Este estudo fornece um protocolo passo a passo para o isolamento sequencial de criptas intestinais e células estromais mesenquimatosas intestinais (iMSCs) a partir do tecido jejunal porquino. O método gera monocamadas enteroides 2D e iMSCs adequados para desenvolver modelos reprodutíveis e fisiologicamente relevantes de cocultura epitelial-estromais para investigar a diafonia celular durante a homeostase e regeneração intestinal.
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Artigo de método
Um Isolamento Sequencial Otimizado de Criptas e Células Estromais Mesenquimatosas de Tecido Intestinal Suquino
Neste artigo
Resumo
Resumo
O epitélio intestinal interage de perto com as células estromais mesenquimais intestinais subjacentes (iMSCs) para regular o desenvolvimento, a homeostase e a regeneração. No entanto, métodos padronizados para isolar sequencialmente tanto frações epiteliais quanto estromais do tecido suíno são limitados. Esse protocolo descreve um processo otimizado por etapas para isolar criptas e iMSCs do mesmo segmento jejunal de leitões. O método utiliza um tampão de dissociação baseado em ácido etilenodiaminetetraacético/ditiotreitol (EDTA/DTT) para liberar criptas, seguido pela digestão de colagênase/dispase da matriz extracelular para isolar iMSCs. Essa abordagem minimiza as variações espaciais nas células isoladas. As criptas isoladas foram cultivadas com sucesso e formaram monocamadas enteroides típicas em expansão, bidimensionais (2D), sobre placas revestidas com hidrogel de colágeno. Os iMSCs cultivados aderiram a frascos de cultura e expressaram marcadores estromais como o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) e o cluster de diferenciação 81 (CD81), conforme determinado por imunocoloração. No geral, esse protocolo de isolamento otimizado produz tanto células epiteliais quanto estromais do mesmo segmento jejunal do leitão, fornecendo uma base reprodutível para futuras pesquisas envolvendo organoides intestinais e sistemas de co-cultura iMSC para elucidar mecanismos que controlam as interações epitelial-estromais em porcos, um modelo translacional relevante para replicar a fisiologia humana e avançar nas ciências animais.
Introdução
O epitélio intestinal é um tecido dinâmico que passa por auto-renovação e diferenciação contínuas para manter a homeostase intestinal e facilitar a regeneração após lesõesmucosas 1,2. As células epiteliais intestinais originam-se das células-tronco intestinais (ISCs) e interagem com diversos fatoresmicroambientais 3,4,5,6,7,8. Os compartimentos subepiteliais, principalmente a lâmin....
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Protocolo
Um segmento de 5 cm foi dissecado do jejuno proximal excisado de leitões de 21 dias de vida alojados na instalação suína da Universidade de Maryland, College Park. O procedimento (R-JUN-22-30) usado para sacrificar o leitão seguia diretrizes para políticas de cuidado e uso animal aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da universidade. Antes de prosseguir com as etapas de isolamento, o esboço do protocolo é apresentado na Figura 1, e a lista de reagentes e equipamentos usados para o isolamento sequencial das criptas intestinais suínas e dos iMSCs é fornecida na Tabela de Materi....
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Resultados
Durante a dissociação epitelial, o ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) quela íons cálcio para interromper as aderências célula-célula dependentes de cálcio, enquanto o ditiotreitol (DTT) cliva ligações dissulfeto nas glicoproteínas mucinas para facilitar a mucolise. Assim, o uso combinado de um composto quelante (EDTA) e um agente redutor (DTT) permite a liberação eficaz de criptas da membrana epitelial sem perturbar a estrutura da matriz extracelular (ECM) 2,32
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Discussão
Isolar criptas intestinais e iMSCs do mesmo segmento jejunal suíno oferece uma abordagem inovadora para preservar características celulares e funcionais específicas do segmento de tecido. Isso é crucial porque os tecidos intestinais exibem identidades regionais e espaciais, como demonstrado em estudos suínosanteriores 2,36,37,38. Estudos organoides anteriores e.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro do Programa de Bolsas Competitivas MAES da Universidade de Maryland, College Park, EUA.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5M EDTA | Promega | PR-V4231 | |
| Buffer 1 M HEPES | ThermoFisher | 15630080 | Para preparação de placas de hidrogel de colágeno |
| Pontas de pipeta de 1000 uL | Alkali Scientific FT1000 | 104027-530 | |
| 10x PBS | Invitrogen | AM9624 | Para preparação de placas de hidrogel de colágeno |
| 1N hidróxido de sódio | Termodinâmica | SS266-1 | Para preparação de placas de hidrogel de colágeno |
| 1x HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| 1X PBS | Hyclone | SH30256FS | |
| 4% de paraformaldeído (PFA) | ThermoFisher | AAJ61899AK | |
| Tubos cônicos de 50 mL | ThermoFisher | 12-565-271 | |
| Placas de 6 poços | Fisherbrand | FB012927 | |
| Solução de Bicarbonato de Sódio 7,5% | Corning | MT25035CI | Para preparação de placas de hidrogel de colágeno |
| DMEM Avançado/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa fluor plus 647 | Invitrogen | A32728 | Anticorpo secundário |
| Alexa plus 555 - A32732 | Invitrogen | A32732 | Anticorpo secundário |
| Papel alumínio | Reynolds | https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1 | |
| ANTI-ANTI | Gibco | 15240096 | |
| B27 | ThermoFisher | 12587010 | |
| BSA | Fisherbrand | BP1600-100 | |
| CD81 | Proteinintech | 66866-1-ig | Anticorpo primário |
| Água de Grau Celular | Hyclone | SH30529FS | Para preparação de placas de hidrogel de colágeno |
| Colágeno, Tipo 1 | Corning | 356236 | Para preparação de placas de hidrogel de colágeno |
| Colagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| Placa de Petri de 100 mm de Corning | Corning | 07-202-011 | |
| Mídia de criopreservação de células criostoras | Tecnologias Stemcell | 7930 | |
| criovial para células | Fisherbrand | 1050026 | |
| Diluiente de anticorpos Dako | Dako/Agilent | Número da peça: S302283-2 | Diluente primário de anticorpos |
| Mídia de montagem fluorescente Dako | Dako/Agilent | Número da peça: S302380-2 | |
| DAPI | Promocell/VWR | 10180-470 | Coloração por DNA |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| DMEM, glicose alta | Corning | MT10013CV | |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FBS (HI) | Avantor | 1300-500H | |
| Gastrin | Anaspec | AS-64149 | |
| Gentamicina | MP Biomédicos | ICN1676045 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Microscrrope fluorescente invertido | Nikon | ECLIPSE Ti2 | Imagem fluorescente |
| Microscópio de contraste de fase invertido | Nikon | Eclipse TS100 | Para imagens de células cultivadas |
| Kit Avançado de Síntese de CDNA iScript | Bio-Rad | 1725038 | Kit RT-PCR |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | Kit qPCR |
| Mídia condicional LWRN | ATCC | CRL-3276 | A mídia da LWRN foi preparada internamente de acordo com o procedimento do ATCC |
| N-acetil cisteína | Biografia do MP | 194603 | |
| Espectrofotômetro Nanodrop 2000 | ThermoFisher | ND 2000 | |
| Nicotinamida | Sigma | N0636-100G | |
| Placas ópticas de 384 poços com código de barras | Biossistemas Aplicados | 4483285 | Kit qPCR |
| PDGFRα | Abcam | ab230457 | Anticorpo primário |
| Prostaglandina E2 (PGE2) | Química das Ilhas Cayman & nbsp; | 14010 | |
| QuantStudio 5 | Biossistema Aplicado | A28570 | Instrumento qPCR |
| SB202190 | Laboratórios LC | S-1700 | |
| Microscópio estereoscópico | Nikon | SMZ745 | |
| Frasco T 75 | Fisherbrand | FB012937 | |
| Triton X100 | Fisherbrand | PI85111 | |
| Reagente Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| Pré-adolescente de 20 anos, detergente 100% não iônico | Bio-rad | 1706531 | |
| Y27632 | ApexBio | A3008-200 |
Referências
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
- Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr....
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Reimpressões e permissões
