Purificação eficiente de polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) de E. coli usando um método de extração e precipitação à base de solvente orgânico

Summary

Este protocolo descreve um método rápido e reprodutível de extração e precipitação à base de solvente orgânico para purificar polipeptídeos semelhantes a elastina (ELP) de Escherichia coli, oferecendo uma alternativa potencialmente escalável aos métodos convencionais de purificação de ELP.

Abstract

Polipeptídeos semelhantes à elastina (ELP) são biopolímeros engenheirados construídos a partir de sequências repetitivas de pentapeptídeos que imitam motivos encontrados na tropoelastina de mamíferos. Suas características únicas os tornam candidatos ideais para uma ampla variedade de aplicações biomédicas, que vão desde a administração de medicamentos e genes até engenharia de tecidos e imagem molecular direcionada. Abordagens convencionais de purificação a partir da expressão de Escherichia coli (E. coli) podem ser ineficazes para ELP devido à formação de corpos de inclusão. Outros métodos, como o ciclo inverso de transição (ITC), utilizam as propriedades de menor temperatura crítica da solução (LCST) do ELP para separá-lo de contaminantes como lipopolissacarídeos (LPS), mas normalmente exigem múltiplas etapas de aquecimento e resfriamento que consomem tempo e podem resultar em baixas recuperações dependendo da sequência, concentração e peso molecular do construto ELP. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um fluxo de trabalho de extração-precipitação à base de solventes orgânicos que explora a hidrofobicidade intrínseca da ELP para permitir uma purificação rápida, robusta e amplamente aplicável diretamente a partir de pellets de células de E. coli. Esse método utiliza solventes orgânicos polares para auxiliar na ruptura celular e solubilizar seletivamente o ELP em uma única etapa. Uma etapa subsequente de precipitação remove efetivamente solventes orgânicos residuais, impurezas de baixo peso molecular e endotoxinas, resultando em ELP altamente puro com níveis de LPS abaixo de 1 EU/mL em menos de 3 horas. Dados de microscopia de força atômica sugerem que proteínas de fusão ELP-purificadas dessa forma podem se auto-montar em estruturas reversas semelhantes a micelas, que mantêm a função das proteínas de fusão. Esse método de purificação rápida oferece aos pesquisadores uma forma simples e potencialmente escalável de purificar a ELP, criando novas possibilidades para o uso da ELP e suas proteínas de fusão como blocos flexíveis para aplicações materiais e biomédicas.

Introduction

Polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs) são biopolímeros compostos por motivos repetidos (VPGXG)ⁿ 1,2,3,4,5,6,7,8,9. O resíduo convidado X na unidade pentapeptídica pode ser qualquer aminoácido que não seja a prolina. Variações em X podem ser usadas para ajustar a hidrofobicidade, o comportamento de transição térmica e as características funcionais do construto ELP para criar materiais biocompatíveis modulares que têm sido amplamente explorados em várias aplicações^biomédicas 10,11,12.

Embora a síntese química possa ser usada para produzir peptídeos curtos, ela é pouco adequada para ELPs de alto peso molecular ou para manter a funcionalidade das proteínas de fusão^13,14. Por razões como essas, os ELPs são tipicamente expressos de forma recombinante em E. coli, permitindo a produção definida por sequência em grandes quantidades. No entanto, essa abordagem também pode trazer desafios. Durante sua expressão em E. coli, os ELPs frequentemente se acumulam dentro de corpos densos de inclusão, exigindo estratégias eficientes de recuperação para extrair a proteína^{funcional 15}. Além disso, a expressão bacteriana introduz biomoléculas indesejadas, como proteínas da célula hospedeira, ácidos nucleicos e lipopolissacarídeos (endotoxinas), que precisam ser separadas do ELP durante a purificação. Estratégias tradicionais de solubilização usando detergentes (por exemplo, dodecilo sulfato de sódio (SDS) ou Triton X-100) ou agentes caotrópicos como a ureia tiveram sucesso limitado para nossas sequências de fusão ELP. Em nossa experiência, Triton e ureia não conseguiram extrair ELPs da fase de pellets, enquanto a SDS permitiu solubilização parcial, mas interferiu na purificação de afinidade a jusante e foi difícil de remover totalmente da sequência ELP hidrofóbica.

Até o momento, o ciclo de transição inversa (ITC) continua sendo o método de purificação mais amplamente utilizado para ELPs. Essa técnica explora o comportamento LCST deles para precipitar seletivamente e resolubilizar o ELP através de gradientes de temperatura e sal¹⁶. No entanto, com proteínas de menor peso molecular, a ITC é um processo demorado em múltiplas etapas que é pouco adequado para ELPs presos em corpos de inclusão, exigindo múltiplos ciclos ITC que podem levar à perda de proteínas a cada^{etapa 7,16}.

Para superar essas limitações, adotamos um fluxo de trabalho de extração e precipitação à base de solventes orgânicos. Enquanto Yakhnin et al. demonstraram pela primeira vez uma estratégia de particionamento impulsionada por hidrofobicidade para purificação de GFP usando gradientes de etanol e sal em^1998-17, o método inovador que desenvolvemos emprega misturas orgânicas de solventes para extrair diretamente proteínas de fusão ELP das células de E. coli ⁷. Sweet et al. e Darji et al. adaptaram essa abordagem para fusões ELP, mostrando que a extração por solvente orgânico permite a rápida recuperação de ELPs funcionais enquanto mantém a integridade estrutural e a bioatividade ^8,9. Essa abordagem utiliza sonicação e solventes orgânicos para lisar células bacterianas e extrair ELPs em uma única operação, enquanto precipita a maioria das proteínas hospedeiras e ácidos nucleicos. A recuperação da fase orgânica rica em ELP, seguida por precipitação rápida para isolar os ELPs de solventes e impurezas solubilizadas, resulta em ELPs altamente puros. Essa abordagem também é capaz de produzir ELP puro a partir de pellets de E. coli com níveis de endotoxina abaixo de 1 EU/mL em menos de três^{horas 7,8}.

Estudos até o momento mostram que esse método é capaz de purificar construtos ELP e proteínas de fusão ELP com diferentes peso molecular e ponto isoelétrico, sem múltiplos ciclos ITC ou etapas de solubilização (Figura 1). Microscopia de força atômica (AFM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) sugerem que proteínas de fusão ELP-purificadas dessa forma formam estruturas semelhantes a micelas-invertidas (Figura 2), ajudando assim a preservar a estrutura e a função dos domínios de fusão ELP durante a extração por solvente orgânico. Esse fluxo de trabalho simplificado permite uma purificação ELP mais rápida e confiável para diversas aplicações^{biomédicas 7,8}. Notavelmente, Aayush et al. relataram que construtos ELP purificados por esse método mantiveram a função de ligação ao receptor do fator de crescimento^{epidérmico 18}, destacando que esse método não apenas produz material ELP puro, mas também mantém a atividade do domínio proteico de fusão.

Como demonstração adicional da utilidade desse método em isolar uma fusão ELP-enzima, descrevemos um método detalhado à base de solvente orgânico para purificar um construto ELP-Intein-Corimasate mutase 2 (ELP-I-Cm2) (Figura 3). Esse método pode ser útil para purificação rápida de outros ELPs para aplicação de medicamentos e nanomateriais.

Protocol

1. Preparação de materiais

1. Cepa bacteriana: Use células quimicamente competentes de Escherichia coli BL21(DE3) como hospedeiro de expressão.
   NOTA: Foram selecionados devido à sua alta eficiência de transformação e adequação para a produção de proteínas recombinantes.
2. Plasmídeo de expressão: Utilize vetor pET21(+) codificando a proteína de fusão ELP-I-Cm2 com resistência à^{ampicilina 9}. Compre o vetor plasmídico da addgene. Insira o gene Cm2 usando o sítio BsrG I no final da inteína.
   NOTA: A sequência de DNA plasmídico desta proteína está fornecida no Arquivo Suplementar 1.
3. Meio de crescimento: Preparação de meio Terrific Broth (TB) para mídia de 1200 mL
   1. Prepare o meio (Parte 1) adicionando 16 g de Triptona, 32 g de extrato de levedura, 16 g de prolina, 6,8 mL de glicerol para 1100 mL de água ultrapura. Misture bem para dissolver todos os componentes. Ajuste o volume final para 1200 mL usando água ultrapura.
   2. Prepare o tampão de fosfato de potássio (Parte 2) misturando 23,1 g de KH₂PO₄ e 125,4 g de K₂HPO₄, e então aumente o volume para 1 L com água ultrapura.
   3. Autoclave os componentes (Partes 1 e 2) separadamente. Após a autoclave, monte o meio dividindo a base de TB em quatro aliquotas de 300 mL. Adicione 33 mL de tampão fosfato a cada alíquota sob condições estéreis.
4. Aditivos para expressão
   1. IPTG: Realize indução usando IPTG em concentração final de 1,2 mM (por exemplo, adicione 396 μL de 1 M de IPTG a 330 mL de cultura).
   2. Antibiótico: Adicione ampicilina a uma concentração final de 100 μg/mL para garantir a seleção do plasmídeo.
5. Tampão de lise (pH 8,5): Prepare o tampão de lise com 10 mM Tris Base e 22 mM de ácido etilenediamino tetraacético (EDTA). Ajuste o pH para 8,5 usando HCl ou NaOH conforme necessário.
6. Solventes orgânicos para extração
   1. Empregar uma variedade de solventes orgânicos (Tabela 1) para extrair a proteína de fusão ELP-I-Cm2 dos corpos de inclusão. Teste esses solventes tanto individualmente quanto em combinações binárias (1:1 vol: vol) para avaliar a eficiência e a pureza do ELP.
      NOTA: Todos os solventes usados eram de grau HPLC, exceto acetonitrilo (grau Optima), etanol (grau USP) e 1-Butanol (99% de pureza).
      ATENÇÃO: Todos os solventes listados acima são voláteis e inflamáveis. Eles devem ser manuseados dentro de um exaustor químico usando EPI apropriado (jaleco, luvas de nitrilo e proteção ocular). Muitos tipos de utensílios plásticos não são compatíveis com solventes orgânicos. O plástico de polipropileno é altamente recomendado para experimentos de extração-precipitação com solventes orgânicos; caso contrário, o material plástico a ser usado deve ser testado sem uma amostra valiosa para garantir que seja adequado ao uso. O descarte de resíduos solventes deve seguir os procedimentos estabelecidos nas políticas institucionais pertinentes sobre resíduos perigosos.

2. Lisagem e preparação celular (Figura 4A)

1. Ressuspensão: Pese 1 g de pellet celular e ressuspenda em 4 mL de tampão de lise recém-preparado. Faça vórtice suavemente até que o pellet esteja totalmente disperso e misture com o tampão.
2. Lisis enzimática: Adicione ~5 mg de lisozima para auxiliar na digestão da parede celular. Deixe a suspensão incubar a 4 °C por 1 hora. Isso facilita a digestão enzimática parcial para impulsionar a lise celular.
3. Sonicação: Após a incubação, sonica a amostra para completar a lise celular e cisalhar o DNA genômico. Use rajadas curtas de sonda microponta (dispositivo de 350 W, nível de potência 3) com intervalos para evitar superaquecimento (por exemplo, 5 s ligados/10 segundos desligados, repetidos conforme necessário). Sonice as amostras no gelo e aplique a energia ultrassônica até que um lisado uniforme livre de partículas visíveis seja obtido, tipicamente por cerca de 5 a 8 minutos.
   NOTA: Após a conclusão da sonicação, armazene uma alíquota de 100 μL da amostra (ou do lisado) para análise de expressão ELP para monitorar o progresso da purificação antes e depois das etapas de extração e precipitação.
4. Centrifugação e análise de expressão.
   1. Limpe o lisado por centrifugação a 10.000 g por 10 minutos a 20 °C, depois separe cuidadosamente o sobrenadante (fração solúvel) do pellet (fração insolúvel/corpo de inclusão).
   2. Avaliar a expressão de ELP em ambas as frações por SDS-PAGE: retirar uma alíquota (por exemplo, 10-20 μL) do sobrenadante e resuspender uma massa equivalente de pellet no tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) ao mesmo volume; misture cada um com 4x de tampão Laemmli até um final 1x, aqueça a 95 °C por 5 minutos e carregue quantidades iguais para permitir a comparação direta.
   3. Se o ELP alvo for predominantemente solúvel, prossiga com a extração com solvente orgânico usando o sobrenadante clarificado. Se for predominantemente insolúvel (corpos de inclusão), descarte o sobrenadante e continue com o fluxo de trabalho do corpo de inclusão (lavagem/solubilização e extração) processando o pellet por extração com solvente orgânico.
5. Lavagem e secagem de pellets (apenas para ELP em corpos de inclusão): Inverta os tubos da centrífuga para permitir a drenagem assistida por gravidade de qualquer tampão de lise residual. Depois que o líquido visível tenha drenado (~1-2 minutos), deixe o pellet secar ao ar em temperatura ambiente por 5-10 minutos, garantindo que esteja livre do excesso de umidade antes de prosseguir para a extração orgânica.

3. Extração orgânica (Figura 4B)

NOTA: Cada ELP tem sua própria condição de solvente preferida para obter extrações de alta pureza (por exemplo, desempenho AC na Figura 1). Portanto, deve ser testada uma triagem inicial de 28 solventes orgânicos e suas combinações, e os isolados analisados pelo PAGE para identificar as condições ideais de eficiência de solubilização para o construto de interesse.

1. Triagem de solventes. Analise os solventes individuais mostrados no passo 1.6 e suas misturas de solventes binários 1:1 (v/v). Avalie misturas adicionais (por exemplo, 1:2, 2:1, 4:1) para aumentar a eficácia do processo.
   NOTA: Atualmente, não existem diretrizes para selecionar racionalmente os solventes ou combinações mais eficazes, portanto é necessária uma campanha de triagem para selecionar entre solventes que já tiveram sucesso na solubilização de agregados proteicos hidrofóbicos. A seleção final do extrator de solvente orgânico a ser usado para purificação deve ser baseada na análise SDS-PAGE dos isolados obtidos a partir dessa triagem.
2. Procedimento de extração
   1. Adição de solvente: Adicione 4 mL de solvente orgânico ou mistura de solvente ao pellet/sobrenadante secado ao ar obtido após a lise. Para combinações mistas, certifique-se de razões volumétricas precisas (por exemplo, 2 mL de cada para uma combinação 1:1).
   2. Vórtice: Faça vórtice vigorosamente na suspensão por 1 minuto para garantir uma mistura e penetração completa do solvente no pellet.
   3. Incubação (tempo de retenção): Permita que a suspensão incube a 20 °C por 5 minutos, garantindo tempo suficiente de interação para que proteínas extracelulares se agreguem e sedimentem enquanto os ELPs se solúvem na fase orgânica.
   4. Centrifugação: Centrifuge a mistura a 13.000 × g por 10 minutos a 20 °C para separar proteínas solubilizadas dos detritos insolúveis residuais.
   5. Coleta de sobrenadante: Colete cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pastilha. O sobrenadante contém o ELP solubilizado, enquanto o pellet contém proteínas da célula hospedeira, ácidos nucleicos e lipídios.
   6. Medição de volume: Registre o volume do sobrenadante recuperado com precisão. Deve-se ter cuidado para garantir que o sobrenadante esteja livre de partículas de pellet. Essa medição é fundamental para a etapa de precipitação a jusante.

4. Precipitação de proteínas

1. Adição de antisolvente: Adicione acetona ou acetonitrila ao sobrenadante orgânico a 2,33 vezes o volume medido do sobrenadante.
2. Incubação: Incube a mistura a 20 °C por 5-7 minutos.
3. Centrifugação: Centrifugar a 10.000 g por 10 minutos a 20 °C.
4. Manuseio de pellets: Após a centrifugação, descarte cuidadosamente o sobrenadante e seque a amostra ao ar, deixando o tubo sem tampa sob um suave jato de nitrogênio por 10-15 minutos, ou incube colocando tubos de centrífuga sem tampa de cabeça para baixo em lenços sem fiapos em uma exaustão por 1 hora a 20 °C (não aplique calor).

5. Manuseio e ressuspensão de pellets de proteína

1. Resssuspensão: Após a precipitação e secagem ao ar, ressuspenda o pellet proteico em 50 μL de soro salino tamponado com fosfato (PBS). Pipete suavemente para cima e para baixo para garantir que o pellet esteja completamente dissolvido.
2. Armazenamento: Armazene a proteína ressuspensa a -20 °C para uso de curto a médio prazo. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento para manter a integridade funcional da proteína.

6. Validação via SDS-PAGE

1. Preparação da amostra: misture a proteína purificada com um buffer de carregamento SDS-PAGE 4× em uma proporção 3:1 e faça um vórtice breve para garantir homogeneidade.
2. Condições de eletroforese: Coloque em um gel SDS-PAGE de 15% para ELP-I-Cm2 e opere a 100-120 V até que o corante rastreador alcance o fundo.
   NOTA: A % de reticulação no gel deve ser baseada no tamanho do construto ELP de interesse
3. Coloração e visualização: Tinga o gel usando o Instant Blue Coomassie ou outro corante adequado por 2 horas a 20 °C. Evite enxaguar com água desionizada até que um fundo claro seja alcançado. Testar a proteína isolada em ensaios de atividade para validar que a retenção de atividade ocorreu após o fluxo de trabalho de extração e purificação por precipitação com solvente orgânico.

Results

Após passar pelas fases finais do protocolo, o próximo passo é a visualização do resultado extração-precipitação por meio da análise SDS-PAGE e coloração azul de Coomassie. Quando há uma etapa de lise antes da extração orgânica, uma faixa ELP proeminente deve ser evidente. No caso do ELP-I-Cm2, essa faixa aparece em 100 kDa (Figura 3A).

A triagem de diferentes combinações de solventes orgânicos demonstrou eficiências variáveis na extração (Fig...

Discussion

O ITC já foi usado anteriormente para purificação não cromatográfica do^{ELP 19}; no entanto, pode ser um método demorado e de baixo rendimento. Nos métodos detalhados acima, descrevemos uma abordagem para a purificação rápida de uma proteína de fusão ELP-I-Cm2, demonstrando como o método de extração-precipitação à base de solvente orgânico pode ser usado de forma eficaz para a purificação de uma grande variedade de fusões ELP e ELP. O protocolo de solvente orgânico ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanol	Bio-Rad	161-0710	Componente SDS-PAGE
30% Acrilamida/Bis-acrilamida	TCI	A3218	Componente SDS-PAGE
Acetona	Fisher Scientific	A949	Solvente orgânico
Acetonitrila	Fisher Scientific	A996	Solvente orgânico
Ampicilina	Bio-Biotecnologia Ouro	A-301-25	Antibiótico
APS (Persulfato de Amônio)	Bio-Rad	1610700	Componente SDS-PAGE
Butanol	Fisher Scientific	L13171	Solvente orgânico
EDTA	Biorreagentes Fisher	BP118-500	Componente de Buffer de Lise
Etanol	Laboratórios de Descontaminação	UN1170	Solvente orgânico
Acetato de Etil	Fisher Scientific	E195	Solvente orgânico
Glicerol	Produtos de Pesquisa Internacional	G22020-0.5	Componente de Mídia Terrific Broth (TB)
Ácido Clorídrico	Fisher Scientific	A144SI-212	Componente de Buffer de Lise
Mancha instantânea de Coomasie	Abcam	ab119211	Componente SDS-PAGE
IPTG	Bio-Biotecnologia Ouro	12481C25	Componente de Expressão de Proteínas
Isopropanol	Fisher Scientific	A451-1	Solvente orgânico
K2HPO4 (Monobósica de Fosfato de Potássio)	Ciência dos Wards	470302-246	Parte 2 Componente de Buffer
KH2PO4 (Dibásico de fosfato de potásio)	Ciência dos Wards	470302-254	Parte 2 Componente de Buffer
L-Proline	Produtos de Pesquisa Internacional	P5200-500.0	Componente de Mídia Terrific Broth (TB)
Lisozima	Bio-Biotecnologia Ouro	L-040-1	Componente de Buffer de Lise
Metanol	Fisher Scientific	A452	Solvente orgânico
Buffer de Amostra Nativa	Bio-Rad	161-0738	Componente SDS-PAGE
Escada de Proteínas	Bio-Biotecnologia Ouro	P008-500	Componente SDS-PAGE
Tamponador de Gel de Resolução	Bio-Rad	1610798	Componente SDS-PAGE
Sodim Dodecil Sulfato (SDS)	Termo Científica	J18220-36	Componente SDS-PAGE
Hidróxido de Sódio	Fisher Scientific	S318-500	Componente de Buffer de Lise
Buffer de Gel de Empilhamento	Bio-Rad	1610799	Componente SDS-PAGE
TEMED	Bio-Rad	1610801	Componente SDS-PAGE
Tris Base	Biorreagentes Fisher	BP-152	Componente de Buffer de Lise
Triptona	Produtos de Pesquisa Internacional	T60065-1000.0	Componente de Mídia Terrific Broth (TB)
Extrato de Levedura	Produtos de Pesquisa Internacional	Y20025-1000.0	Componente de Mídia Terrific Broth (TB)