Artigo de método

Uma abordagem comparativa para estudos quantitativos de contagem celular em cérebros de mamíferos amplamente diferentes

DOI:

10.3791/69446

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16 de janeiro de 2026

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1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

Neste artigo

Resumo

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As neurociências modernas precisam explorar as diferenças entre muitas espécies, incluindo roedores de laboratório e humanos. No entanto, surgem dificuldades técnicas quando mamíferos de cérebro grande estão envolvidos. Essa abordagem aborda a variação interespécies das populações neuronais em mamíferos amplamente diferentes, produzindo resultados comparáveis a serem mapeados para revelar padrões evolutivos.

Resumo

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A maioria dos estudos neurobiológicos é realizada em roedores de laboratório. Apesar de muitas semelhanças entre cérebros de mamíferos, também existem diferenças importantes, que podem ser enganosas na tradução. Diferenças marcadas entre espécies foram encontradas na plasticidade cerebral, especialmente na neurogênese. Diferentes processos neurogênicos podem ser prevalentes devido a concessões evolutivas, exibindo variação entre estruturas cerebrais e mamíferos e alterando o potencial de plasticidade em espécies divergentes, como camundongos e humanos. Comparar espécies muito diferentes levanta múltiplas questões: estudos comparativos enfrentam dificuldades técnicas quando cérebros de grande porte estão envolvidos; O uso de abordagens experimentais heterogêneas por diferentes laboratórios pode limitar a comparação dos resultados; A heterogeneidade pode estar relacionada a diferentes cursos temporais dos processos neurodesenvolvimentais entre mamíferos, adicionando assim variáveis à comparação.

Para enfrentar essas limitações, foi estabelecida uma abordagem para estudar a variação interespécie de uma população de neurônios corticais imaturos da camada II em mamíferos que diferem amplamente em tamanho cerebral, girencefalia, nicho socioecológico e idade. Apesar de algumas variáveis que não podem ser totalmente padronizadas, é proposto um método que combine a redução da heterogeneidade nos cérebros coletores e o estabelecimento de estruturas anatômicas comuns como pontos de referência para realizar a contagem celular nos níveis cerebrais correspondentes. Os dados obtidos (por exemplo, densidades celulares) podem ser mapeados em árvores filogenéticas para revelar padrões evolutivos e analisados quanto à covariância com características neuroanatômicas (por exemplo, tamanho do cérebro, área da superfície cortical). Essa abordagem demonstrou variação notável no número de neurônios corticais imaturos entre grupos filogenéticos e covariação descoberta com o tamanho do cérebro. O método também pode ser usado para quantificar diferenças entre diferentes estágios de desenvolvimento na mesma espécie e pode ser estendido para outros mamíferos diversos e processos biológicos para mapear resultados comparáveis que permitam uma quantificação mais precisa de diferentes populações celulares em cérebros adultos para apoiar a plasticidade.

Introdução

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A pesquisa em neurociência utiliza principalmente camundongos e ratos endogâmicos para traduzir resultados para humanos. Apesar de muitas semelhanças moleculares, celulares e até anatômicas, também existem diferenças importantes entre espécies, o que pode ser enganoso para a interpretação dos dadospré-clínicos 1,2. Embora sejam necessários estudos comparativos, eles são dificultados por dificuldades técnicas e práticas quando cérebros de grande porte estão envolvidos (por exemplo, de uma média de 0,5 g em camundongos até 1300 g em humanos; Figura 1A). Além disso, abordagens experimentais heterogêneas de diferentes laboratórios podem limitar a comparação dos resultados, especialmente as análises quantitativas, às vezes gerando controvérsias. Este é o caso da plasticidade estrutural cerebral, com especial referência aos processosneurogênicos 3,4,5, um tema de interesse para entender a neuroplasticidade do desenvolvimento e a reparaçãocerebral 6,7.

Descobertas recentes no campo da plasticidade cerebral sugerem fortemente que diferenças substanciais surgiram durante a evolução na ocorrência, taxa e localização anatômica de diferentes tipos de processosneurogênicos 8. Um exemplo é dado pela evidente diminuição da neurogênese impulsionada por células-tronco ocorrendo em mamíferos adultos de cérebro grande em comparação com roedoresde laboratório 5,9,10, provavelmente ligada a diferentes expansões das regiões e funções cerebrais como adaptação a pressõesecológicas 7,8, bem como a diferentes cursos de temponeurodesenvolvimentais 11,12. A taxa de neurogênese parece variar notavelmente entre camundongos e humanos, levantando assim a questão datradução 13.

Por outro lado, um novo tipo de "neurogênese sem divisão" representado por neurônios bloqueados em maturação interrompida (os chamados neurônios imaturos ou dormentes 14,15,16,17,18,19) foi hipotetizado para aumentar de espécies de cérebro pequeno para espécies de cérebro grande 20,21. Curiosamente, a população independente de células-tronco de neurônios imaturos está hospedada no córtex cerebral (um local de cognição de alta ordem nas espécies giroencefálicas22,23) e longe dos sítios neurogênicos canônicos, que estão principalmente ligados à olfação e à navegação espacial, que mantêm grande importância em espécies lisencefálicas 7,8. Essas diferenças entre estruturas cerebrais e espécies de mamíferos vão além do mero interesse comparativo, já que podem ser relevantes na tradução ao alterar o potencial de plasticidade em camundongos e humanos. Por essas razões, é crucial avaliar de forma "comparável" até que ponto as diferenças representam uma variação filogenética entre mamíferos muito diferentes, com especial referência a roedores de laboratório e primatas.

Uma abordagem recentemente estabelecida para estudar a variação interespécies de uma população de neurônios corticais imaturos da camada II (cINs) em mamíferos que diferem amplamente em tamanho cerebral, girencefalia e nichosocioecológico 22,24,25 foi descrita. Esse método baseia-se em três princípios: i) considerar várias espécies de mamíferos (diversas) a serem processadas em paralelo usando os mesmos procedimentos; ii) minimizar variáveis que não podem ser totalmente padronizadas em cérebros muito diferentes (procedimento de fixação, intervalo pós-morte, idade) e abordar a especificidade de espécie dos anticorpos para imunocitoquímica, utilizando características amplamente compartilhadas da população celular em estudo como controles positivos internos; e iii) estabelecer estruturas anatômicas correspondentes como pontos de referência para realizar a contagem celular dos níveis cerebrais correspondentes de diferentes espécies (Figura 1B e Figura 2). Dados obtidos (por exemplo, densidades celulares) contando células identificadas com o marcador bem estabelecido doublecortin (DCX 15,17,26) podem ser mapeados em árvores filogenéticas para revelar padrões evolutivos e analisados quanto à covariância com diferentes parâmetros, como tamanho cerebral, girencefalia e área da superfície cortical.

Figura 1
Figura 1: Processamento de cérebros mamíferos amplamente diferentes para avaliar a distribuição e quantidade de cINs no manto cortical. (A) Mamíferos pertencentes a diferentes espécies e ordens são caracterizados por tamanhos cerebrais e graus de expansão girencefálica e cortical, muito diferentes. Ícones do cérebro reproduzidos com licença BioRender. (B) Seções coronais representativas com coragem azulada com Toluidina cortadas de cérebros de tamanhos muito diferentes e extensão do manto cortical. Seções seriadas coradas histologicamente (criostato, coronal, 40 μm de espessura) são usadas para identificar as principais estruturas neuroanatômicas em cada espécie animal (ver Figura 3); Note as diferenças notáveis no tamanho do cérebro e no perímetro cortical. Os ícones de animais no painel A foram reproduzidos com permissão de La Rosa et al.22. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Por fim, como todos os processos plásticos geralmente passam por redução progressiva com o aumento da idade. 27,28, outra questão na neuroplasticidade comparativa é avaliar os diferentes cursos temporais dessa redução, que podem estar relacionados a diferentes cursos temporais dos processos neurodesenvolvimentais entremamíferos 12,29,30. Na verdade, a existência de espécies de amadurecimento rápido (camundongos) versus de amadurecimento lento (primatas) é outra razão pela qual o sistema modelo mais comum, o camundongo de laboratório, é limitado na resolução de desafios nas ciências biomédicas. O método descrito aqui também pode ser útil para considerar populações celulares em diferentes idades ao longo da vida de cada espécie e, em seguida, comparar as tendências resultantes entre as espécies. Variações filogenéticas na densidade de cIN, assim como diferenças em sua persistência ao longo das idades, foram encontradas entre mamíferos de cérebro pequeno e cérebrogrande 22,28.

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Protocolo

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Todos os procedimentos animais estavam em conformidade com as regulamentações nacionais e institucionais relevantes. Tecidos de camundongos foram obtidos do Instituto de Neurociência Cavalieri Ottolenghi (NICO), Orbassano, Itália, sob autorização do Ministério da Saúde da Itália (RRID: MGI:3696370), cortesia dos Laboratórios Serena Bovetti e Charles. Tecidos nus de rato-toupeira foram coletados na Queen Mary University of London (Reino Unido) imediatamente após a eutanásia, conforme o Anexo 1 da Lei de Procedimentos Científicos para Animais de 1986. Os experimentos com coelhos seguiram a Diretiva 86/609/UE do Conselho das Comunidades Europeias e a legislação italiana (DL.vo 116/92), com aprovação do Ministério da Saúde italiano (autorização 66/99-A). Cérebros de ovelhas e cavalos foram obtidos post-mortem em um matadouro comercial sob a Diretiva 86/609/EEC e supervisão veterinária contínua. Cérebros de cachorro foram fornecidos post-mortem pelos Laboratórios MarshallBio (Lyon, França) com as autorizações necessárias; cérebros de gatos foram coletados post-mortem na Universidade de Pádua durante necrópsias diagnósticas de rotina com consentimento do dono. Todos os procedimentos seguiram a legislação da UE e da Itália. As amostras de chimpanzés foram manuseadas de acordo com os princípios orientadores internacionais do Conselho das Organizações Internacionais de Ciências Médicas (CIOMS) e sob a permissão A5761-01 do Escritório de Bem-Estar de Animais de Laboratório (NIH-OLAW) dos Institutos Nacionais de Saúde (para detalhes sobre cada espécie animal e experimento, veja a Tabela Suplementar 1 e as Referências 22,25).

1. Coletar cérebros

  1. Colete cérebros diretamente ou de outras instituições e bancos de tecidos, mas considere apenas todo o hemisfério. Estabeleceu-se com as instituições o melhor procedimento para extrair cérebros da espécie animal, considerando reduzir os danos ao hemisfério e garantir o intervalo mínimo pós-morte (PMI, veja NOTA abaixo) e a imersão rápida em solução fixadora após a extração.
    NOTA: Dependendo da sensibilidade do anticorpo de interesse, esteja atento ao PMI. Dada a alta sensibilidade da doublecortin (DCX) à degradação, colete amostras com faixa de PMI de 0-1 h (exceto o chimpanzé, que tem até 14 h PMI, o que, no entanto, não causou alteração na qualidade da coloração, Tabela Suplementar 1).
  2. Dada a alta variabilidade da expectativa de vida do animal, pré-determine os grupos etários que serão coletados entre os diferentes mamíferos considerados para o estudo, para obter dados comparáveis.
    1. Para este desenho de estudo e para definir faixas etárias comparáveis, analise informações de dois bancos de dados sobre história e diversidade animal: AnAge, um banco de dados curado sobre envelhecimento e história de vida em animais, e Animal Diversity Web, um banco de dados online de história natural animal, distribuição, classificação e biologia da conservação.
    2. Divida a expectativa de vida animal em quatro estágios (um pré-puberal e três pós-puberal, a saber, "adulto"), começando pela classificação da American Veterinary Medical Association (AVMA) para estágios de vida emcães 31, em que a expectativa de vida foi dividida em seis estágios: filhote, júnior, adulto, maduro, idoso e geriátrico.
    3. Compactando os estágios idoso e idoso, e os estágios adulto e maduro, aplique esta terminologia: pré-puberal, jovem-adulto, meia-idade e idoso/22 anos.

2. Fixação e processamento do tecido cerebral

NOTA: Os procedimentos de fixação podem ser diferentes dependendo do tamanho do cérebro e das preocupações éticas em relação a algumas espécies animais (a maioria dos primatas ou cavalos de cérebro grande não pode ser perfundida e deve ser fixada por imersão na solução fixativa após a extração).

  1. Mantenha o cérebro completamente imerso na solução fixativa (recomendado 4% de paraformaldeído ou 10% de formalina).
    NOTA: O tempo de fixação varia dependendo do tamanho do cérebro (por exemplo, 3 semanas para o cérebro canino; 3 meses para o cérebro equino, Tabela Suplementar 1). Evite tempo baixo/excessivo na solução fixativa para manter a integridade do antígeno de interesse.
  2. Corte o hemisfério cerebral preferido em fatias iguais (1-1,5 cm de espessura) usando uma régua (para realizar um corte reto) e uma faca de esfacada.
  3. Imerga fatias de cérebro em um tampão de fosfato (PB) 0,1 M (28,49 g de fosfato de sódio dibásico e 7,8 g de fosfato de sódio monobásico dissolvido em água destilada, pH 7,4) e mantenha-as sob suave agitação em um shaker por 24 horas. Se necessário (veja NOTA abaixo), descarte a solução e substitua por uma nova solução de PB 0,1 M, pH 7,4 no dia seguinte.
    NOTA: O volume e o número de lavagens em PB 0,1 M variam dependendo do tamanho do cérebro (por exemplo, 30 min para cérebro de camundongo, 3 dias para cérebro de cavalo). Certifique-se de que o cérebro esteja totalmente imerso em PB 0,1 M e que os resíduos de formoló, sangue e tecido não estejam mais presentes para impedir a lavagem.
  4. Crioproteja as fatias mergulhando-as em soluções de sacarose com concentração gradualmente crescente (10%, 20%, até 30%) em PB 0,1 M, pH 7,4, e mantenha-as sob agitação suave em um shaker.
    NOTA: O volume das soluções de sacarose varia dependendo do tamanho do cérebro. Certifique-se de que os cérebros estejam totalmente imersos em soluções de sacarose e que eles afundem completamente antes de movê-los para uma concentração aumentada de sacarose.

3. Corte de crióstato em hemisfério inteiro

  1. Remova meninges das fatias do cérebro usando pinças curvas para evitar problemas durante o corte.
  2. Coloque as fatias em moldes de embutição preenchidos com composto de temperatura de corte ideal (OCT). Se a fatia não preencher o molde de incorporação, corte uma fatia quadrada de Parafilm um pouco maior que a fatia cerebral e adicione o meio OCT ao centro da peça, depois coloque a fatia sobre a OCT.
  3. Congele a fatia por imersão em 300 mL de isopentano líquido resfriado a nitrogênio a -50 °C até que o meio OCT fique totalmente branco. Fatias de cérebro podem ser mantidas a -80 °C para armazenamento a longo prazo até a secção.
  4. Antes de seccionar, mantenha a fatia cerebral a -20 °C por pelo menos 5 horas para permitir que o tecido atinja lenta e homogêneamente a mesma temperatura do criostato.
  5. Corte a fatia em seções coronais em série de 40 μm de espessura usando um criostato, mantendo uma faixa de temperatura interna da câmara de -20 °C a -25 °C.
  6. Colete seções flutuantes em placas de 12 poços e armazene-as em solução crioprotetora (150 mL de glicerol, 150 mL de etilenoglicol, 150 mL de água destilada e 50 mL de tampão F [1,682 g de fosfato de sódio monobásico diidratado e 0,385 g de hidróxido de sódio dissolvido em água destilada, pH 7,4]) (1 mL/poço, ou mais para cobrir completamente as seções no caso de cérebros grandes) a -20 °C até a coloração.
    NOTA: Fatias de hemisfério inteiro variam dependendo do tamanho do cérebro. Cérebros maiores (por exemplo, chimpanzés, cavalos) precisam ser divididos em dois blocos iguais (dorsal e ventral) para serem processados no criostato. Nesse caso, seções flutuantes podem ser coletadas em duas placas de 6 poços. Uma alternativa é seccionar hemisférios de espécies de cérebro grande com um micrótomo deslizante, o que permite blocos de tamanho maior.

Figura 2
Figura 2: Processar cérebros muito diferentes seguindo o mesmo procedimento e lidando com variáveis que não podem ser padronizadas. No método descrito acima, todos os procedimentos que podem ser padronizados são realizados da mesma forma (fixação geral, corte de seções coronais seriadas da mesma espessura em todo o hemisfério, procedimentos imunocitoquímicos gerais, contagem celular). Figura criada com BioRender (https://app.biorender.com/). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Coloração histológica

  1. Escolha cesarianas coronais seriadas (1 de 12). Para obter esse espaçamento, retire todas as seções de um poço da placa de 12 poços. Utilize-as para obter uma representação completa de todo o hemisfério e, como referência, para selecionar seções coronais em diferentes níveis cerebrais comparáveis entre as diferentes espécies estudadas (veja a seção 5). Monte em lâminas gelatinizadas a 1%. Deixe secar por algumas horas.
  2. Prepare as seguintes soluções (150 mL/solução): etanol 50%, 70%, 96%, 100%, Xylol e Toluidine Blue.
  3. Protocolo de coloração: Coloque as lâminas em concentrações crescentes de etanol (50%-100%), 1 minuto cada a 50%-70%, 2 minutos cada a 96%-100% e depois transfira para a solução de xilol por 1 minuto.
  4. Coloque as lâminas na ordem inversa: solução de xilo por 1 minuto e depois concentrações decrescentes de soluções de etanol (100%-50%), 2 minutos cada a 100%-96%, 1 min cada a 70%-50%.
  5. Coloque os slides em 150 mL de H2Odestilado (2 min).
  6. Coloque as lâminas na solução de tinta azul-toluidina (5-10 min). Após essa etapa, as seções manchadas aparecem azul-escuras.
    NOTA: O tempo em que as seções são mantidas nas soluções para coloração histológica pode variar dependendo da espécie. Teste as seções cerebrais da espécie de interesse para definir o protocolo ótimo de coloração.
  7. Enxágue as lâminas em 150 mL de H2Odestilado por 1 min.
  8. Prossiga com a etapa de diferenciação colocando as lâminas em concentrações crescentes de etanol (70%-100%) por 1 min a 70%, 2 min cada a 96%-100%, e depois transfira para a solução de xilol por 1 min 30 s. Durante essas etapas, as seções mudam de um azul escuro para um azul céu.
  9. Certifique-se de que as seções ainda estejam úmidas do último passo de xilo antes de deslizar usando um meio de montagem (se secarem, enxágue-as em solução de xilo por 5 segundos). Depois deixe as lâminas secarem por alguns dias.

5. Seleção dos níveis cerebrais e coloração imunohistoquímica

  1. Usando as seções histologicamente coloridas obtidas na seção 4 como referência, identifique os níveis cerebrais dependendo de características neuroanatômicas específicas: Nível 1 (L1) - da abertura anterior do ventrículo lateral até L2; Nível 2 (L2) - do início anterior da cápsula interna até L3; Nível 3 (L3) - do início anterior da amígdala até L4; Nível 4 (L4) - do fechamento posterior do ventrículo lateral até uma extensão equivalente à da L2 (mesmo número de seções seriadas de 40 μm de espessura; Figura 3).
    NOTA: As referências neuroanatômicas listadas acima têm o objetivo de permitir a comparação dos córtices cerebrais pertencentes a cérebros de tamanhos e girencefalia muito diferentes. Dependendo da região cerebral de interesse, as características anatômicas usadas como referência podem mudar.
  2. Escolha três seções coronais igualmente espaçadas de cada nível cerebral.
    NOTA: O volume de cada buffer usado nos próximos passos varia dependendo do tamanho do cérebro (por exemplo, 0,5 mL/poço para seções de camundongo, 1,5 mL/poço para seções de cavalo). Certifique-se de que as seções flutuantes estejam totalmente cobertas por cada buffer.
  3. Lave as seções três vezes em PBS 0,01 M, pH 7,4, por 5 minutos cada.
  4. Incubar seções em solução bloqueadora de peroxidase endógena (0,6%H 2O2, 1% Triton X-100 em 0,01 M PBS, pH 7,4; 20 min) ou realizar a recuperação de antígeno usando ácido cítrico (10 mM de ácido cítrico em água destilada suplementado com 0,05% Tween 20, pH 6,0), 5 min a 90 °C.
    NOTA: Dependendo do procedimento/tempo de fixação e do antígeno de interesse, pode ser necessária uma coleta de antígeno para obter a coloração ótima (tampão, temperatura, pH e tempo de incubação podem variar dependendo do antígeno de interesse).
  5. Lave as seções novamente em PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 min).
  6. Incubar seções em solução bloqueante (1-5% de albumina sérica bovina (BSA), soro normal, 1-1,5% Triton X-100 em 0,01 M PBS, pH 7,4; 90 min em RT).
  7. Incubar seções com solução primária de anticorpos (1-5% BSA, 2-3% soro normal, 1-1,5% Triton X-100, anticorpo primário em 0,01 M PBS, pH 7,4; 48 h a 4 °C sob agitação suave).
    NOTA: Os anticorpos contra o antígeno de interesse podem fornecer resultados diferentes em termos de qualidade da coloração quando usados em diferentes regiões cerebrais e em diferentesespécies 26. É necessária uma comparação entre um conjunto de anticorpos de diferentes fabricantes para escolher a ferramenta ideal a ser usada nas diferentes espécies consideradas para o estudo (para reduzir a variabilidade entre amostras).
  8. Repita a etapa de lavagem descrita no passo 5.3.
  9. Incubar seções com solução secundária de anticorpos biotinilados (1-5% BSA, 2-3% soro normal, 1-1,5% Triton X-100, anticorpo biotinilado secundário em 0,01 M PBS, pH 7,4; 2 h no RT).
    NOTA: O método do complexo avidina-biotina peroxidase é utilizado para a contagem celular em Neurolucida (ver seção 6), pois fornece um precipitado denso e duradouro, permitindo assim o foco através da espessura da seção durante a contagem. Imunofluorescência e análise confocal também podem ser usadas para realizar imunocoloração dupla/tripla para caracterizar ainda mais as células (para protocolos, veja Ref.22,25,32).
  10. Prepare o complexo avidina-biotina-peroxidase usando o kit disponível.
    NOTA: Prepare a solução do complexo avidina-biotina peroxidase em Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (que fornece pH estável para formação de complexos) pelo menos 1 hora antes do uso, para permitir a formação de complexos.
  11. Lave as seções duas vezes em PBS 0,01 M, pH 7,4 (2 x 5 min) e uma vez em Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (5 min).
    NOTA: Como o complexo avidina-biotina-peroxidase está em solução com Tris-HCl 0,05M, o enxágue com Tris-HCl 0,05 M permite a habituação do tecido à solução.
  12. Incubar seções no complexo avidina-biotina-peroxidase (1 h em RT).
  13. Lave as seções em Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (3 x 5 lavagens min).
  14. Sob uma exaustor, incube seções em solução de coloração 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (H2O2, DAB em Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) até que a coloração ideal seja obtida. Durante essa etapa, as seções mudam de uma cor transparente para uma cor marrom/vermelho bordô.
    NOTA: O tempo para obter a coloração ótima varia dependendo da espécie analisada (por exemplo, para DCX, 2-5 minutos para seções de camundongo, 20-30 minutos para seções de cavalo). Verifique as seções que estão manchando a cada 2 minutos para evitar manchas excessivas.
  15. Lave as seções em PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 min).
  16. Monte as seções em um ferrolho, uma vez seco, cubra com uma cobertura usando um meio de montagem e deixe os slides secarem por alguns dias.

Figura 3
Figura 3: Estabelecimento dos níveis neuroanatômicos cerebrais para o estudo da distribuição e quantidade imatura de neurônios DCX+ no córtex cerebral. Quatro estruturas neuroanatômicas correspondentes (início anterior do ventrículo lateral [nível 1, L1]; início anterior da cápsula interna [L2]; início anterior da amígdala [L3]); fechamento posterior do ventrículo lateral [L4]; indicados por círculos vermelhos) foram considerados como estabelecendo quatro "níveis cerebrais" anteriores a posteriores correspondentes em todos os mamíferos considerados, para estudar o número de cIN dentro do córtex cerebral de forma "comparável". (A) Um exemplo é dado para roedores de laboratório (rato, à esquerda) e primatas (chimpanzé, à direita). Três seções coronais de cada nível cerebral (totalizando 12 seções; pontas de flecha vermelhas) são consideradas para a contagem celular em todo o perímetro da camada II de cada seção coronal (NOTA: todas as seções contêm neocórtex, enquanto apenas algumas delas também conterão paleocórtex). Essa abordagem visa permitir que as análises sejam realizadas em níveis neuroanatômicos correspondentes em cérebros de tamanhos amplamente variados. (B) Um exemplo é dado para a identificação do primeiro nível (L1) em seções histologicamente coloridas de espécies de mamíferos amplamente diferentes. Ícones de cérebro e animais criados com BioRender. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Contagem de células

  1. Abra o software Neurolucida na estação de trabalho e coloque a lâmina sob o microscópio com o objetivo selecionado para contagem celular.
    NOTA: Para contagens de células DCX+, foi usado um objetivo de 20x.
  2. Em baixa ampliação (por exemplo, 4x), desenhe o contorno da camada cortical II usando a ferramenta de linha de contorno livre no menu Traçar do software, para obter o perímetro de comprimento (paleocórtex e neocórtex).
  3. Selecione os símbolos preferidos para contagem de células na barra de ferramentas Marcadores, que estão presentes na parte esquerda da tela. Para essa análise, conte diferencialmente duas células diferentes em cada região de interesse (paleocórtex, neocórtex) dependendo de sua morfologia (correspondente a diferentes estados de maturação: tipo 1, com soma pequeno e formato bipolar, faixa de diâmetro soma de 3-9 μm; tipo 2, com soma maior e arborização dendrítica complexa, faixa de diâmetro soma de 9-18 μm).
    NOTA: Para esta análise, dois símbolos/tipos de células diferentes para cada região de interesse são selecionados na Barra de Ferramentas de Marcadores. Dividir o diâmetro do soma em diferentes faixas é crucial para categorizar meticulosamente as células sem uma morfologia clara, que pode estar em um estado intermediário de maturação. Para evitar supercontagem, as células cortadas na superfície superior da seção são excluídas da análise.
  4. Colete os dados para a análise filogenética de três regiões diferentes: paleocórtex, neocórtex e córtex cerebral (este último obtido adicionando dados do paleocórtex e neocórtex).
  5. Colete em um arquivo de planilha o perímetro da camada cortical dois (mm), que é visível na barra de ferramentas Medições de Contorno do software.
  6. Na mesma planilha, colete o número de células tipo 1 e tipo 2 (visíveis na Barra de Ferramentas de Marcadores) e o número total de células (obtido somando células tipo 1 e tipo 2) em cada região cerebral e nível cerebral considerado (três seções/nível, total de 12 seções/espacímen).
  7. Use esses dados para obter, para cada seção em cada região, a densidade linear de células (número de células/mm) e a porcentagem de células tipo 1 e tipo 2 (número de células tipo 1/tipo 2 dividido pelo número total de células e multiplicado por 100).
  8. Calcule o valor mediano da densidade (usando a função mediana na planilha) das 12 seções consideradas/amostra, para representar graficamente a densidade linear das células. Use a mediana como medida central porque a amostra por grupo é relativamente pequena (4 animais/grupo), e alguns grupos apresentam distribuições assimétricas (a mediana é menos influenciada por valores extremos).
  9. Calcule a porcentagem de células tipo 1 e 2 em cada espécime (usando a fórmula descrita acima) e então obtenha o valor médio dos percentuais entre os quatro espacímens considerados/espécie (usando a função Média na planilha). Subsequentemente, use a densidade celular linear para realizar análises filogenéticas (veja seção 7) e utilize o total de células contadas em cada seção coronal para estimar o número total de neurônios/hemisférios imaturos.
  10. Use a ferramenta de contorno à mão livre no Neurolucida Software para traçar uma linha sobre o diâmetro do soma perpendicular ao seu eixo principal. Ao realizar essa etapa, calcule o comprimento do diâmetro de pelo menos 100 células DCX-positivas (DCX+) selecionadas aleatoriamente de ambos os tipos em cada espécie (25 células/espécime) em cada região cerebral, para obter a faixa de diâmetro do soma das células tipo 1 e tipo 2.

7. Análises filogenéticas: Geração de árvores filogenéticas

  1. Crie uma lista das espécies analisadas no Notepad usando seus nomes científicos e depois faça o upload para o site https://timetree.org/.
    NOTA: Os nomes científicos podem ser verificados usando o site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Exporte o arquivo de árvore obtido clicando no botão para o arquivo Newick .

8. Análises filogenéticas: Integração de dados de contagem na árvore filogenética

  1. Em colunas separadas de uma ficha de dados, liste todas as espécies analisadas e os dados correspondentes a serem correlacionados (neste caso: densidade celular DCX+ do córtex inteiro, densidade celular DCX+ do neocórtex e densidade celular DCX+ do paleocórtex). Se houver múltiplos indivíduos disponíveis por espécie, calcule a média da densidade mediana para os parâmetros selecionados.
  2. Baixe o software do Projeto Mesquite (https://www.mesquiteproject.org/) para fundir a árvore filogenética com os dados de contagem.
    NOTA: Este software exige que o Java já esteja presente no computador.
  3. Abra o arquivo Newick anteriormente salvo pelo Timetree clicando em Abrir Arquivo. Depois, selecione a opção Arquivo Simples Newick/Phylip Treefile . Trate o arquivo como texto e salve como ".nex".
  4. Na nova página que se abre, selecione Táxons&Árvores seguido de Novas Três Janelas, e selecione Com Árvores da Fonte. Na janela pop-up, selecione Árvore Armazenada e pressione OK. Uma nova aba chamada Árvores Importadas será exibida.
  5. Modifique graficamente a árvore filogenética (por exemplo, fonte, tamanho, ramos proporcionais ao comprimento) na seção Display .
  6. Adicione uma nova aba em Mesquite, selecionando Adicionar seguido de Nova Matriz de Caracteres e escolha o número de caracteres (neste estudo, número = 3, que corresponde às três densidades de células DCX+). Trate os caracteres como dados contínuos.
    NOTA: Os caracteres representam os dados a serem correlacionados com a árvore filogenética.
  7. Copie nesta aba recém-criada os dados que serão correlacionados com a árvore filogenética (pt. 6.4) e salve-os.
  8. Na aba Árvores Importadas, selecione Análise:Árvore e Rastrear Histórico de Caracteres para realizar uma análise de Estados Ancestrais Parcimonios .
  9. Salve o arquivo como PDF.

9. Análises filogenéticas: Correlação com tamanho do cérebro e densidades celulares DCX+

  1. Na ficha técnica criada anteriormente, adicione uma coluna com o tamanho do cérebro para cada espécie.
  2. Calcule o logaritmo natural das densidades celulares DCX+ e do tamanho do cérebro.
  3. Inicie o pacote de software estatístico preferido (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) e realize uma regressão linear simples
  4. Baixe os arquivos de resultados e salve os resíduos como novas colunas na folha de dados.
    NOTA: Os resíduos representam o desvio dos pontos de dados em relação à linha de regressão.
  5. Na ficha de dados, selecione a coluna de resíduos e a coluna que contém os nomes das espécies. Depois, vá para inserir e escolha o histograma para exibir graficamente os resíduos.

10. Análises filogenéticas: Extensão neocortical e correlação de densidade celular DCX+ neocortical

  1. Na ficha de dados criada anteriormente, adicione uma coluna com os dados da área superficial da camada neocortical II de cada uma das espécies e calcule os logaritmos naturais.
  2. No software estatístico, realiza-se regressão linear simples usando os valores da área de superfície logarítmica da camada neocortical II como variável X e densidade celular logarítmica do neocórtex DCX+ como variável Y.
  3. Baixe os arquivos obtidos e salve os resíduos em uma nova coluna na ficha de dados, onde o gráfico residual pode ser feito conforme no passo 9.5.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células DCX+ no córtex cerebral de todas as espécies estudadas compartilham consistentemente uma série de características que indicam a existência de uma população bem preservada de neurônios indiferenciados (Figura 4A). Resumidamente, eles: (i) são organizados topograficamente para formar uma monocamada ao longo da camada cortical II; (ii) mostrar os subtipos morfológicos descritos para diferentes estágios de maturação em neurônios imaturos, (a) com grande prevalência de pequenas células...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método descrito aqui fornece dados quantitativos comparáveis quando espécies diversas que diferem amplamente em tamanhos cerebrais e neuroanatomia são consideradas. Pode ser usado para avaliar a consistência das populações celulares em todo o cérebro de mamíferos diversos, bem como para acompanhar seu desenvolvimento em uma única espécie ao longo dos estágios subsequentes, do pós-natal ao envelhecimento. Parte da suposição de que um número relativamente alto de cérebros (hemisférios in...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Matteo Piumatti e Chiara La Rosa por terem contribuído para definir o protocolo aqui relatado para neurônios corticais imaturos. O trabalho foi apoiado pela Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (subsídio RF=2022.0618) para a LB; PRIN2022 (concessão 2022LB4X3N) para LB; Fundação Nacional de Ciência (bolsas EF-2021785, DRL-2219759) e Institutos Nacionais de Saúde (bolsas NS092988, AG067419) para a CCS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10% formolSigma-AldrichHT501128
2-metilbutano Sigma-Aldrich320404Isopentane
3,3′-Diaminobenzidina tetrahidrocloridrato hidratadoSigma-AldrichD5637
4% de paraformaldeídoSigma-Aldrich441244
Albumina Sérica BovinaSigma-AldrichA9647
Ácido cítrico  SigmaC0759
Montagem DPX para histologiaSigma-Aldrich  06522
EtanolMerck1.00983
EtilenoglicolSigma-Aldrich102466
GlicerolSigma-AldrichG7893
Solução de peróxido de hidrogênioSigma-AldrichH1009
Killik - Complexo O.C.T.Bio-óptica  05-9801
Software MesquiteProjeto MesquiteMesquite versão 3.81 (build 955)
Neo-mountSigma-Aldrich1.09016
Tamponado com fosfato (PB)NANAFeito sob medida
Soro salino tamponado com fosfato (PBS)NANAFeito sob medida
Hidróxido de sódioRiedel-de Haen6213
Didihídrico de fosfato de sódioSigma-Aldrich71645
Fosfato de sódio monobásico diidratoSigma-Aldrich71500
SacaroseSigma-AldrichS9378
Azul ToluidinaSigma-Aldrich89640
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Peroxidase (Padrão)Laboratórios VectorPK-6100
Xylol Sigma-Aldrich247642

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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