Um Isolamento Sequencial Otimizado de Criptas e Células Estromais Mesenquimatosas de Tecido Intestinal Suquino

Summary

Este estudo fornece um protocolo passo a passo para o isolamento sequencial de criptas intestinais e células estromais mesenquimatosas intestinais (iMSCs) a partir do tecido jejunal porquino. O método gera monocamadas enteroides 2D e iMSCs adequados para desenvolver modelos reprodutíveis e fisiologicamente relevantes de cocultura epitelial-estromais para investigar a diafonia celular durante a homeostase e regeneração intestinal.

Abstract

O epitélio intestinal interage de perto com as células estromais mesenquimais intestinais subjacentes (iMSCs) para regular o desenvolvimento, a homeostase e a regeneração. No entanto, métodos padronizados para isolar sequencialmente tanto frações epiteliais quanto estromais do tecido suíno são limitados. Esse protocolo descreve um processo otimizado por etapas para isolar criptas e iMSCs do mesmo segmento jejunal de leitões. O método utiliza um tampão de dissociação baseado em ácido etilenodiaminetetraacético/ditiotreitol (EDTA/DTT) para liberar criptas, seguido pela digestão de colagênase/dispase da matriz extracelular para isolar iMSCs. Essa abordagem minimiza as variações espaciais nas células isoladas. As criptas isoladas foram cultivadas com sucesso e formaram monocamadas enteroides típicas em expansão, bidimensionais (2D), sobre placas revestidas com hidrogel de colágeno. Os iMSCs cultivados aderiram a frascos de cultura e expressaram marcadores estromais como o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) e o cluster de diferenciação 81 (CD81), conforme determinado por imunocoloração. No geral, esse protocolo de isolamento otimizado produz tanto células epiteliais quanto estromais do mesmo segmento jejunal do leitão, fornecendo uma base reprodutível para futuras pesquisas envolvendo organoides intestinais e sistemas de co-cultura iMSC para elucidar mecanismos que controlam as interações epitelial-estromais em porcos, um modelo translacional relevante para replicar a fisiologia humana e avançar nas ciências animais.

Introduction

O epitélio intestinal é um tecido dinâmico que passa por auto-renovação e diferenciação contínuas para manter a homeostase intestinal e facilitar a regeneração após lesões^{mucosas 1,2}. As células epiteliais intestinais originam-se das células-tronco intestinais (ISCs) e interagem com diversos fatores^{microambientais} 3,4,5,6,7,8. Os compartimentos subepiteliais, principalmente a lâmina própria e a mucosa muscular, consistem em diversas populações celulares de diferentes^linhagens. Entre essas populações celulares, as células estromais mesenquimais intestinais (iMSCs), incluindo fibroblastos e miofibroblastos, produzem fatores tróficos e de crescimento que modulam a estamina, proliferação e diferenciação dos ISCs para regular a homeostase epitelial^{e a regeneração} 6,7,10,11.

Para estudar essas interações celulares, estudos recentes desenvolveram abordagens inovadoras para desvendar possíveis mecanismos de ação que impulsionam a interferência entre células epiteliais intestinais e iMSC. Sistemas de co-cultura que combinam organoides com células estromais ou imunes avançaram nosso entendimento das interações celulares epiteliais-subepiteliais durante o desenvolvimento, regeneração, triagem de fármacos e modelagem^{de doenças} 12,13,14,15,16,17. No entanto, a maioria dos estudos de cocultura de organoides utilizou tecidos murinos, que frequentemente não conseguem imitar efetivamente a fisiologia humana e os fenótipos de doenças, limitando sua relevância translacional^{clínica 18}.

Na maioria dos protocolos de isolamento intestinal murino, células epiteliais e estromais são obtidas de segmentos de tecido separados, o que pode fornecer amostras que refletem características ligeiramente diferentes, potencialmente afetando a reprodutibilidade nos^{experimentos 19,20}. Atualmente, não existem protocolos padronizados otimizados para isolar criptas intestinais suínas e iMSCs a partir da mesma amostra de tecido. Além disso, limitações práticas na obtenção de amostras intestinais humanas adequadas levaram muitos pesquisadores a confiar em tipos celulares desalinhados de diferentes órgãos (como enteroides humanos com fibroblastos de pele) para avaliar a diafonia celular epitelial-mesenquimatosa, potencialmente confundindo a interpretação dos^dados 21,22,23.

Embora um protocolo de biópsia intestinal humana recentemente publicado tenha isolado criptas e obtido fibroblastos por crescimento a partir do tecido remanescente com epitélio, abordagens padronizadas comparáveis são ausentes em^{porquinhos 24}. Os porcos são usados como modelo animal adequado para pesquisa translacional devido à sua semelhança anatômica e fisiológica com os humanos 2,18,25,26,27,28,29. Portanto, este método apresenta um protocolo sequencial de isolamento que recupera criptas intestinais e iMSCs do mesmo segmento jejunal suíno com base na estrutura fisiológica, anatômica e morfológica do^{intestino 4,30}. O procedimento fornece uma estrutura reprodutível para isolar tanto criptas quanto iMSCs adequada para futuros estudos de cocultura intestinal suína.

Protocol

Um segmento de 5 cm foi dissecado do jejuno proximal excisado de leitões de 21 dias de vida alojados na instalação suína da Universidade de Maryland, College Park. O procedimento (R-JUN-22-30) usado para sacrificar o leitão seguia diretrizes para políticas de cuidado e uso animal aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da universidade. Antes de prosseguir com as etapas de isolamento, o esboço do protocolo é apresentado na Figura 1, e a lista de reagentes e equipamentos usados para o isolamento sequencial das criptas intestinais suínas e dos iMSCs é fornecida na Tabela de Materiais.

1. Estágio de preparação pré-isolamento

1. Prepare 30 mL de tampão de lavagem por segmento de tecido de 5 cm em tubos cônicos de 50 mL.
2. Ajuste o volume com base no número de amostras de tecido coletadas.
   NOTA: Verifique a Tabela 1 para a composição do buffer de lavagem. Todas as etapas de preparação do tecido e isolamento celular são feitas em uma bancada.

2. Estágio de preparação do tecido intestinal

1. Coloque o tecido intestinal excisado nos 30 mL de tampão de lavagem em tubos cônicos de 50 mL.
   NOTA: Os tecidos excisados podem ser colocados em um buffer de lavagem fria por uma hora antes do uso.
2. Lave o tecido 3× com um tampão gelado usando uma seringa de 21 G para remover o conteúdo luminal.
3. Coloque o tecido sobre uma superfície de espuma de poliestireno esterilizada e remova cuidadosamente o tecido mesentérico e adiposo da serosa.
4. Disseca o tecido longitudinalmente usando uma lâmina cirúrgica para abrir o lúmen (Figura 2A).
5. Transfira o tecido dissecado parcialmente limpo para um tampão de lavagem novo e lave duas vezes, ou até que o tampão fique limpo.
6. Coloque o papel no tampão de lavagem em uma placa de Petri de 100 mm e corte em pedaços de 10 a 15 mm usando uma nova lâmina cirúrgica (Figuras 2B,C). Essa etapa aumenta a área de superfície exposta ao buffer de digestão.
7. Transfira o tecido picado para um novo tubo cônico de 50 mL.
8. Lave suavemente com o buffer de lavagem e deixe o papel picado se depositar por gravidade por aproximadamente 30 s (Figura 2D).
9. Aspire suavemente o sobrenadante, deixando apenas o suficiente de tampão para cobrir as partes do tecido no tubo cônico.
10. Estágio de dissociação epitelial
    1. Adicione 30 mL de tampão de dissociação epitelial pré-aquecido (Tabela 2) e incube por 20-30 minutos a 37 °C em um banho de esferas estáticas ou banho-maria agitada a aproximadamente 9 × g.
    2. Agite suavemente o tubo a cada 15 minutos para aumentar a liberação das criptas da membrana epitelial.
    3. Deixe o tecido se acomodar e aspire suavemente o sobrenadante com uma pipeta sorológica, deixando apenas o suficiente para cobrir o tecido depositado no tubo cônico.
    4. Adicione 30 mL de tampão de lavagem fresca ao tecido sedimentado e agite vigorosamente para liberar as vilosidades, criptas e detritos (Figura 3A). Deixe os restos de tecido se assentarem e, em seguida, decante suavemente o sobrenadante do tampão de lavagem, que contém os segmentos de cripta suspensos, através de um filtro celular de 100 μm em um novo tubo cônico de 50 mL.
       1. Repita o processo de adicionar um novo tampão de lavagem ao tecido remanescente e decantar três vezes (3×). Pipete 10 μL de buffer de lavagem contendo as criptas em uma placa de Petri de 100 mm e examine a densidade da cripta sob um microscópio estereoscópico.
          NOTA: Mantenha cada buffer de lavagem contendo criptas após cada lavagem.
    5. Após a terceira lavagem, o tampão de lavagem contendo as criptas deve estar limpo com detritos mínimos (Figura 3B).
       NOTA: Mantenha os remanescentes de tecido com a matriz extracelular (ECM) no tubo cônico para o processamento subsequente de isolamento do iMSC.
    6. Centrifuge a suspensão da cripta a 150 × g por 2 minutos em temperatura ambiente para pelletar os fragmentos da cripta.
    7. Aspire e resuspenda a pastilha cripta em meio de cultura epitelial.
    8. Centrifuge novamente as criptas ressuspensas a 150 × g por 2 minutos para coletar o fragmento da cápsula.
    9. Adicione meio de cultura epitelial para ressuspender as criptas e pipete 5× usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL.
    10. Semear aproximadamente 100 criptas ressuspensas em placas pré-preparadas de colágeno tipo 1 revestidas com hidrogel de 6 poços para cultivar e expandir as criptas em monocamadas enteroides bidimensionais (2D).
        NOTA: Verifique a preparação em placa revestida com hidrogel de colágeno na Tabela 3. A concentração final de colágeno tipo 1 deve ser de 1,0 mg/mL. Evite revestir criptas excessivamente densas ou fragmentos de detritos para evitar contaminação por leveduras ou fungos. Antibiótico-antimicótico (anti-anti-anti) no buffer de lavagem e no meio de cultura deve fornecer proteção.
    11. Examine as células sob um microscópio de contraste de fase invertido antes de incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de_CO2 .
    12. Substitua o meio de cultivo em até 12 horas após a semeadura para remover detritos flutuantes e reduzir a contaminação bacteriana.
    13. Cultive os enteroides usando meio de cultivo epitelial (Tabela 4) e substitua o meio dia sim, dia não, até cerca do dia 8, quando as monocamadas 2D expandidas atingem ≥85% de confluência para subculturação.
11. Estágio de dissociação da matriz extracelular
    NOTA: Continue o processo de isolamento com os fragmentos de tecido remanescentes que contêm a matriz extracelular no tubo cônico (Figura 3C e Figura 4A).
    NOTA: Embora o EDTA no tampão de dissociação epitelial possa inibir a atividade da colagênase, as três etapas anteriores de lavagem removem todo o EDTA e DTT. Assim, a atividade da colagenase não deve ser afetada no processo subsequente.
    1. Triturar novamente o tecido restante em pequenos pedaços antes de isolar os iMSCs na lâmina própria.
    2. Adicione 25 mL de buffer de digestão extracelular (Tabela 5) ao tecido e incube em um banho estático de esferas por 15-20 minutos a 37 °C (Figura 4B).
    3. Agite vigorosamente após a incubação.
       NOTA: O sobrenadante ficará turvo com menos fragmentos de tecido flutuantes. Pipete 10 μL do sobrenadante sob um microscópio invertido para examinar a densidade dos iMSCs no sobrenadante. Continue incubando o tecido no banho de contas por mais 15 minutos se a densidade observada de iMSC for baixa.
    4. Decante suavemente o sobrenadante (imediatamente após uma agitação vigorosa no passo 2.2.3) através de um filtro de célula de 100 μm para um novo tubo cônico para minimizar os detritos.
    5. Centrifuge a suspensão da célula a 280 × g por 5 minutos em temperatura ambiente para pelletar os iMSCs.
    6. Aspire o sobrenadante e resuspenda os iMSCs em meio de cultura mesenquimata (veja mídia de cultura iMSC na Tabela 6).
    7. Centrifuge novamente os iMSCs ressuspensos a 280 × g por 5 minutos para lavar o buffer de dissociação.
    8. Aspire e resuspenda os iMSCs em meio de cultura mesenquimatosa.
    9. Placar os iMSCs em um frasco de cultura T75 aproximadamente 5 × 10⁵ células por frasco.
       NOTA: Certifique-se de que as células placadas cubram aproximadamente 60% da área da superfície do frasco, pois as células mesenquimatosas requerem densidade de semeadura moderada a alta para crescimento ideal.
    10. Substitua o meio de cultivo em até 12 horas após a colocação para remover o excesso de detritos e evitar contaminação bacteriana.
    11. Examine células semelhantes a fibroblastos sob um microscópio de contraste de fase invertido no segundo dia após a semeadura.
        NOTA: Troque o meio de cultura mesenquimatosa dia sim, dia não. Os iMSCs devem atingir aproximadamente 85% de confluência e estarem prontos para subcultura até o quarto dia.

3. Ensaio imunocitoquímico

1. Cultive aproximadamente 5.000 iMSCs por poço em uma placa de 96 poços com meio de cultura mesenquimatosa por 2-3 dias até que as células atinjam aproximadamente 80% de confluência.
2. Aspire suavemente o meio e enxágue os iMSCs cultivados duas vezes com 100 μL de 1× PBS/poço à temperatura^{ambiente 31}. Todas as referências aos kits de imunocoloração são fornecidas na Tabela de Materiais.
3. Adicione 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% por poço para fixar os iMSCs cultivados e incube em uma bancada estática em temperatura ambiente por 30 minutos.
4. Lave os iMSCs fermentados fixos duas vezes com 100 μL de 0,1% Tween-20/PBS (PBST) por 5 minutos cada, e depois permeabilize com 100 μL de 0,5% Triton X-100/PBS por 30 minutos.
5. Adicione 100 μL de albumina sérica bovina (BSA)/PBST a 5% por poço para bloquear a ligação inespecífica nas células fixas.
   NOTA: Deixe em temperatura ambiente por 1 h antes de lavar duas vezes com 100 μL de PBST por 5 minutos cada.
6. Adicione 100 μL de anticorpos primários diluídos (1:250; ou seja, 1 μL de anticorpo primário em 250 μL de diluiente de anticorpos) a cada poço e incube as células durante a noite a 4 °C. Os principais anticorpos utilizados são PDGFRα e CD81.
   NOTA: Inclua poços de controle negativos adicionando apenas diluiente de anticorpos sem anticorpos primários.
7. No segundo dia, lave os anticorpos primários duas vezes com 100 μL de PBST por 5 minutos cada.
8. Dilua os anticorpos secundários em 1× PBS usando as seguintes razões: Alexa Fluor Plus 555 (1 μL:100 μL), Alexa Fluor Plus 647 (1 μL:100 μL) e DAPI (1 μL:800 μL).
9. Contra-tinga as células com os anticorpos secundários diluídos em temperatura ambiente por 1 hora.
10. Lave as células duas vezes com 1× PBS por 5 minutos cada.
11. Adicione 100 μL de meio de montagem por poço, cubra a placa, envolva com papel alumínio e armazene a 4 °C por até 6 meses até a imagem fluorescente.

4. Isolamento de RNA e ensaio qPCR

1. Extraia o mRNA total de iMSCs cultivados em frascos T75 usando a técnica de separação de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio de ácido.
   NOTA: Determine a concentração e pureza do RNA usando um espectrofotômetro.
2. Transcrever reversamente o mRNA total em cDNA para usar como modelo para o ensaio quantitativo de reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (qRT-PCR) para verificar os gráficos de amplificação do primer selecionado do gene Sus scrofa, GAPDH (forward: ATCCTGGGCTACACTGAGGAC; reverse: AAGTGTCGTTGAGGGCAATG), conforme relatado^{em estudos anteriores 2,28}.

Results

Durante a dissociação epitelial, o ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) quela íons cálcio para interromper as aderências célula-célula dependentes de cálcio, enquanto o ditiotreitol (DTT) cliva ligações dissulfeto nas glicoproteínas mucinas para facilitar a mucolise. Assim, o uso combinado de um composto quelante (EDTA) e um agente redutor (DTT) permite a liberação eficaz de criptas da membrana epitelial sem perturbar a estrutura da matriz extracelular (ECM^{) 2,32}

Discussion

Isolar criptas intestinais e iMSCs do mesmo segmento jejunal suíno oferece uma abordagem inovadora para preservar características celulares e funcionais específicas do segmento de tecido. Isso é crucial porque os tecidos intestinais exibem identidades regionais e espaciais, como demonstrado em estudos suínos^anteriores 2,36,37,38. Estudos organoides anteriores e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5M EDTA	Promega	PR-V4231
Buffer 1 M HEPES	ThermoFisher	15630080	Para preparação de placas de hidrogel de colágeno
Pontas de pipeta de 1000 uL	Alkali Scientific FT1000	104027-530
10x PBS	Invitrogen	AM9624	Para preparação de placas de hidrogel de colágeno
1N hidróxido de sódio	Termodinâmica	SS266-1	Para preparação de placas de hidrogel de colágeno
1x HBSS	ThermoFisher	14025092
1X PBS	Hyclone	SH30256FS
4% de paraformaldeído (PFA)	ThermoFisher	AAJ61899AK
Tubos cônicos de 50 mL	ThermoFisher	12-565-271
Placas de 6 poços	Fisherbrand	FB012927
Solução de Bicarbonato de Sódio 7,5%	Corning	MT25035CI	Para preparação de placas de hidrogel de colágeno
DMEM Avançado/F12	Gibco	12634-010
Alexa fluor plus 647	Invitrogen	A32728	Anticorpo secundário
Alexa plus 555 - A32732	Invitrogen	A32732	Anticorpo secundário
Papel alumínio	Reynolds	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTI-ANTI	Gibco	15240096
B27	ThermoFisher	12587010
BSA	Fisherbrand	BP1600-100
CD81	Proteinintech	66866-1-ig	Anticorpo primário
Água de Grau Celular	Hyclone	SH30529FS	Para preparação de placas de hidrogel de colágeno
Colágeno, Tipo 1	Corning	356236	Para preparação de placas de hidrogel de colágeno
Colagenase IV	Gibco	17104019
Placa de Petri de 100 mm de Corning	Corning	07-202-011
Mídia de criopreservação de células criostoras	Tecnologias Stemcell	7930
criovial para células	Fisherbrand	1050026
Diluiente de anticorpos Dako	Dako/Agilent	Número da peça: S302283-2	Diluente primário de anticorpos
Mídia de montagem fluorescente Dako	Dako/Agilent	Número da peça: S302380-2
DAPI	Promocell/VWR	10180-470	Coloração por DNA
Dispase II	Roche	4942078001
DMEM, glicose alta	Corning	MT10013CV
DTT	Sigma	646563
EGF	Peprotech	315-09
FBS (HI)	Avantor	1300-500H
Gastrin	Anaspec	AS-64149
Gentamicina	MP Biomédicos	ICN1676045
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HEPES	ThermoFisher	15630-080
Microscrrope fluorescente invertido	Nikon	ECLIPSE Ti2	Imagem fluorescente
Microscópio de contraste de fase invertido	Nikon	Eclipse TS100	Para imagens de células cultivadas
Kit Avançado de Síntese de CDNA iScript	Bio-Rad	1725038	Kit RT-PCR
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122	Kit qPCR
Mídia condicional LWRN	ATCC	CRL-3276	A mídia da LWRN foi preparada internamente de acordo com o procedimento do ATCC
N-acetil cisteína	Biografia do MP	194603
Espectrofotômetro Nanodrop 2000	ThermoFisher	ND 2000
Nicotinamida	Sigma	N0636-100G
Placas ópticas de 384 poços com código de barras	Biossistemas Aplicados	4483285	Kit qPCR
PDGFRα	Abcam	ab230457	Anticorpo primário
Prostaglandina E2 (PGE2)	Química das Ilhas Cayman & nbsp;	14010
QuantStudio 5	Biossistema Aplicado	A28570	Instrumento qPCR
SB202190	Laboratórios LC	S-1700
Microscópio estereoscópico	Nikon	SMZ745
Frasco T 75	Fisherbrand	FB012937
Triton X100	Fisherbrand	PI85111
Reagente Trizol	Invitrogen	15596026
Pré-adolescente de 20 anos, detergente 100% não iônico	Bio-rad	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200