Farmacologia de Rede e Estudo Experimental Celular In Vitro para Explorar o Potencial Terapêutico de Derivados de Tiazolona no Rabdomiossarcoma

Resumo

Apresentamos um estudo que investiga sistematicamente o potencial terapêutico de derivados de tiazolona contra rabdomiossarcoma com base em farmacologia de redes e química computacional, com validação e avaliação realizadas por meio de experimentos celulares in vitro .

Resumo

O rabdomiossarcoma (DR) é um tumor maligno originado de rabdomioblastos, que representa uma séria ameaça à saúde de crianças e adolescentes. Com base no potencial dos derivados de tiazolona em uma variedade de atividades biológicas, este estudo pretende explorar sistematicamente os mecanismos dos derivados de tiazolona no tratamento de DR, combinando farmacologia de rede e experimentos com células in vitro . Por meio da farmacologia da rede, dados de alto rendimento foram integrados para prever os alvos potenciais da tiazolona. Além disso, o software AutoDock Vina foi usado para calcular a energia de ligação do composto e da molécula da proteína alvo, revelando sua via de sinalização relacionada ao RD. Finalmente, experimentos com células in vitro verificaram ainda mais o efeito supressor de tumor dos compostos. A farmacologia de rede foi usada para analisar os alvos dos derivados de tiazolona no tratamento de DR, e 172 genes-alvo foram finalmente obtidos por combinação e desduplicação. Cinco alvos proteicos com baixa energia de ligação foram rastreados por acoplamento entre o composto e a molécula de proteína alvo, PIK3CD, AKT1, GSK3B, HSP90AB1 e ITGB1. Os resultados de experimentos de cultura de células in vitro mostraram que um derivado específico de tiazolona teve um efeito inibitório significativo em linhagens celulares de RD, fornecendo uma base científica para a descoberta de novos alvos e compostos eficazes para o tratamento de RD. Este estudo revelou os mecanismos dos derivados da tiazolona no tratamento da DR por meio de uma combinação de farmacologia em rede e experimentos in vitro e forneceu uma nova perspectiva para o desenvolvimento futuro de medicamentos e estratégias de tratamento.

Introdução

Rabdomiossarcoma (RD), um sarcoma pediátrico de tecidos moles altamente agressivo que representa uma ameaça significativa à saúde pediátrica, com opções terapêuticas limitadas. Estudos epidemiológicos indicam que, embora a DR exiba taxas de incidência relativamente baixas, sua alta malignidade e mau prognóstico apresentam desafios clínicos substanciais. A DR é classificada em quatro subtipos histológicos distintos: embrionária, alveolar, fusiforme/esclerosante e pleomórfica, sendo o rabdomiossarcoma embrionário (ERMS)^{a forma mais} prevalente1,2,3. As estratégias terapêuticas atuais para pacientes com ERMS de baixo risco recém-diagnosticados envolvem principalmente a ressecção cirúrgica de tumores localizados combinados com agentes quimioterápicos, incluindo vincristina, dactinomicina e ciclofosfamida. Pacientes de alto risco geralmente recebem esquemas de quimioterapia multiagentes intensificados incorporando ifosfamida e etoposídeo ^4,5. Embora a abordagem multimodal que combina cirurgia, quimioterapia e radioterapia tenha demonstrado eficácia no controle local do tumor e na erradicação de micrometástases⁵, desafios significativos permanecem. Os perfis substanciais de toxicidade dos agentes quimioterápicos atuais, incluindo neurotoxicidade e danos irreversíveis nos rins e na bexiga6, representam riscos particulares para pacientes pediátricos e adolescentes. Além disso, a heterogeneidade inerente da DR e sua propensão à recaída ressaltam a necessidade crítica de desenvolver agentes terapêuticos mais eficazes e direcionados⁷.

Nesse contexto, a pesquisa aqui se concentra em uma classe de derivados de tiazolona com propriedades farmacológicas distintas. Os derivados da tiazolona exibem atividades anti-inflamatórias, antioxidantes e reguladoras da apoptose⁸, demonstrando ampla atividade biológica e potencial promissor para o desenvolvimento de drogas ^9,10. Simulações de docking molecular de Elgubbi et al. revelaram fortes afinidades de ligação de derivados de tiazolona a alvos-chave, como a anidrase carbônica humana IX (CA IX), uma enzima induzível por hipóxia superexpressa em tumores agressivos, sugerindo um mecanismo para seus efeitos antiproliferativos¹¹. O estudo computacional elucida as interações moleculares entre derivados de tiazolona e proteínas associadas ao câncer. Em 2024, El-Helw et al. relataram que os derivados de tiazolona à base de benzoquinolina exibem atividade potente contra linhagens de células cancerígenas, com tiazoletiona e análogos de tiazol demonstrando a maior eficácia¹². Estudos mecanísticos^10,13 sugerem que esses compostos interrompem a viabilidade das células tumorais por meio de vias duplas: (1) indução de estresse oxidativo por meio da modulação da via antioxidante e (2) inibição direta da proliferação. Esses achados enfatizaram o amplo perfil farmacológico das tiazolonas, incluindo propriedades anti-inflamatórias e antimicrobianas. Notavelmente, compostos como pioglitazona¹⁴ e troglitazona¹⁵ são empregados principalmente no tratamento do diabetes tipo 2¹⁶, enquanto os derivados da 4-tiazolona exibem efeitos antiproliferativos contra células leucêmicas¹⁷ (Figura 1). Esses compostos não apenas demonstram uma promessa terapêutica significativa em estudos clínicos, mas também visam especificamente várias vias de sinalização celular, incluindo a inibição da proliferação de células tumorais, indução de apoptose e regulação do ciclo celular. Os mecanismos anticancerígenos dos derivados da tiazolona envolvem várias vias de sinalização que impedem efetivamente o crescimento e a sobrevivência das células tumorais, modulando vias críticas, como as vias PI3K/Akt e NF-κB. Além disso, os derivados de tiazolona também exibiram efeitos regulatórios no microambiente tumoral, incluindo a inibição da angiogênese e modulação das respostas imunes¹⁸. As ações mecanicistas multifacetadas dos derivados da tiazolona os posicionam como candidatos ideais para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer.

Em pesquisas anteriores, construímos eficientemente derivados de tiazolona com centros quirais adjacentes por meio de uma reação de propargilação assimétrica distal catalisada por cobre. Usando ésteres de propargil e tiazolonas como substratos, a reação foi catalisada por CuI na presença de um ligante de piridina bis(oxazolina) substituído por fenil. Ao otimizar as condições de reação, alcançamos alta eficiência na síntese desses derivados de tiazolona¹⁹. A farmacologia de rede, como uma abordagem de biologia de sistemas, revela interações complexas entre drogas, alvos e vias de doenças, revolucionando a compreensão e o desenvolvimento de terapias para doenças complexas como o câncer²⁰. Este estudo visa preliminarmente revelar o potencial valor terapêutico de novos derivados de tiazolona no tratamento da DR. Por meio de farmacologia de rede integrada e experimentos celulares, serão identificados compostos com atividade superior, que podem exercer efeitos terapêuticos multialvo, regulando coordenadamente cinco alvos principais, incluindo PIK3CD e AKT1, influenciando assim as principais vias de sinalização, como PI3K-Akt. Simulações de docking molecular e dinâmica molecular serão usadas para demonstrar as características de ligação entre o composto e as proteínas-alvo. Além disso, será estabelecido um modelo preliminar de relação estrutura-atividade, fornecendo uma referência para posterior otimização estrutural. Este trabalho não apenas oferece novas moléculas candidatas para o desenvolvimento de medicamentos para rabdomiossarcoma, mas também destaca o papel positivo das estratégias multidisciplinares na exploração de mecanismos terapêuticos multialvo de medicamentos.

Protocolo

Todos os procedimentos de farmacologia da rede foram realizados de acordo com as Diretrizes para Métodos de Avaliação da Farmacologia da Rede²¹. O fluxo de trabalho abrangente de farmacologia de rede adotado neste estudo é ilustrado esquematicamente na Figura 2.

Síntese de derivados de tiazolona
Os derivados de tiazolona neste estudo foram sintetizados em nosso trabalho anterior¹⁹, por meio de uma reação de propargilação assimétrica remota catalisada por cobre. A reação utilizou CuI como catalisador e um ligante quiral Pybox (L1) como núcleo de estereocontrole, em um sistema de base DIPEA e solvente de metanol a -10 °C por 48 h, alcançando alto acoplamento enantiosseletivo entre ésteres de propargílico e tiazolonas. O produto alvo foi obtido com um rendimento de até 89%, uma razão enantiomérica (er) de 97,8:2,2 e uma razão diastereomérica (dr) de 17,8:1. Para obter informações detalhadas sobre os métodos de síntese desta série de compostos, consulte estudos anteriores¹⁹. Este método demonstrou ampla aplicabilidade do substrato, acomodando arila (orto-, meta-, para-substituintes), cadeias alifáticas e ésteres propargílicos de anel fundido, bem como várias tiazolonas substituídas, com rendimentos variando de 51% a 98%. Essa estratégia constrói com eficiência estruturas de tiazolona de centro multiquiral em um processo de uma etapa pela primeira vez, fornecendo uma abordagem altamente seletiva e direta para a síntese de moléculas de drogas quirais com aplicações potenciais significativas na química medicinal.

Predição farmacológica em rede
Previsão do alvo do derivado de tiazolona: As representações estruturais dos derivados de tiazolona foram geradas usando o software KingDraw, e os arquivos estruturais correspondentes foram posteriormente convertidos em SMILES ID por meio do software Open Babel. Para prever potenciais alvos terapêuticos contra RD, empregamos uma abordagem computacional abrangente utilizando três bancos de dados distintos de previsão de alvos: SwissTargetPrediction (http://swisstargetprediction.ch/), TargetNet (http://targetnet.scbdd.com) e SuperPred (https://prediction.charite.de). Para a análise TargetNet, implementamos um critério de filtragem rigoroso selecionando genes com probabilidade > 0. No banco de dados SuperPred, aplicamos parâmetros de seleção mais rigorosos, retendo apenas os genes que apresentam precisão do modelo > 90% e probabilidade > 60%, garantindo previsões de alvos de alta confiança.

Predição de alvos RD: Com base no banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/) e no banco de dados OMIM (https://omim.org/), realizamos uma busca por rabdomiossarcoma. Para os dados provenientes do banco de dados GeneCards, filtramos os resultados com pontuação superior a 20 para obter genes associados ao rabdomiossarcoma.

Construção e análise de redes de interação proteína-proteína (PPI): Os alvos potenciais dos derivados de tiazolona e os genes associados ao RD foram cruzados. Os alvos potenciais para o tratamento do rabdomiossarcoma embrionário humano por derivados de tiazolona foram carregados no banco de dados STRING (https://www.string-db.org/) para análise de relacionamento PPI (interação proteína-proteína) alvo de alta confiança. A rede PPI foi construída no software Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) e os alvos principais foram rastreados com base em valores de grau.

Construção da rede de vias compostas-doenças-alvos: A rede de medicamentos-alvos-vias pode ver claramente os alvos de compostos e doenças e as vias envolvidas nesses alvos, de modo a identificar possíveis alvos-chave e vias para a terapia composta para DR. Primeiro, crie a tabela de rede e a tabela de atributos na planilha. O conteúdo da tabela de rede inclui principalmente a correspondência entre o composto e o alvo principal, a correspondência entre o alvo principal e a via envolvida e a correspondência entre RD e a via principal. O conteúdo da tabela de atributos é principalmente classificar e nomear todas as informações na tabela de rede. Depois disso, abra o software Cytoscape, carregue a netlist para o local de carregamento, defina o ponto inicial, o ponto final, carregue a tabela de atributos e, finalmente, modifique a forma da imagem.

Anotação funcional integrada e análise farmacológica de rede - Enriquecimento de Ontologia de Genes de Construção (GO), Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG): A análise de enriquecimento de GO e KEGG de alvos principais foi realizada pelo banco de dados DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). De acordo com a ordem do valor de P de pequeno a grande, os 10 principais itens em processo biológico (BP), componente celular (CC) e função molecular (MF) em GO foram selecionados para análise, e os 20 principais itens em KEGG foram analisados, e os mapas de bolhas GO e KEGG de alvos principais foram criados com base na plataforma de microbioinformação online.

Acoplamento molecular: As proteínas-alvo principais foram selecionadas do banco de dados PDB (https://www.rcsb.org/) e os arquivos estruturais dos alvos principais foram baixados. Inicialmente, as proteínas foram desidratadas usando o software PyMol, seguido pela separação de ligantes e receptores. Posteriormente, as proteínas foram hidrogenadas usando o software ADFRSuite, e os parâmetros da caixa de grade para o software de docking molecular AutoDock foram obtidos. Os arquivos pdbqt de derivados de tiazolidinona e proteínas-alvo centrais foram preparados usando o software AutoDock Vina. Simulações de docking molecular de derivados de tiazolona e proteínas-alvo centrais foram então conduzidas. Por fim, os modelos de docking molecular foram visualizados usando o software PyMol.

Simulação de dinâmica molecular: O arquivo PDB foi convertido para o formato GRO compatível com GROMACS usando o campo de força amber99sb-ildn e o modelo de água TIP3P:
gmx pdb2gmx -f Pro.pdb -o Pro_temp_H.gro -ff âmbar99sb-ildn -água tip3p -ignh
Uma caixa de limite periódica cúbica foi adicionada com uma distância de 1,2 nm da proteína:
gmx editconf -f Pro_temp_H.gro -o Pro_temp_H_box.gro -c -d 1.2 -bt cúbico
A caixa foi preenchida com moléculas de água TIP3P:
gmx solvate -cp Pro_temp_H_box.gro -o Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top
O sistema foi neutralizado pela adição de íons Na:
gmx grompp -f ions.mdp -c Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top -ions.tpr
gmx genion -s ions.tpr -o Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -neutro
A minimização de energia foi realizada:
gmx grompp -f minim.mdp -c Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -o em.tpr
gmx mdrun -v -deffnm em
O equilíbrio do NVT foi realizado:
gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -o nvt.tpr
gmx mdrun -deffnm nvt -v
O equilíbrio do NPT foi realizado:
gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr
gmx mdrun -deffnm npt -v
A simulação de dinâmica molecular de produção foi iniciada:
gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md_0_1.tpr
gmx mdrun -deffnm md_0_1 -v

Após a conclusão das simulações, as trajetórias resultantes foram analisadas usando Dinâmica Visual Molecular (VMD) e PyMOL, e a análise de energia livre de ligação entre as proteínas e ligantes de pequenas moléculas foi realizada empregando o programa g_mmpbsa.

Avaliação dos efeitos de fármacos na viabilidade das células RD
Células RD (Célula Embrionária de Rabdomiossarcoma; STR Authenticated) na fase de crescimento logarítmico foram tripsinizados para criar uma suspensão celular na concentração de 1 x10⁵ células/mL. Esta suspensão foi então semeada em uma placa de 96 poços a uma densidade de 1 x 10⁴ células/poço (100 μL por poço) e incubada a 37 °C com 5% de CO₂ para permitir a adesão celular. Após a adesão, o meio foi substituído por 100 μL de meio livre de soro contendo 1% de FBS, e as células ficaram sem energia por 12 h. Posteriormente, o meio foi trocado por 100 μL do respectivo meio contendo concentrações variáveis do composto de teste. Os poços de controle foram tratados com meio contendo solvente ou meio normal, e os poços em branco contendo apenas o meio correspondente sem células foram incluídos. As placas foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO₂ por 24 h (a duração foi determinada por experimentos preliminares como ótima para observar o efeito inibitório máximo dessa classe de compostos nas células RD. Ou seja, o tempo necessário para que o valor OD da densidade celular atinja aproximadamente 1,0.). Depois disso, 10 μL de solução de CCK-8 foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas por mais 1-4 h. Finalmente, a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de microplacas. As células tratadas com solvente serviram como grupo de controle e os poços em branco foram usados para correção de linha de base. A viabilidade celular foi calculada com base nas leituras de absorbância.

Taxa de sobrevida% = [(grupo controle-branco)-(grupo experimental-branco)]/(grupo controle-branco) x 100%

Resultados

Neste estudo, 13 derivados de tiazolona (compostos am; Figura 3, Figura 4) foram previamente sintetizadas¹⁹ foram selecionadas para avaliação de sua atividade inibitória contra células cancerígenas (Figura 5). Dentre esses compostos, o composto m a 100 μM apresentou a maior taxa de inibição contra células RD (Embryonal Rhabdomyosarcoma Cell) (STR Authenticated)²². Experimentos subseque...

Discussão

A farmacologia de rede é comumente usada para prever e rastrear moléculas ativas potenciais dentro de componentes complexos da medicina tradicional chinesa e para elucidar os mecanismos sinérgicos de ações multicomponentes, multialvos e multivias em formulações de ervas. Neste estudo, aplicamos uma abordagem de farmacologia de rede para investigar sistematicamente o mecanismo potencial de nosso derivado de tiazolona recém-sintetizado contra RD, construindo uma rede composto-alvo-via-doen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Ensaio CCK-8	Beyotime Biotechnology Co., Ltd.	C0038	Um kit usado para medir a viabilidade e proliferação celular com base na redução de um sal de tetrazólio solúvel em água para formar um produto colorido.
Supino limpo	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd	SW-CJ-1FD	Uma estação de trabalho de fluxo de ar laminar que oferece um ambiente estéril para manuseio de culturas celulares e outros materiais sensíveis.
Incubadora CO2	Força de cura	HF90	Um ambiente controlado por temperatura, umidade e CO2 é utilizado para a cultura celular, a fim de manter condições ideais de crescimento.
DMEM Glicose Alta	Cytiva	SH30022.01	Um meio de cultivo celular com alta concentração de glicose (4,5 g/L), adequado para uma variedade de tipos celulares, incluindo células de mamíferos de crescimento rápido.
FBS	YEASEN	40130ES76	Um suplemento comum em meios de cultura celular, fornecendo fatores essenciais de crescimento, hormônios e nutrientes para a proliferação celular.
Microscópio Invertido	OLIMPO	IX51	Um microscópio projetado com a lente objetiva abaixo do palco, permitindo a observação de culturas celulares em frascos ou placas por baixo.
Leitor de Microplacas	Diatek	DR-200Bs	Um instrumento usado para detectar eventos biológicos, químicos ou físicos em amostras de microplacas medindo absorvida, fluorescência ou luminescência.
PBS	Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd.	GNM20012	Uma solução tampão é comumente usada em pesquisas biológicas para lavagem de células, diluição de soluções e manutenção da estabilidade do pH.
RD (Célula de Rabdomiossarcoma Embrionário) (STR Autenticada)	Shanghai FuHeng Biotechnology Co., Ltd.	FH0712	A linhagem celular foi autenticada por análise de repetição em tandem curta (STR), possui um fundo genético bem definido e identidade celular clara, garantindo assim a confiabilidade e reprodutibilidade dos dados experimentais.
RMPI Médio Modificado (1640)	Cytiva	SH30809.01	Um meio de cultura celular amplamente utilizado, originalmente desenvolvido para células leucócitas humanas, agora é aplicado a vários tipos celulares de mamíferos.
Tripsina-EDTA	Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd.	GNM25200	Uma solução usada para destacar células aderentes das superfícies de cultura, digerindo proteínas extracelulares e quelando íons de cálcio.