EasyFiji: Uma interface gráfica para processamento de imagens de fluorescência amigável no Fiji

Chen Li; Aaron Taylor

doi:10.3791/69441

Method Article

EasyFiji: Uma interface gráfica para processamento de imagens de fluorescência amigável no Fiji

DOI:

10.3791/69441

⸱

February 20th, 2026

Chen Li¹ , Aaron Taylor²

¹Center for Bioimage Informatics, St. Jude Children's Research Hospital, ²Cell and Tissue Imaging Center, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EasyFiji é um plugin de interface gráfica para Fiji (ImageJ) que oferece um conjunto selecionado de ferramentas de visualização e processamento de imagens de fluorescência, frequentemente utilizadas por cientistas da vida.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) é um pacote extenso e extensível de processamento de imagens de código aberto, amplamente utilizado pela comunidade de análise de bioimagens. No entanto, para cientistas da vida não computacionais, interagir manualmente com as muitas capacidades de Fiji exige aprender e navegar por um sistema de menus profundamente complexo. Além disso, alguns comportamentos padrão de comandos não são ideais para exibição e processamento de imagens por fluorescência. Para aumentar a eficiência dos cientistas da vida que trabalham com imagens de microscopia de fluorescência, desenvolvemos o EasyFiji, um plugin de interface gráfica (GUI) curado para Fiji. Cada comando EasyFiji é executado por meio de botões e controles deslizantes aprimorados por tooltip e sempre apresenta execução específica do canal, conforme necessário para imagens de fluorescência. Comandos que alteram intensidades de pixels também são impossíveis de fazer com um único clique para permitir um processamento mais interativo e podem ser automaticamente gravados e salvos como texto para registro. Um painel de informações de imagem exibe configurações cruciais para a interpretação da imagem. Novas funções de renderização de imagem e correção de descoloração também são fornecidas. O plugin está disponível gratuitamente no GitHub e como um site de atualização de Fiji. Este protocolo descreve os passos para usar a interface do EasyFiji para visualização e processamento de imagens de microscopia de fluorescência.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) é um pacote extenso e extensível de processamento de imagens de código aberto, amplamente utilizado pela comunidade de análise de bioimagem ^1,2. A grande base de código de algoritmos de uso geral das Fiji, juntamente com sua linguagem macro e interface de plugins, pode ser convenientemente utilizada por analistas computacionais para fornecer uma solução para quase qualquer problema de processamento ou análise de imagens. No entanto, para usuários de ciências da vida com pouca experiência computacional, os >1.100 comandos do FIJI distribuídos por um menu suspenso profundamente complexo podem ser assustadoramente complexos de navegar e utilizar de forma eficaz. Várias abordagens foram adotadas para simplificar o uso manual de Fiji. A barra de busca de Fiji é uma alternativa à navegação por menus, oferecendo acesso a excelente documentação de ajuda, mas somente se o usuário souber o nome do algoritmo que precisa. Os botões da barra de ferramentas de Fiji podem ser personalizados para fornecer acesso rápido a comandos definidos pelo usuário, mas esse procedimento exige a escrita de um código macro e a previsão de quais comandos serão mais úteis. O plugin ActionBar oferece uma janela de interface gráfica (GUI) independente com arranjos de botões personalizáveis e organizáveis, mas, novamente, código e experiência são necessários para preencher os botões^{efetivamente 3}. Nenhuma dessas soluções atende às necessidades de cientistas da vida com pouca experiência em processamento de imagens.

Além das questões de interface do usuário, muitos cientistas da vida que trabalham com imagens de microscopia de fluorescência exigem procedimentos específicos de exibição e processamento por canal. No entanto, alguns comandos Fiji comumente utilizados não são conscientes de canal por padrão. Por exemplo, os usuários podem querer renderizar canais pseudo-coloridos juntos de forma igualmente relevante, ou para destacar especificamente regiões de intensidade semelhante entre canais, ou para preservar o contraste em tons de cinza de um sinal morfológico enquanto também exibem fluorescência. Em cada um desses casos de uso, a técnica de renderização composta RGB de Fiji obscurece a informação desejada no nível perceptual. Ao processar imagens multicanais, filtros nativos de imagem Fiji (ou seja, Process | Filtros), ou processam apenas o plano de bits 2D ativo ou então todos os planos de bits na janela da imagem (ou seja, a 'pilha' conforme definido pela classe ImageStack). O primeiro comportamento falha em processar através da dimensão z ou t para um dado canal, enquanto o segundo comportamento é quase invariavelmente impróprio, já que cada canal contém um padrão de coloração e uma relação sinal-ruído únicos, exigindo o uso de parâmetros de processamento específicos do canal. Comandos de correção de descoloração do Native Fiji (Imagem | Ajustar | Correção de Bleach (Correção de Bleach Correction) atuam incorretamente quando aplicados a imagens de fluorescência multicanal, porque, novamente, elas corrigem em todo o ImageStack, onde os dados do canal são intercalados, em vez de corrigirem individualmente na dimensão z ou t dentro de cada canal.

Para abordar essas questões para cientistas da vida que trabalham com imagens de microscopia de fluorescência, desenvolvemos o EasyFiji, um plugin de interface gráfica selecionada e guiada para Fiji. EasyFiji é um conjunto curado de comandos organizados tematicamente que permitem renderização e processamento conscientes do canal. Quatro painéis tabulados, Display, Process, Save e Image Info, cada um contém coleções relacionadas a temas de botões e controles deslizantes aprimorados por tool-tips para execução de comandos. Outras conveniências incluem uma funcionalidade de desfazer para processamento interativo, um gravador de ações simples em texto simples que pode salvar automaticamente ações de modificação de pixels junto com uma imagem, e uma exibição formatada das configurações de aquisição importantes para a interpretação da imagem. O EasyFiji também oferece novas ferramentas de renderização de imagens e correção de descoloração. O EasyFiji não suporta análise quantitativa de imagens nem funções de processamento em lote, pois esses procedimentos devem ser realizados apenas com a ajuda de um analista especialista em bioimagem. Embora o EasyFiji seja conciso por design, todos os comandos nativos em Fiji estão sempre disponíveis pelo sistema de menus nativo das Fiji. Acreditamos que^{o design 4} do EasyFiji, direcionado ao público, aumentará o uso de Fiji entre cientistas da vida. Aqui apresentamos o design, implementação e aplicação do EasyFiji para imagens de microscopia de fluorescência. O plugin é fácil de instalar via um site de atualização de Fiji (https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ e https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin), enquanto código open-source pode ser baixado via GitHub; O plugin e o código-fonte estão disponíveis gratuitamente (https://github.com/stjude/EasyFiji).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve como instalar e usar o EasyFiji.

1. Para instalar o EasyFiji...

Baixe a versão mais recente do Fiji (>1.54g) apropriada para o sistema operacional e instale-a em uma pasta à qual o usuário tenha acesso de leitura/gravação (veja a Tabela de Materiais para um link para o site de download de Fiji).
Lançar Fiji e navegar até Ajuda | Atualização... na barra de menu.
Na janela do Atualizador , clique em Gerenciar Sites de Atualização. Selecione EasyFiji na lista e clique em Aplicar e Fechar. O EasyFiji será instalado automaticamente, e o Fiji será atualizado automaticamente com futuras versões do EasyFiji.
Reinicie Fiji. Selecione EasyFiji no menu Fiji Plugins.
NOTA: O EasyFiji é totalmente compatível com muitas versões antigas do Fiji e é principalmente compatível com o ImageJ. Informações detalhadas sobre compatibilidade e dependência podem ser encontradas na página wiki do GitHub do EasyFiji (https://github.com/stjude/EasyFiji) e na página wiki do EasyFiji ImageJ.net (https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start). O feedback pode ser fornecido via página do GitHub ou pelo tópico EasyFiji no fórum Image.sc (https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617) (veja a Tabela de Materiais para links para esses recursos).

2. Uso do painel de exibição do EasyFiji

NOTA: Como mostrado na Figura 1A, o painel de exibição suporta pseudo-coloração de canais de fluorescência usando botões de amostra de cor, controles intuitivos de ajuste de contraste e novas opções para renderizações de imagens multicanal calibradas perceptualmente. Comandos nativos de Fiji para projeção e refatiamento de imagens 3D/4D também estão incluídos. A Tabela 1 documenta a correspondência entre comandos EasyFiji e comandos nativos Fiji.

Defina a cor ou visibilidade de um canal (Painel de Exibição , seção de Cor do Canal ).
1. Selecione o canal desejado usando o controle deslizante de canal da janela da imagem.
2. Pressione um botão de amostra de cor para atribuir uma nova tabela de consulta de cores (LUT).
3. Pressione o botão preto da amostra para desligar a exibição de um canal.
4. Pressione o botão AllChs para exibir todos os canais juntos ao mesmo tempo.
5. Pressione o botão EachCh para exibir cada canal sequencialmente, rolando o controle deslizante do canal na janela da imagem.
Defina o contraste do canal dentro ou entre imagens (Painel de Exibição , seção de Contraste de Canais ).
1. Para alterar o alcance de exibição de um canal (contraste), selecione o canal usando o controle deslizante do canal na parte inferior da janela da imagem.
2. Mova o controle deslizante de ganho de exibição para especificar a intensidade do pixel da imagem (valor mostrado à direita) a ser exibido como o valor mais brilhante na tela.
  NOTA: Usamos o termo ganho de exibição para descrever essa ação porque ele faz com que o canal fique linearmente mais brilhante, análogo ao efeito de alterar o ganho em um detector durante a aquisição da imagem.
3. Pressione o botão de reset de ganho de exibição para exibir a intensidade máxima possível de pixels do canal (determinada pela profundidade de bits) como o valor mais brilhante na tela.
4. Mova o controle deslizante de deslocamento da tela para especificar a intensidade do pixel da imagem (valor mostrado à direita) a ser exibido como o valor mais escuro na tela.
  NOTA: Usamos o termo deslocamento de exibição para descrever essa ação porque ele define o nível de preto da imagem, análogo ao efeito de ajustar o deslocamento em um detector durante a aquisição da imagem.
5. Pressione o botão de reset de deslocamento da tela para definir a intensidade do pixel da imagem de zero para o valor mais escuro na tela.
6. Pressione o botão AutoCh para ajustar automaticamente o ganho e o deslocamento da tela.
7. Pressione o botão AutoAll para ajustar automaticamente o ganho e o deslocamento de exibição para todos os canais.
8. Pressione o botão Propagar para transferir as configurações de ganho e deslocamento de exibição da imagem ativa para todas as outras imagens abertas que contenham o mesmo número de canais.
Crie uma exibição multicanal (Painel de Exibição , seção de Visualizações de Canais ).
1. Para renderizar dois canais de fluorescência juntos como uma imagem colorida, use os botões com prefixo FF (fluorescência com fluorescência). Para renderizar canais(ões) de fluorescência e um canal morfológico em escala de cinza juntos como uma imagem colorida, use o botão com prefixo FG (fluorescência com escala de cinza). As renderizações são criadas em uma nova janela de imagem.
  NOTA: Antes de criar qualquer Visualização de Canal, primeiro ajuste o ganho e o deslocamento de exibição para cada canal de modo que o sinal de interesse cubra a faixa dinâmica da tela (seção 2.2) e então aplique esses ganhos e deslocamentos usando os botões Aplicar Ganho e Deslocamento na aba de Processamento (seção 3.2.3). As renderizações não serão ótimas se os ganhos e deslocamentos não forem ajustados e aplicados.
2. Pressione o botão FFColoc para produzir uma renderização de cor a partir de dois canais de fluorescência que destaca como pixels amarelos, onde a intensidade é semelhante em ambos os canais (dentro de 25%).
  NOTA: Pixels com intensidades diferentes entre canais são renderizados em tons de cinza. Pixels amarelos sugerem uma colocalização baseada em^{correlação 5} quando o sinal de interesse em cada canal abrange a faixa dinâmica da tela.
  ATENÇÃO: A renderização FFColoc destina-se exclusivamente a fins de exploração ou ilustração de dados. Não substitui a quantificação rigorosa da colocalização com a ajuda de um especialista.
3. Pressione o botão FFMerge para produzir uma renderização de cor a partir de dois canais de fluorescência, onde o sinal em cada canal é igualmente perceptível.
  NOTA: Em cada pixel, a luminância é definida de acordo com o sinal com maior intensidade, enquanto o matiz é função da razão das intensidades entre os canais (seguindo os conceitos descritos por Taylor et ^al.6). Veja também a seção de Discussão.
4. Pressione o botão FGMerge para produzir uma renderização de cor a partir dos canais de fluorescência e de um canal em tons de cinza, onde a coloração dos canais de fluorescência é mantida, enquanto o contraste do canal em tons de cinza é mantido.
  NOTA: O canal em escala de cinza é tipicamente uma modalidade não fluorescente contendo informações morfológicas, como CID, contraste de fase ou microscopia eletrônica.
5. Pressione o botão Montagem para dividir os canais em imagens individuais, posicioná-los automaticamente pela tela e sincronizar a visualização.
6. Pressione o botão SyncWins para sincronizar a visualização de várias imagens do mesmo tipo.
Crie visualizações 2D de uma pilha z ou t 3D (Painel de Exibição , seção de Vistas de Pilha ).
NOTA: Cada renderização é exibida em uma nova janela de imagem.
1. Pressione o botão MIP para criar uma projeção de máxima intensidade.
  NOTA: A intensidade em cada local da imagem 2D resultante corresponde à intensidade do pixel mais intenso ao longo da^3ª dimensão da imagem 3D. Esse procedimento pode acentuar o ruído, então pode ser útil suavizar a pilha (veja a aba Processamento ) antes de criar um MIP.
2. Pressione o botão SIP para criar uma projeção de intensidade total.
  NOTA: A intensidade em cada local da imagem 2D resultante corresponde à soma das intensidades ao longo da^3ª dimensão na imagem 3D. Esse procedimento preserva a intensidade total, resultando em uma imagem menos ruidosa do que qualquer fatia isolada.
3. Pressione o botão Ortho para criar um visualizador de fatias ortogonais, que renderiza interativamente os três planos ortogonais de uma pilha 3D (por exemplo, xy, xz, yz) que se cruzam na localização atual do cursor.
4. Aperte o botão Kymo para criar um kymograph.
  NOTA: Um kymograph é uma imagem 2D onde o eixo vertical (y-) corresponde à terceira dimensão de uma pilha (geralmente t-), e o eixo horizontal (x-) corresponde à posição ao longo de uma linha desenhada pelo usuário na pilha de entrada. Quando a^3ª dimensão é o tempo, um quimografo é usado para ilustrar ou quantificar o movimento.
  Esse botão depende do plugin^{KymographBuilder 7} , que vem com Fiji, mas deve ser baixado separadamente se estiver usando o ImageJ.
Defina opções diversas (Painel de Exibição ).
1. Pressione o botão Dup para duplicar a janela de imagem ativa dentro de Fiji. Uma nova janela de imagem vai aparecer.
  NOTA: Desenhe uma região retangular de interesse (ROI) na imagem usando a ferramenta Rectangle ROI da Fiji, e o botão Dup cortará na fronteira do ROI. Especifique os intervalos de canais, z e/ou t- para remodelar a dimensionalidade da imagem duplicada.
2. Pressione o botão ToClip para copiar a imagem ativa exibida na tela para a área de transferência do sistema. Para colar a imagem em outro aplicativo (para preparar slides ou editar fotos), ative o outro aplicativo e selecione colar (Ctrl+V no Windows ou Cmd+V no Mac).
3. Pressione o botão |--hum--| para exibir uma barra de escala na imagem como sobreposição. Desative o botão |--hum--| para remover a barra da balança.

3. Uso do painel do Processo EasyFiji

NOTA: Como mostrado na Figura 1B, a seção de Recursos de Canal do painel de Processo fornece comandos de processamento de imagem baseados em controle deslizante com dicas de ferramenta que podem ser usadas para melhorar a exibição da imagem. O botão Desfazer a Última Última possibilita o processamento interativo. As dimensões da imagem podem ser alteradas usando os botões Modificar Dimensões. A Tabela de Ações é usada para registrar como texto simples comandos de processamento que alteram os valores de intensidade dos pixels da imagem. O log pode então ser salvo automaticamente com a imagem usando o mesmo título (veja o painel de salvamento).

Altere as características espaciais de uma imagem (Painel de Processo , seção Modificar Recursos de Canais ).
NOTA: Todos os comandos se aplicam apenas ao canal ativo, e os resultados são automaticamente exibidos na janela original da imagem. Uma nova janela de imagem não é criada.
1. Mova o controle deslizante Smooth para aplicar um desfoque Gaussiano, reduzindo assim a variação normalmente distribuída de pixel a pixel (~ruído de tiro e ruído de leitura).
  1. Para imagens amostradas ~Nyquist (tamanho xy pixelado de 70-150 nm), comece com valores deslizantes entre 1.0 e 2.0.
  2. Para um determinado tamanho de pixel, aumente o valor do controle deslizante à medida que a relação sinal-ruído (SNR) da imagem diminui.
  3. Dado um SNR, aumente o valor do controle deslizante conforme o tamanho do pixel diminui.
  4. Para pilhas de imagens, aplique um suavizamento 3D, onde o raio z é automaticamente definido para um terço do raio xy, conforme apropriado para dados amostrados por Nyquist.
    NOTA: O valor do controle deslizante corresponde ao desvio padrão de um núcleo Gaussiano medido em pixels.
2. Mova o controle deslizante de Denoise para aplicar um filtro mediano, removendo assim valores extremos (pixels quentes da câmera ou emissões termiônicas PMT).
  NOTA: O valor do slider corresponde ao raio de um kernel de caixa em pixels. Valores entre 0,5 e 1,0 são um bom ponto de partida.
3. Mova o controle deslizante Sharpen para aplicar uma máscara 2D de desnitidez, reduzindo assim o desfoque ou a névoa, como pode ser causado por luz fora de foco. A nitidez também acentua o ruído.
  NOTA: O valor do deslizante corresponde ao desvio padrão de um kernel Gaussiano (em unidades de pixels) usado para definir a escala do desfoque. Para imagens amostradas por ~Nyquist (70-150 nm tamanho xy pixel), valores de controle deslizante entre 2.0 e 4.0 são um bom ponto de partida. O parâmetro de peso é fixo em 0,6.
Alterar intensidades de pixels da imagem (Processo Painel, Modificar as intensidades dos canais seção).
NOTA: Todos os comandos se aplicam apenas ao canal ativo, e os resultados são automaticamente exibidos na janela da imagem. Uma nova janela de imagem não é criada.
1. Mova o controle deslizante Sub.Bkgd. para aplicar o algoritmo 'bola rolante', removendo assim o fundo (ou seja, mudanças de intensidade graduais espacialmente).
  NOTA: O valor do controle deslizante é o raio da bola rolando em pixels, então valores maiores subtraem menos fundo total. O valor depende do conteúdo da imagem, mas geralmente deve ser ≥2x maior do que o tamanho (medido em pixels) das características a serem preservadas. Valores entre 10 e 20 costumam ser um bom ponto de partida.
2. Mova o controle deslizante Gama para melhorar a visualização de sinais mais fracos misturados com sinais mais brilhantes, como pode ser necessário para enfatizar estruturas finas quando misturadas com estruturas grandes.
  NOTA: Após a normalização, o valor de cada pixel é elevado para uma potência (expoente) dada pelo valor do controle deslizante. O valor depende do conteúdo da imagem, mas valores entre 0,6 e 0,8 costumam ser um bom ponto de partida.
  ATENÇÃO: Imagens onde a gama foi aplicada não podem ser usadas para quantificação de intensidade.
3. Pressione o botão Aplicar Ganho e Deslocamento: ToCh ou ToAll para mapear a faixa de exibição da imagem (conforme especificado pelos controles deslizantes de ganho e deslocamento no painel de Display) para toda a faixa de intensidades fornecida pela profundidade de bits da imagem.
  NOTA: Esse processo também é conhecido como aplicação de tabela de consulta (LUTs). O ganho e o deslocamento de exibição devem ser aplicados dessa forma antes de criar Visualizações de Canal no painel de Exibição .
4. Use os botões de Correção de Intensidade para corrigir mudanças artefactuais de intensidade nas dimensões z ou t de imagens 3D, como podem ser causadas por fotobranqueamento, aberrações ou dispersão da luz.
  NOTA: A ação é aplicada apenas ao canal ativo. Correções locais e globais podem ser aplicadas sequencialmente ao mesmo conjunto de dados. Veja a seção Resultados para uma explicação mais detalhada dos métodos subjacentes.
5. Pressione os botões Global para corrigir as perdas graduais de intensidade do sinal que ocorrem em toda a dimensão z ou t, preservando a maioria das mudanças de intensidade impulsionadas biologicamente. Existem duas opções:
  1. Pressione o botão GlobalL para corrigir os z-stacks onde as fatias iniciais podem ser escuras ou pretas, e a perda total de intensidade do primeiro para o último quadro é leve (<50%). O algoritmo modela a perda de intensidade como uma tendência linear e então aplica um fator de correção a cada fatia de modo que a inclinação da linha de ajuste se torne zero.
  2. Pressione o botão GlobalP para corrigir séries temporais onde os primeiros quadros são os mais brilhantes e a perda total de intensidade do primeiro ao último quadro é substancial (50%-95%). O algoritmo modela a perda de intensidade como uma tendência polinomial^{de ordem} 2 e então aplica um fator de correção a cada fatia de modo que a curva de ajuste seja transformada em uma linha com inclinação zero.
6. Pressione o botão Local para corrigir mudanças localizadas e abruptas de intensidade do sinal, preservando as mudanças graduais.
  NOTA: Tais mudanças podem ser causadas pelo branqueamento de alguns planos dentro de um conjunto z maior ou por flutuações de potência de excitação (flicker). O algoritmo modela mudanças de intensidade biologicamente relevantes como um polinômio de quarta ordem e então aplica um fator de correção para garantir que a intensidade mediana de cada referencial seja igual ao valor da curva ajustada.
7. Pressione o botão Equalize para tornar a intensidade mediana do sinal de cada quadro igual, semelhante ao método de correção de branqueamento 'razão simples' de Fiji.
  ATENÇÃO: Equalize pode ser útil para fins de visualização quando todos os outros métodos falham, mas apagará variações biologicamente relevantes na intensidade mediana e, portanto, não pode ser usado em conjunto com a quantificação da intensidade.
Mude a dimensionalidade de uma imagem (Painel de Processo , seção Modificar Dimensões ).
NOTA: Esses comandos se aplicam a todos os canais na janela da imagem e não podem ser revertidos usando o botão Desfazer .
1. Pressione o botão Girar para girar a imagem, como pode ser necessário para alinhar os eixos anatômicos de um embrião ou tecido com a página ou tela.
2. Pressione o botão Recortar para reduzir as dimensões xy da imagem. Procure pela ferramenta de ROI retangular que é selecionada automaticamente e observe o prompt para desenhar um ROI na imagem que será usada para o recorte.
3. Pressione o botão Subconjunto para criar uma nova pilha de imagens a partir de um subconjunto das dimensões não xy da imagem de entrada.
  NOTA: Isso é usado para remover canais e/ou truncar fatias em z ou t.
Registre os comandos de processamento aplicados a uma imagem (Painel de Processos, seção de Ações de Registro).
NOTA: O propósito do Gravador de Ações é registrar automaticamente as ações como texto simples e então salvar a imagem com as ações aplicadas, que alteram os valores de intensidade dos pixels. O log é uma conveniência para que o usuário não precise fazer anotações manualmente ou decifrar as entradas do gravador de macros de Fiji. Comandos que não alteram a intensidade dos pixels não são registrados.
1. Aperte o botão Rec para iniciar a gravação de comandos.
  NOTA: A face do botão marca 'ON' quando o gravador está gravando. Comandos executados e parâmetros associados aparecerão na Tabela de Ações. Comandos que são 'desfeitos' são removidos da tabela.
2. Aperte o botão Clr para limpar a Tabela de Ações.
3. Pressione o botão Salvar para salvar a Tabela de Ações como um arquivo de texto. Se ações aplicadas a múltiplas imagens foram registradas, as ações serão agrupadas de acordo com o título da imagem quando o arquivo de texto for salvo.
  NOTA: Alternativamente, salve uma imagem usando o painel de Salvar (seção 4 abaixo). Marque a caixa Salvar Ações e todas as ações aplicadas à imagem serão automaticamente salvas como um arquivo de texto usando o nome e o caminho do arquivo da imagem.

4. Usando o Painel de Salvamento do EasyFiji

NOTA: Como mostrado na Figura 1C, o painel de Salvar foi projetado para ajudar não especialistas a selecionar o formato correto de arquivo de imagem para o caso de uso pretendido. Quando a caixa de seleção Ações de Salvar está marcada, todas as ações de processamento aplicadas a uma imagem, conforme listadas na Tabela de Ações, são automaticamente salvas junto com a imagem, usando o mesmo nome de arquivo e caminho, exceto com a extensão *.txt. Se múltiplas imagens estiverem abertas e processadas em paralelo, todas as ações realizadas em todas as imagens são exibidas na Tabela de Ações. No entanto, apenas as ações aplicadas à imagem que está sendo salva são salvas junto com essa imagem. O arquivo de texto salvo aparece no sistema de arquivos, mas não abre em Fiji. Se desejado, arquivos de texto podem ser abertos em Fiji arrastando o ícone do arquivo para a barra de ferramentas Fiji.

Salve uma imagem (Painel de Salvamento , seção de Métodos de Salvamento ).
1. Pressione o botão Dados Brutos para salvar a imagem como um arquivo *.tif, onde valores exatos de pixels, estrutura de canal e alguns metadados são preservados. Use essa opção quando o objetivo for quantificar ou analisar ainda mais uma imagem.
2. Pressione o botão Salvar para Apresentação para salvar a imagem conforme exibida atualmente, usando compressão jpeg para fins de envio por e-mail ou uso em uma apresentação de slides.
  ATENÇÃO: Esta opção nunca deve ser usada para criar figuras ou para análise quantitativa.
3. Mova o controle de controle de Nível de Qualidade para definir o nível de compressão jpeg.
  NOTA: Valores maiores correspondem a uma melhor preservação das intensidades e características dos pixels (e tamanho maior do arquivo), mas nunca todas as características são preservadas.
4. Pressione o botão Salvar para Figura para salvar a imagem conforme exibida atualmente em formato png compatível com outros programas gráficos (por exemplo, Photoshop, Illustrator, Publisher ou GIMP). A imagem é salva como exibida na tela, mas canais e metadados não são preservados.
  ATENÇÃO: Essa opção nunca deve ser usada para quantificação.
5. Pressione o botão Salvar como Filme para salvar uma pilha de imagens como um filme em formato mov que reproduz as fatias sequencialmente (z ou t).
  NOTA: Reproduzir arquivos mov em um sistema operacional Windows requer o VLC Media Player de código aberto.

5. Uso do painel de Informações de Imagem do EasyFiji

NOTA: Como mostrado na Figura 1D, o painel de Informações de Imagem exibe configurações de aquisição específicas de fornecedores em texto simples, que são cruciais para a interpretação de imagens. Veja a Tabela 2 para uma lista dos tipos de formatos de imagem confocal atualmente suportados.

Pressione o botão Informação do Canal para carregar as configurações de aquisição .
Consulte a seção de Informações do Canal para configurações específicas de aquisição por canal, incluindo % de potência do laser, comprimento de onda do laser, passa-banda de emissão, ganho e tamanho do orifício estenopeico.
Veja a seção Configuração do Sistema para configurações de imagem ampla, incluindonome do ystem, objetivo, modo de varredura, tempo de permanência e tamanho do voxel.

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Results

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Renderizações pseudo-coloridas de imagens de fluorescência multicanal podem ser usadas para ilustrar as relações espaciais ou de intensidade entre sinais; no entanto, o Fiji nativo oferece apenas uma técnica de renderização composta RGB que inerentemente confunde a coloração e o brilho no nível perceptual. Para ilustrar esse problema, a Figura 2 utiliza uma imagem de dois canais da N-Myc e da RNA Polimerase II (RNAPolII). Na Figura 2A

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Discussion

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Fiji é um software de processamento e análise de imagens de código aberto, amplamente popular entre analistas de imagem. No entanto, sua interface de menu complexa e, às vezes, comportamentos pouco intuitivos em relação à exibição e processamento de imagens de fluorescência apresentam desafios para cientistas da vida não computacionais. A EasyFiji oferece aos cientistas da vida um conjunto selecionado de botões e controles deslizantes organizados tematicamente e aprimorados por tooltips,...

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Disclosures

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Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes nem outros conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos aos membros do St. Jude's Cell and Tissue Imaging Center e do Center for BioImage Informatics pelos comentários sobre o manuscrito. Imagens biológicas foram gentilmente fornecidas por: Figura 2: Melissa Marzahn e Tanja Mittag; Figura 3: Peng Wei e James Morgan; Figura 4A: Aaron Pitre; Figura 4B: Aaron Pitre e Woo Jung Cho; Figura 5A: Helen Chen e Heather Mefford; Figura 5B: Sauradeep Sinha e Giedre Krenciute.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Comments
EasyFiji GitHub Site	Código Aberto	https://github.com/stjude/EasyFiji
Fórum Image.sc EasyFiji	Código Aberto	https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
Site do EasyFiji ImageJ.net	Código Aberto	https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
FIJI Software	Código Aberto	https://imagej.net/software/fiji/downloads
VLC Media Player	Código Aberto	https://www.videolan.org/vlc/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
Mutterer, J. Custom toolbars and mini applications with Action Bar. Figshare. 10 (m9), (2017).
Levet, F., et al. Developing open-source software for bioimage analysis: opportunities and challenges. F1000Res. 10, 302(2021).
Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization-co-occurrence versus correlation. J Cell Sci. 131 (3), (2018).
Taylor, A. B., Ioannou, M. S., Watanabe, T., Hahn, K., Chew, T. L. Perceptually accurate display of two greyscale images as a single colour image. J Microsc. 268 (1), 73-83 (2017).
Mary, H., Brouhard, G. KymographBuilder. , https://imagej.net/plugins/kymograph-builder (2016).
Schanda, J. Colorimetry: understanding the CIE system. , Wiley Interscience. Hoboken. (2007).
Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Res. 9, 1494(2020).
Reid, R. C. Jr, Shapley, R. Brightness induction by local contrast and the spatial dependence of assimilation. Vision Res. 28 (1), 115-132 (1988).
Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: an ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Sci Rep. 8 (1), 15764(2018).
Taylor, A. B., Ioannou, M. S., Aaron, J., Chew, T. L. Model-free quantification and visualization of colocalization in fluorescence images. Cytometry A. 93 (5), 504-516 (2018).

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