Purificação eficiente de polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) de E. coli usando um método de extração e precipitação à base de solvente orgânico

Resumo

Este protocolo descreve um método rápido e reprodutível de extração e precipitação à base de solvente orgânico para purificar polipeptídeos semelhantes a elastina (ELP) de Escherichia coli, oferecendo uma alternativa potencialmente escalável aos métodos convencionais de purificação de ELP.

Resumo

Polipeptídeos semelhantes à elastina (ELP) são biopolímeros engenheirados construídos a partir de sequências repetitivas de pentapeptídeos que imitam motivos encontrados na tropoelastina de mamíferos. Suas características únicas os tornam candidatos ideais para uma ampla variedade de aplicações biomédicas, que vão desde a administração de medicamentos e genes até engenharia de tecidos e imagem molecular direcionada. Abordagens convencionais de purificação a partir da expressão de Escherichia coli (E. coli) podem ser ineficazes para ELP devido à formação de corpos de inclusão. Outros métodos, como o ciclo inverso de transição (ITC), utilizam as propriedades de menor temperatura crítica da solução (LCST) do ELP para separá-lo de contaminantes como lipopolissacarídeos (LPS), mas normalmente exigem múltiplas etapas de aquecimento e resfriamento que consomem tempo e podem resultar em baixas recuperações dependendo da sequência, concentração e peso molecular do construto ELP. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um fluxo de trabalho de extração-precipitação à base de solventes orgânicos que explora a hidrofobicidade intrínseca da ELP para permitir uma purificação rápida, robusta e amplamente aplicável diretamente a partir de pellets de células de E. coli. Esse método utiliza solventes orgânicos polares para auxiliar na ruptura celular e solubilizar seletivamente o ELP em uma única etapa. Uma etapa subsequente de precipitação remove efetivamente solventes orgânicos residuais, impurezas de baixo peso molecular e endotoxinas, resultando em ELP altamente puro com níveis de LPS abaixo de 1 EU/mL em menos de 3 horas. Dados de microscopia de força atômica sugerem que proteínas de fusão ELP-purificadas dessa forma podem se auto-montar em estruturas reversas semelhantes a micelas, que mantêm a função das proteínas de fusão. Esse método de purificação rápida oferece aos pesquisadores uma forma simples e potencialmente escalável de purificar a ELP, criando novas possibilidades para o uso da ELP e suas proteínas de fusão como blocos flexíveis para aplicações materiais e biomédicas.

Introdução

Polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) são biopolímeros compostos por motivos repetidos (VPGXG)ⁿ 1,2,3,4,5,6,7,8,9. O resíduo convidado X na unidade pentapeptídica pode ser qualquer aminoácido que não seja a prolina. Variações em X podem ser usadas para ajustar a hidrofobicidade, o comportamento de transição térmica e as caracterís....

Protocolo

1. Preparação de materiais

1. Cepa bacteriana: Use células quimicamente competentes de Escherichia coli BL21(DE3) como hospedeiro de expressão.
   NOTA: Foram selecionados devido à sua alta eficiência de transformação e adequação para a produção de proteínas recombinantes.
2. Plasmídeo de expressão: Utilize vetor pET21(+) codificando a proteína de fusão ELP-I-Cm2 com resistência à^{ampicilina 9}. Compre o vetor plasmídico da addgene. Insira o gene Cm2 usando o sítio BsrG I no final da inteína.
   NOTA: A sequência de DNA plasmídico desta proteína está fornecida no ....

Resultados

Após passar pelas fases finais do protocolo, o próximo passo é a visualização do resultado extração-precipitação por meio da análise SDS-PAGE e coloração azul de Coomassie. Quando há uma etapa de lise antes da extração orgânica, uma faixa ELP proeminente deve ser evidente. No caso do ELP-I-Cm2, essa faixa aparece em 100 kDa (Figura 3A).

A triagem de diferentes combinações de solventes orgânicos demonstrou eficiências variáveis na extração (Fig.......

Discussão

O ITC já foi usado anteriormente para purificação não cromatográfica do^{ELP 19}; no entanto, pode ser um método demorado e de baixo rendimento. Nos métodos detalhados acima, descrevemos uma abordagem para a purificação rápida de uma proteína de fusão ELP-I-Cm2, demonstrando como o método de extração-precipitação à base de solvente orgânico pode ser usado de forma eficaz para a purificação de uma grande variedade de fusões ELP e ELP. O protocolo de solvente orgânico .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol	Bio-Rad	161-0710	Componente SDS-PAGE
30% Acrilamida/Bis-acrilamida	TCI	A3218	Componente SDS-PAGE
Acetona	Fisher Scientific	A949	Solvente orgânico
Acetonitrila	Fisher Scientific	A996	Solvente orgânico
Ampicilina	Bio-Biotecnologia Ouro	A-301-25	Antibiótico
APS (Persulfato de Amônio)	Bio-Rad	1610700	Componente SDS-PAGE
Butanol	Fisher Scientific	L13171	Solvente orgânico
EDTA	Biorreagentes Fisher	BP118-500	Componente de Buffer de Lise
Etanol	Laboratórios de Descontaminação	UN1170	Solvente orgânico
Acetato de Etil	Fisher Scientific	E195	Solvente orgânico
Glicerol	Produtos de Pesquisa Internacional	G22020-0.5	Componente de Mídia Terrific Broth (TB)
Ácido Clorídrico	Fisher Scientific	A144SI-212	Componente de Buffer de Lise
Mancha instantânea de Coomasie	Abcam	ab119211	Componente SDS-PAGE
IPTG	Bio-Biotecnologia Ouro	12481C25	Componente de Expressão de Proteínas
Isopropanol	Fisher Scientific	A451-1	Solvente orgânico
K2HPO4 (Monobósica de Fosfato de Potássio)	Ciência dos Wards	470302-246	Parte 2 Componente de Buffer
KH2PO4 (Dibásico de fosfato de potásio)	Ciência dos Wards	470302-254	Parte 2 Componente de Buffer
L-Proline	Produtos de Pesquisa Internacional	P5200-500.0	Componente de Mídia Terrific Broth (TB)
Lisozima	Bio-Biotecnologia Ouro	L-040-1	Componente de Buffer de Lise
Metanol	Fisher Scientific	A452	Solvente orgânico
Buffer de Amostra Nativa	Bio-Rad	161-0738	Componente SDS-PAGE
Escada de Proteínas	Bio-Biotecnologia Ouro	P008-500	Componente SDS-PAGE
Tamponador de Gel de Resolução	Bio-Rad	1610798	Componente SDS-PAGE
Sodim Dodecil Sulfato (SDS)	Termo Científica	J18220-36	Componente SDS-PAGE
Hidróxido de Sódio	Fisher Scientific	S318-500	Componente de Buffer de Lise
Buffer de Gel de Empilhamento	Bio-Rad	1610799	Componente SDS-PAGE
TEMED	Bio-Rad	1610801	Componente SDS-PAGE
Tris Base	Biorreagentes Fisher	BP-152	Componente de Buffer de Lise
Triptona	Produtos de Pesquisa Internacional	T60065-1000.0	Componente de Mídia Terrific Broth (TB)
Extrato de Levedura	Produtos de Pesquisa Internacional	Y20025-1000.0	Componente de Mídia Terrific Broth (TB)