É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Imunocoloração Integral de Ovários de Camundongos Fetais e Neonatais

289 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/69455

⸱

28 de abril de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para imunomarcagem em montagem completa de ovários de camundongos em desenvolvimento, com aplicações em outros tecidos pequenos.

Resumo

A reserva ovariana consiste nos óvulos disponíveis para a reprodução da fêmea e são encontrados em folículos primordiais, cada um contendo um oócito cercado por várias células de granulosa. Os ovócitos começam como células germinativas primordiais que se formam fora da gônada e migram para o ovário em desenvolvimento durante o desenvolvimento embrionário. Uma vez que chegam ao ovário, tornam-se oogônia e se dividem por mitose, com citocinese incompleta, formando agrupamentos de células interconectadas chamados cistos de células germinativas. Enquanto estão nos cistos, as células entram em meiose e se tornam óócitos. No camundongo, dois dias antes do nascimento, os cistos começam a se desfazer, e cada oócito é embalado em um folículo primordial. Apenas alguns dos óvulos sobrevivem durante esse processo, o restante sofre apoptose. A regulação da degradação do cisto e da formação do folículo primordial é apenas parcialmente compreendida, e identificar as moléculas envolvidas é crucial para entender esse processo. A imunocoloração de montagem inteira de ovários de camundongos em desenvolvimento pode ser usada para determinar a localização de potenciais moléculas reguladoras e para avaliar efeitos na formação de folículos primordiais devido a mutações ou outras alterações moleculares usando marcadores de ovocitos e células somáticas. Os ovários são colhidos de camundongos fetais ou neonatais, fixados em formaldeído e bloqueados. Os ovários são então expostos a anticorpos contra uma proteína de interesse, seguidos por anticorpos secundários conjugados a uma marca fluorescente que detecta os anticorpos primários. Por fim, os ovários são montados e examinados por microscopia confocal. Esse procedimento pode detectar múltiplas proteínas de interesse e pode ser aplicado a outros tecidos pequenos, como testículos de camundongos fetais.

Introdução

A imunocoloração de montagem inteira combinada com imagem confocal é um método poderoso para analisar a expressão proteica e a morfologia celular em tecidos pequenos semseparar 1. Nesse método, os tecidos são primeiro colhidos, fixados e bloqueados, e então expostos a anticorpos contra proteínas de interesse. Os anticorpos são conjugados diretamente aos fluoróforos ou seguidos por marcação com anticorpos secundários conjugados aos fluoróforos que reconhecem os anticorpos primários. O tecido é então incubado com o corante fluorescente 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar os núcleos celulares. Essa etapa é importante para fornecer orientação espacial ao fazer a imagem do tecido. Por fim, o tecido é montado e visualizado por microscopia confocal. Outra técnica utilizada para estudar a morfologia tecidual envolve a incorporação do tecido em parafina, secção e marcação com corantes como hematoxilina e eosina ou com anticorpos. Alternativamente, as seções congeladas podem ser preparadas e imunosteadas. Infelizmente, ambas as técnicas envolvem seccionamento, o que resulta na perda de informações tridimensionais. Embora seções seriadas possam ajudar, a análise é tediosa e envolve visualizar um grande número de seções. Assim, o método de montagem é vantajoso, pois preserva a estrutura tridimensional do tecido que pode ser visualizada usando seccionamento óptico.

O desenvolvimento das células germinativas primordiais (PGCs) em oócitos e a montagem dos oócitos em folículos primordiais são essenciais para a fertilidade feminina. As PGCs se formam extraembrionicamente e devem migrar para o ovário durante o desenvolvimento embrionário. Uma vez que os PGCs chegam ao ovário, começando aproximadamente no dia embrionário (E) 10,5 no camundongo, eles são classificados como oogonia2. Os oogônias sofrem mitose, mas com citocinese incompleta, formando agrupamentos interconectados de células chamadas cistos de célulasgerminativas 3. Oogonia entra em meiose a partir de E 13,5 para se tornar óócitos e progredir pela prófase I até o estágio diploteno. À medida que os oócitos se desenvolvem, os cistos se fragmentam, permitindo que cada ovocíto seja cercado por uma camada de células de granulosa, formando folículos primordiais, cada um contendo um oócito 4 retido por diploteno. Há uma grande perda de óvulos coincidindo com a degradação do cisto, e acredita-se que isso seja importante para o controle de qualidade durante a formação do folículo primordial. O número de oócitos retidos por diploteno nos folículos primordiais compõe a reserva ovariana de oócitos disponíveis para a reprodução e está diretamente relacionado à fertilidade. Se a formação do folículo for interrompida, isso pode levar a uma reserva ovariana menor, limitando a expectativa de vida reprodutiva feminina.

A imunocoloração de montagem inteira foi usada para identificar e analisar a expressão de proteínas durante o desenvolvimento embrionário, fetal e neonatal de oócitos. As moléculas examinadas incluem MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT e STAT3 5,6,7,8,9. Essa técnica também tem sido amplamente utilizada para descobrir como a formação dos folículos primordiais é regulada. Ovários fetais ou neonatais foram cultivados e expostos a moléculas de sinalização ou inibidores. Os ovócitos em ovários cultivados passam pela formação de folículos primordiais semelhantes à 10 in vivo. A cultura de ovários foi usada com sucesso para examinar os hormônios esteroides 6,10,11, KIT8 e PI3Ksinalização 12 durante essa fase do desenvolvimento do ovário. Após a cultura, a imunocoloração de montagem inteira é empregada usando anticorpos contra a helicase DEAD box 4 (DDX4, também conhecida como homólogo de vasa de camundongos (MVH)), uma proteína expressa no citoplasma dos oócitos. Os ovários são então examinados por microscopia confocal para avaliar a formação dos folículos primordiais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos com camundongos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Syracuse (IACUC). O protocolo a seguir é para marcar ovários de camundongos neonatais nos dias pós-natal 1–5 (veja a Figura 1 para o esquema). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Colheita e fixação de ovários

  1. Eutanasie camundongos neonatais C57BL/6 seguindo o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" dos Institutos Nacionais de Saúde e protocolos aprovados pela IACUC. Dissecar ovários em soro salino tamponado com fosfato (PBS).
    NOTA: Para este procedimento, camundongos neonatais foram eutanasiados por decapitação, conforme aprovado em nosso protocolo de animais IACUC. Machos e fêmeas da cepa C57BL/6 podem ser distinguidos em recém-nascidos pela presença de uma pequena mancha escura entre as aberturas anogenitais nos machos. Para dissecar os ovários, primeiro corte no estômago e retire os intestinos. Depois, abra o abdômen com uma incisão na linha média da cauda e faça dois cortes horizontais. Localize os ovários sob cada rim, isole cada ovário e limpe o excesso de tecido.
  2. Coloque os ovários diretamente em 600 μL 5,3% de paraformaldeído (PFA; PFA grau EM 16% diluído em 1x PBS) (fixe) em um tubo de microfuga em temperatura ambiente (RT). Incube os ovários fixos em um nutator durante a noite (O/N) a 4 °C.
    ATENÇÃO: Paraformaldeído é tóxico. Use em uma exaustão ou em áreas bem ventiladas. Use luvas, proteção ocular e roupas de proteção para evitar contato visual com pele. Descarte como resíduos perigosos.
  3. Remova, fixe e lave os ovários duas vezes em 1 mL 0,1% de Triton X-100 em 1x PBS (PT) rapidamente, depois uma vez em 1 mL de PT no nutator por pelo menos 30 minutos em RT. Incube em 1 mL de PT + 5% de BSA (Bloco) por pelo menos 30 minutos em RT no nutator ou armazene a 4 °C por até 2 semanas.

2. Incubação com anticorpos primários e secundários

  1. Incubar com anticorpo primário diluído em 500 μl PT + 5% BSA O/N a 4 °C no nutator. Lave três vezes em 1 mL PT + 1% de BSA, 30 min em RT com nutator.
    NOTA: A diluição depende do anticorpo. Os dados representativos mostrados aqui são rotulados com DDX4 diluído 1:200. Anticorpos contra duas proteínas diferentes podem ser usados ao mesmo tempo, desde que os anticorpos primários sejam produzidos em duas espécies diferentes e um secundário não seja produzido na espécie reconhecida pelo outro secundário (não use anti-camundongo-Alexa 488 e anti-cabra-Alexa 568).
  2. Durante a incubação dos ovários com anticorpo primário, incubar anticorpo secundário diluído com uma pitada de pó embrionário em 500 μL PT + 5% BSA O/N a 4 °C no nutator (coberto com folha de alumínio) para reduzir a ligação inespecífica do anticorpo secundário. Centrifuge o anticorpo secundário a 6000 x g por 30 s para coletar o pó residual no fundo. Certifique-se de não extrair esse resíduo ao transferir para o tubo da amostra.
    NOTA: A diluição depende do anticorpo. Os dados representativos mostrados aqui estão rotulados com anti-coelho para cabras Alexa 488 diluído 1:200.
  3. Incubar com anticorpo secundário fluorescente pré-absorvido (feito no passo 2.2) por 2–4 horas na RT no nutator. Cubra com papel alumínio a partir daí. Lave três vezes em 1 mL de PT + 1% de BSA, por 30 minutos em RT com nutator.

3. Marcar núcleos com DAPI e montar ovários em uma lâmina

  1. Incube em DAPI 1:1000 em PBS por 90 min em RT. Lave uma vez com 1 mL 1x PBS.
  2. Transfira ovários para uma lâmina de microscópio usando uma ponta larga de micropipeta de 200 μL. Remova o excesso de PBS com agulha/seringa. Adicione 3 gotas de substrato de montagem nos ovários.
  3. Aplique suavemente um coverslip sobre os ovários, garantindo que o suporte de fixação se espalhe até as bordas do coverslip. Vede as bordas do slip com esmalte e deixe o esmalte secar, depois guarde a -20 °C.

4. Preparação do pó embrionário

  1. Homogeneize ~ E 12,5–E 14,5 embriões de camundongos em volume mínimo de 1x PBS gelado. Adicione 4 volumes de acetona gelada, misture e incube no gelo por 30 minutos.
    ATENÇÃO: A acetona é inflamável e irritante para olhos e pele. Use em uma exaustão ou em áreas bem ventiladas. Use luvas, proteção ocular e roupas de proteção para evitar contato visual com pele. Descarte como resíduos perigosos.
  2. Centrifuge a 10.000 x g por 10 minutos, remova o sobrenadante e lave o pellet com acetona gelada e centrifuge novamente.
  3. Espalhe o pellet em uma folha de papel filtrante, coloque em uma bandeja plástica e deixe secar o O/N em um exaustor químico. Moa até formar um pó fino, deixe secar completamente ao ar e armazene a -20 °C.

5. Análise da expressão proteica por microscopia confocal

  1. Após marcar a proteína de interesse, visualize-a por microscopia confocal. Para examinar a expressão proteica, normalmente usamos 3–4 animais (6–8 ovários) e tiramos várias imagens de cada ovário.
    NOTA: As imagens descritas na seção de resultados representativos foram obtidas em um microscópio confocal de disco giratório ou em um microscópio confocal de varredura a laser. Os parâmetros utilizados são descritos na seção de resultados representativos e variarão dependendo do microscópio utilizado.

6. Análise da formação e desenvolvimento do folículo primordial por microscopia confocal

  1. Após marcar os ovários para um marcador citoplasmático de oócito, como DDX4, para cada ovário, atribua aleatoriamente duas áreas ou "núcleos" para visualização.
    NOTA: Um núcleo consiste em 4 seções ópticas principais de 212 × 212 μm e cada uma separada por uma profundidade de 15–20 μm. As 4 seções ópticas abrangem tanto o córtex quanto a medula para garantir que todas as regiões do ovário sejam avaliadas. Para cada ovário, haverá 2 núcleos com 4 seções ópticas, totalizando 8 seções (veja a Figura 2).
  2. Após a imagem da seção óptica principal para análise, faça uma pilha Z de 5 imagens acima e 5 imagens abaixo da seção principal, cada uma separada por 1 μm. Para cada seção principal, conte o número total de óócitos na seção
  3. Depois, para cada óócito na seção principal, determine se ele está associado a outro ovocíto ou não, examinando a seção principal e também o conjunto de seções para determinar se os óócitos na seção principal estavam associados a oócitos acima ou abaixo do plano de foco. Por fim, para cada ovócito, determine qual estágio do desenvolvimento do folículo ele está (primordial, primário ou secundário).
    NOTA: Recomenda-se analisar pelo menos 4 animais (8 ovários) para obter dados estatisticamente significativos.

7. Uso de iodeto de propidium como marcador nuclear alternativo

  1. Após o passo 2.3, incubar por 30 minutos em 0,1 mg/ml RNase A (10 μL de 10 mg/ml em 1 mL de PT + 1% de BSA). Remova a RNase A e incube em 10 μg/mL iodeto de propidio (10 μL de 1 mg/mL em 1 mL PT + 1% BSA) por 20 minutos em RT em um nutator. Cubra o tubo com papel alumínio a partir daí.
    ATENÇÃO: O iodeto de propídio é tóxico e mutagenênico. Use em uma exaustão ou em áreas bem ventiladas. Use luvas, proteção ocular e roupas de proteção para evitar contato visual com pele. Descarte como resíduos perigosos.
    NOTA: O Toto-3 também pode ser usado como marcador nuclear.
  2. Remova iodeto de propidio e lave por 30 minutos em 1 mL de PT + 1% de BSA. Pule o passo 3.1 (coloração DAPI).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Os resultados típicos do método de imunocoloração descrito aqui são apresentados. Imagens nas Figuras 3, 4, 5 e 6 foram tiradas em um microscópio confocal de disco giratório usando um objetivo de óleo 40x, NA 1,3, com tempo de exposição entre 100–250 ms e potência do laser entre 0,01 e 0,1%. Na Figura 3, ovários de camundon...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este relatório descreve um método para marcar ovários inteiros fluorescentemente em busca de proteínas de interesse. Esse procedimento tem sido amplamente utilizado para determinar a expressão de proteínas durante a formação do folículo primordial e também para caracterizar mudanças na formação de folículos sob diferentes condições 4,5,6,7,8,9,10,11....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

As imagens foram realizadas no Blatt Imaging Center da Universidade de Syracuse. As imagens da Figura 7 foram obtidas a partir de um Zeiss LSM980 com Airyscan2 suportado pelo NIH S10 OD026946-01A1. Esse trabalho foi apoiado por bolsas R03 HD102016 e R21 HD112756 do NIH (para MEP).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
anti-Human VASA (feito em cabra)R& DAF2030
anti-DDX4/MVH (feito em coelho)Abcamab13840
anti-GCNA1/TRA98 (fabricado em rato)Abcamab82527
Albumina Sérica Bovina (BSA)FisherBP-1600
Slips de capa 22 x 22 #1.5Warner Instruments64-0721
DAPI (pólvora)Sigma AldrichD-9542prepare uma solução de 5 mg/ml em dH2O
Escopo de dissecação
Alexa 568 anti-Cabra do burroInvitrogenA11057
Alexa 488 anti-rato do burroInvitrogenA21202
Alexa 568 anti-Coelho do burroInvitrogenA10042
Alexa 647 anti-Coelho do burroInvitrogenA31573
Alexa 488 anti-rato burroInvitrogenA21208
Prova de etanol 200Pharmco111000200
Tesoura Fina - AfiadaFerramentas Científicas Finas14060-09para trabalho fino removendo ovário e podando tecido excedente
Pinça (Pinça Dumont, Estilo 5)Ciência da Microscopia Eletrônica72705-01 (0209-5-PO)
Alexa 488 anti-Coelho da CabraInvitrogenA11008
Tubos de microcentrífuga 1,5 mLTermo Científica3451PK
Lâminas de microscópioFisherbrand12-550-123
Misturador de nutaçãoLabNetS0500
Paraformaldeído 16%Ciência da Microscopia Eletrônica15710
Placas de Petri 100 x 15 mmFabricação de Bioplastos940-10774
Soro Tamponado com Fosfato 1X(Fisher) S271-1;                   (Sigma) P9541-500G; (Fisher) BP332-500; (Fisher) P285-500800 mL MQ H2O                            80 g NaCl                                        2.0 de KCl                                                14,4 g Na2HPO4                  2,4 g KH2PO4                  Ajuste o pH para 7,4 com HCl; volume final 1 L Depois dilua de 10X para 1X para uso
Suporte para pinosFerramentas Científicas Finas26016-12para segurar a agulha reta dobrada em uma leve curvatura
Ponteiras do filtro de pipetaOneTip(10uL) 1121-3810;                           (20 uL) 1120-1810;                   (200 uL) 1120-8810;         (1000 uL XL) 1122-1830
Pontas de pipetaOneTIp(10 uL) 1111-3800;                   (200 uL) 1111-1800;         (1250 uL) 1112-1820
Pipetas 0,2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Gilson(0,1-2 uL) F144054M;       (2-20 uL) F144056M;     (20-200 uL) F144058M;       (100-1000 uL) F144059M
Iodeto de propidium, 1mg/ml em dH2OInvitrogenP3566
RNase A em póSigma AldrichRG513-50mgprepare uma solução de 10 mg/ml em acetato de sódio 0,1 M (pH 5,2). Aqueça a 100 oC por 15 minutos. Resfrie para RT e ajuste o pH adicionando 0,1 volume de 1 M Tris-Cl (pH 7,4)
Agulha Retaagulha reta curvada para cortar tecido excedente do ovário
Triton X-100Termo CientíficaX100-100ML
Seringa de Tuberculina 28G x 1/2Tyco/Healthcare Kendall Monoject1180128012
VectashieldLabrátorios vetoriaisH-1900
Tesoura WagnerFerramentas Científicas Finas14068-12Para decapitação e cortes maiores
Ponta de pipeta de grande diâmetro 20 ulLabCon1026-965-008-9

Referências

  1. Wong, F. C. K. Whole-mount immunofluorescence staining of early mouse embryos. Methods Mol Biol. 2214, 143-155 (2021).
  2. Monk, M., McLaren, A. X-chromosome activity in foetal germ cells of the mouse. J Embryol Exp Morphol. 63, 75-84 (1981).
  3. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125, 3323-3328 (1998).
  4. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Dev Biol. 234 (2), 339-351 (2001).
  5. Burks, D. M., et al. Molecular analysis of the effects of steroid hormones on mouse meiotic prophase I progression. Reprod Biol Endocrinol. 17 (1), 105(2019).
  6. Chen, Y., Breen, K., Pepling, M. E. Estrogen regulates oocyte cyst breakdown and primordial follicle assembly via multiple pathways in the neonatal mouse ovary. J Endocrinol. 202 (3), 407-417 (2009).
  7. Dutta, S., Mark-Kappeler, C. J., Hoyer, P. B., Pepling, M. E. The steroid hormone environment during primordial follicle formation in perinatal mouse ovaries. Biol Reprod. 91 (3), 68(2014).
  8. Jones, R. L., Pepling, M. E. Kit signaling regulates primordial follicle formation in the neonatal mouse ovary. Dev Biol. 382 (1), 186-197 (2013).
  9. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. E. Expression of STAT3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  10. Chen, Y., Jefferson, W. N., Newbold, R. R., Padilla-Banks, E., Pepling, M. E. Estradiol, progesterone, and genistein inhibit oocyte nest breakdown and primordial follicle assembly. Endocrinology. 148 (8), 3580-3590 (2007).
  11. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  12. Burton, J. J. N., Luke, A. J., Pepling, M. E. Regulation of mouse primordial follicle formation by PI3K signaling. Biol Reprod. 106 (3), 515-525 (2022).
  13. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: An update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  14. Pina, R., et al. Ten approaches that improve immunostaining: advances in immunofluorescence optimization. Int J Mol Sci. 23 (3), 1426(2022).
  15. Yau, C. N., et al. Principles of deep immunohistochemistry for 3D histology. Cell Rep Methods. 3 (5), 100458(2023).
  16. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , Springer-Verlag. (2010).
  17. Ino, H. Antigen retrieval by heating for double-label fluorescent immunohistochemistry with identical species-derived antibodies. J Histochem Cytochem. 52 (9), 1209-1217 (2004).
  18. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  19. Boateng, R., et al. Whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for 3D analysis of the ovarian reserve in mouse. J Vis Exp. (175), e62972(2021).
  20. Folts, L., et al. Oocount: A machine-learning-based approach to mouse ovarian follicle counting and classification. Biol Reprod. 113 (5), 1083-1101 (2025).
  21. Rinaldi, V. D., Bloom, J. C., Schimenti, J. C. Whole-mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries. J Vis Exp. (135), e57593(2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Folículos PrimordiaisCistos de Células GerminativasMarcadores de OócitosMarcadores de Células SomáticasMicroscopia ConfocalOvários Fetais de CamundongosFormação de Folículos

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.