distribuição geográfica específica no Sudeste Asiático, com representação particularmente alta nos ecossistemas costeiros daMalásia 2,3. No entanto, a maioria dos estudos de regeneração com poliquetos e outros anelídeos tem focado em espécies das Américas ou de outras regiões nãoasiáticas 5,6. Por exemplo, a bem estudada Diopatra neapolitana (D. neapolitana), frequentemente usada como espécie biomarcadora regenerativa, possui uma ampla distribuição abrangendo o Mar Vermelho, Oceano Índico, Mar Mediterrâneo e OceanoAtlântico 7. Consequentemente, pesquisas sobre regeneração em anélidos nativos do Sudeste Asiático, incluindo D. claparedii, permanecem limitadas.

Estudos anteriores com poliquetos mostraram estágios distintos e reprodutíveis de regeneração, incluindo fechamento de feridas, formação de blastema e diferenciação segmentarde tecidos 7,8. Embora estudos em nível molecular sobre D. claparedii já tenham sido relatados anteriormente, investigações focadas especificamente na regeneração são escassas. Além disso, trabalhos existentes têm enfatizado em grande parte a caracterização molecular em vez de protocolos experimentais de regeneração. Além disso, D. claparedii apresenta processos tanto de desdiferenciação quanto de rediferenciação, refletindo mecanismos mais comparáveis aos dos organismos superiores9. Essa complexidade na resposta regenerativa destaca o crescente reconhecimento dos poliquetos como modelos intermediários valiosos, efetivamente fazendo a ponte entre invertebrados simples e vertebrados complexos em estudos de regeneração.

O presente estudo aborda essa lacuna estabelecendo e otimizando um protocolo de regeneração para D. claparedii, fornecendo uma estrutura robusta para futuras investigações funcionais, de desenvolvimento e moleculares de regeneração nesta espécie poliqueta de importância regional. Especificamente, esse protocolo oferece uma abordagem confiável para examinar os estágios sequenciais e os mecanismos subjacentes de regeneração em poliquetos. Isso permite a observação sistemática e caracterização de processos regenerativos-chave, incluindo cicatrização de feridas, formação de blastemas e segmentação.

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Protocolo

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Declaração de Ética

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade da Malásia em Terengganu, sob o número de aprovação UMT/JKEPH/2026/173

1. Coleta e Habituação de D. claparedii

  1. Localize D. claparedii na área de lamaçal da zona intertidal estuarina (nível de maré média com areia fina média), que serve como seu habitat natural.
  2. Escave a parte superior dos tubos poliquetos cavando suavemente o sedimento com uma pá para evitar danificar os tubos.
  3. Confirme a presença do verme dentro de cada tubo beliscando suavemente o tubo e verificando se há movimento ou resistência.
  4. Selecione apenas exemplares com comprimento corporal relaxado mínimo de 5 cm.
    NOTA: Escolha poliquetos pelo comprimento do corpo para reduzir danos ao manuseio e evitar fragmentação durante a pesagem.
  5. Colete sedimentos usando uma pá dos mesmos locais para manter a consistência ambiental no laboratório.
  6. Transporte as amostras coletadas para o laboratório em recipientes refrigeradores portáteis em temperatura ambiente. Cubra os tubos com uma toalha umedecida com água do mar para manter a umidade e reduzir o estresse durante o trânsito.
  7. No laboratório, separe manualmente os detritos do sedimento e depois seque o material ao ar sob luz solar direta até que fique completamente seco e livre de umidade residual.
  8. Remova ou limpe quaisquer outros organismos (por exemplo, pequenos caranguejos, conchas ou substâncias estranhas) para garantir que o sedimento esteja livre de contaminantes.
  9. Enxágue os tubos dos poliquetos com água do mar artificial (ASW) para remover detritos e quaisquer organismos vivos presos à superfície.
    NOTA: Para fazer ASW, misture 1/4 de xícara de Sal Marinho Instantâneo em 1,9 L de água purificada desclorada.
  10. Prepare aquários usando aquário plástico, com sedimentos do local original e preencha com ASW artificial ajustado para salinidade de 23-25 ppt (Figura 1). Mantenha a temperatura da água consistentemente em 28 °C durante todo o período de adaptação.
    NOTA: O volume de ASW utilizado foi de 58 L, determinado com base nas dimensões do aquário: 61,5 cm (L) x 32 cm (W) x 33,5 cm (H).
  11. Transfira D. claparedii em recipientes plásticos cilíndricos (7 cm de diâmetro, 15 cm de altura) cheios até metade com sedimento, com uma densidade de um poliqueto por recipiente.
  12. Submerga completamente os recipientes em um aquário com ASW aerado. Permita que os poliquetos se escavem e se reestabeleçam.
  13. Alimente os poliquetos com ração do tipo afundante para peixes com frequência de 2 a 3 vezes por semana, para garantir nutrição contínua durante todo o período de habituação. Remova o excesso de alimentos regularmente para evitar acúmulo, crescimento de fungos e contaminação.
  14. A habituação foi avaliada por meio de observações comportamentais, com exploração ativa (movimento corporal) e comportamento de busca por alimento (resposta a estímulos) indicando retorno à condição fisiológica normal.
    NOTA: Permita um período de adaptação de duas semanas antes de iniciar qualquer procedimento experimental, permitindo que os vermes se recuperem de qualquer estresse ou amputação acidental durante a coleta.

2. Regeneração

  1. Selecione o chaetiger 4 como local padrão de amputação para garantir resultados de regeneração consistentese bem-sucedidos 7,9.
    NOTA: A seleção do local da amputação no4º é baseada em achados preliminares. Use o segmento 10 apenas se necessário, pois ele regenera mais lentamente.
  2. Prepare uma solução anestésica com 4% (peso/volume) de cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl₂·6H₂O) em ASW (4 g MgCl₂·6H₂O em 1 L ASW).
  3. Empurre o poliqueto suavemente para fora do tubo usando um bastão de ponta arredondada inserido na abertura anterior.
    NOTA: Evite danificar o corpo durante a remoção.
  4. Depois, imerga o poliqueto na solução anestésica até que ele fique totalmente relaxado e imobilizado (aproximadamente 15 minutos).
  5. Ampute em chaetiger 4 usando um bisturi esterilizado sob um estereoscópio, garantindo precisão e mínimo dano aos tecidos (Figura 1).
    NOTA: Sempre use equipamentos de proteção individual adequados e tenha cuidado para evitar cortes ao manusear com bisturi.
  6. Devolva a porção posterior do verme ao seu tubo original usando pinças, inserindo primeiro a extremidade anterior para facilitar a reescavação natural.
  7. Após esse procedimento, monitore diariamente os vermes para mudanças comportamentais e condição física, incluindo sinais de infecção, cárie tecidular ou mortalidade.
    NOTA: Indivíduos que apresentaram comportamento anormal, necrose visível ou deterioração progressiva foram considerados inbem-sucedidos na recuperação e foram excluídos de análises adicionais.
  8. Retenha alimento nessa fase até que a regeneração progrida, pois a região da boca está ausente devido à amputação anterior. Retome o comportamento alimentar normal assim que a boca estiver desenvolvida, aproximadamente 60 dias após a amputação (p.a.).
    NOTA: Mantenha as mesmas condições ambientais (faixa de salinidade da água de 23-25 ppt e temperatura da água consistentemente em 28 °C) durante todo o processo de regeneração.
  9. Capture as imagens de poliquetos regenerados com sucesso usando um estereomicroscópio em determinados dias (1, 6, 15, 30 e 60) por ano.
  10. Monitoramento completo da regeneração após as 60 horas do ano.

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Resultados

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O processo de regeneração em D. claparedii foi monitorado continuamente até a regeneração completa da cabeça. O padrão geral de regeneração foi comparável ao relatado para D. neapolitana (Figura 2). O fechamento da ferida no local da amputação foi concluído dentro de 1 dia após a amputação (p.a.). No dia 6 por ano, um blastema claramente definido foi observado em indivíduos sobreviventes, indicando regeneraç...

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Discussão

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Os anélidos, compostos por vermes segmentados que habitam ambientes marinhos, de água doce e terrestres, possuem notáveis habilidades regenerativas em múltiplos níveis de organização biológica. Esses vão desde reparo celular e renovação de células germinativas até o crescimento estrutural e, em alguns casos, regeneração completa do corpo a partir de pequenos fragmentosdo corpo 8,10. O protocolo atual foca na regeneração anterior ...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

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O trabalho de pesquisa foi apoiado pela Bolsa de Pesquisa de Aprimoramento de Talentos e Publicações TAPE (55269), concedida à SZA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Água do Mar ArtificialOceano Instantâneo
Hidrômetro Digital Portátil de SalinidadeScionix
MgCl2· 6H2OSigmaM2670
Scapel
EstereoscópioLeica Microsystem
TeraBits Alimentação Completa para PeixesTetra
Pinça

Referências

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