Determinação da Biomassa Microbiana no Solo usando PCR Digital por Gotículas (ddPCR)

Resumo

Este estudo apresenta um método rápido de ddPCR para quantificar biomassa microbiana do solo e proporções fúngico-bacterianas. Embora o carbono microbiano derivado da ddPCR apresente apenas fraca correlação com estimativas de fumigação com clorofórmio, o método oferece uma abordagem molecular sensível e escalável para avaliar a abundância microbiana sem amostragens adicionais do solo ou uso agressivo.

Resumo

O solo representa o maior pool terrestre de carbono orgânico, mas mais de 133 Gt de carbono foram perdidos nos últimos dois séculos. A quantificação precisa da biomassa microbiana do solo, especialmente de fungos e bactérias, os principais decompositores que impulsionam o ciclo de carbono e nutrientes, é essencial para entender o funcionamento ecológico e a saúde do solo. Abordagens convencionais, incluindo extração por fumigação com clorofórmio e análise de PLFA, são limitadas por altas exigências de amostragem e incertezas associadas à conversão de marcadores bioquímicos em estimativas de biomassa microbiana. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho otimizado para quantificar a abundância bacteriana e fúngica no solo usando PCR digital de gotículas (ddPCR) direcionado aos genes 16S e 18S rRNA. O método permite quantificar absolutamente cópias genéticas microbianas, conversão para números celulares usando fatores de correção de número de cópias gênicas e subsequente estimativa de carbono microbiano. Aplicamos esse protocolo a solos de cinco sistemas agrícolas distribuídos globalmente, que diferem em textura, uso do solo e conteúdo orgânico. Estimativas derivadas da ddPCR foram comparadas com estimativas convencionais de fumigação com clorofórmio de carbono da biomassa microbiana. A ddPCR forneceu quantificação de alta resolução da abundância microbiana e produziu estimativas mais amplas e sensíveis das razões F:B entre tipos de solo do que o sequenciamento do genoma inteiro. Embora a MBC derivada da ddPCR tenha mostrado apenas uma correlação fraca com os valores de fumigação com clorofórmio, esse método oferece uma abordagem molecular eficaz para avaliar biomassa microbiana e indicadores ecológicos, como a razão F:B. Esse protocolo fornece uma estratégia reprodutível e escalável para integrar medidas de abundância microbiana com análises composicionais para avançar a avaliação da saúde do solo.

Introdução

O solo é o maior reservatório terrestre de carbono orgânico, contendo mais carbono do que a vegetação e o carbono atmosférico juntos¹. Mais de 133 gigatoneladas (Gt) de carbono foram perdidos dos solos nos últimos 200 anos, e esforços contínuos para restaurar e manter os estoques de carbono do solo são vitais para a saúde global^{do solo 2}. Dada a imensa capacidade de armazenamento de carbono dos solos, determinar com precisão os principais contribuintes para esses estoques de carbono é fundamentalmente^{importante 3}. Microrganismos desempenham um papel fundamental no ciclo de nutrientes dentro do solo, e a biomassa microbiana representa um componente significativo do carbono orgânico do solo (SOC⁾³. Fungos e bactérias são os principais decompositores nos ambientes do solo e são essenciais nos ciclos biogeoquímicos desses^{ecossistemas 4,5}. Em solos dominados por bactérias, a decomposição de matéria orgânica e a mineralização de nutrientes são muito mais rápidas do que em um⁵ dominado por fungos. A razão fúngica para bacteriana (F:B) é cada vez mais utilizada como indicador da saúde do^{solo 6,7}; portanto, a avaliação precisa tanto de fungos quanto de bactérias é fundamental.

Estimativas de biomassa microbiana em solos frequentemente dependem de tratamentos químicos disruptivos, como a fumigação com^{clorofórmio 8}. Outras abordagens direcionam seletivamente a comunidade microbiana ativa por meio de técnicas como respiração induzida pelo substrato ou análise de ácidos graxos fosfolipídicos (PLFA^{) 9}. A análise de PLFA tem sido amplamente utilizada para avaliar a composição da comunidade microbiana e estimar a razão F:B. No entanto, variações significativas no tamanho celular entre diferentes espécies fúngicas e bacterianas introduzem incerteza ao converter concentrações de PLFA em razões F:B baseadas em biomassa ou população, tornando tais estimativas potencialmente pouco^{confiáveis 10}. Outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser usados para aumentar a taxa de amostra para determinar a abundância bacteriana nos solos; no entanto, sua precisão pode ser reduzida devido a partículas não microbianas que apresentam tamanho, formato e características de autofluorescência semelhantes aos microrganismos¹¹. A fumigação com clorofórmio requer uma quantidade relativamente grande de solo (>10 g) para estimar biomassa microbiana, enquanto um tamanho de amostra de 500 mg de solo é suficiente para métodos baseados em DNA ao realizar extrações com kits comerciais. Uma comparação anterior entre métodos baseados em DNA e fumigação com clorofórmio mostrou que, embora ambas as abordagens fossem capazes de estimar biomassa microbiana, usá-las em conjunto proporcionou uma avaliação mais robusta da biomassa microbiana^{do solo 12}.

As avaliações de comunidades microbianas são uma métrica subutilizada da saúde do solo que tem potencial para transformar a forma como medimos e compreendemos os^{solos 13}. Abordagens de metabarcoding são convencionalmente usadas para determinar a comunidade microbiana do solo, com abundâncias bacterianas relativas avaliadas por regiões amplificadoras do gene rRNA 16S, enquanto táxons fúngicos são direcionados usando o gene rRNA 18S ou a região¹⁴ do espaçador interno transcrito (ITS). Abordagens de metabarcoding para fungos podem depender de diferentes regiões genômicas-alvo, afetando a diversidade e abundância das espécies fúngicas identificadas. O comprimento desigual do ITS entre espécies fúngicas pode promover amplificação preferencial e sequenciamento, portanto estimativa incorreta de sua abundância, levando a uma avaliação incorreta das comunidades^{fúngicas 15}. Os primers Fungiquant foram desenvolvidos para atingir regiões variáveis específicas dentro do gene 18S rRNA que apresentam cobertura abrangente de fungos diversos e especificidade em comparação com outros^{eucariotos 16}.

A maioria das bactérias e fungos possui mais de uma cópia do gene alvo, o que leva a estimativas tendenciosas da contagem celular. Além disso, fungos frequentemente possuem células multinucleadas com números variáveis de núcleos por célula⁶. Há considerável variação no número de cópias do gene de rRNA tanto dentro quanto entre grupos taxonômicos, normalmente totalizando menos de 15 cópias em procariotos, e estimando-se que variem entre 28 e 511 para o fungo¹⁷. Devido a essa variação, técnicas moleculares usadas para analisar estruturas de comunidades microbianas são consideradas semi-quantitativas, pois podem distorcer a estimativa da abundância relativa da espécie em uma comunidade¹⁸. Números de cópias genéticas medidos (GCN) são rotineiramente convertidos em abundâncias celulares usando a média estimada de GCN no grupo taxonômico^{de interesse} 18,19,20.

Alguns estudos utilizaram abordagens metagenômicas, pois oferecem várias vantagens em relação ao metabarding, incluindo a eliminação do viés de amplificação e a capacidade de examinar toda a comunidade microbiana de forma^{abrangente 21}. Além disso, permitem a comparação simultânea das composições fúngicas e bacterianas, bem como suas relações entre^{si 22}. Em geral, a RT qPCR é comumente empregada para detectar o conteúdo microbiano e a função²³. A qPCR apresenta limitações quando comparada à digital droplet PCR (ddPCR) para quantificação absoluta devido à sua sensibilidade a inibidores, pois requer um padrão externo²⁴.

A ddPCR é uma tecnologia inovadora que depende da partição das reações de amplificação individuais em gotículas separadas. O molde é subsequentemente amplificado por PCR em cada gota individualmente como uma reação separada. A ddPCR possui baixa sensibilidade a inibidores enzimáticos, melhor precisão, repetibilidade, sensibilidade e estabilidade na quantificação bacteriana e fúngica do que a qPCR²⁵. Além disso, é um método que pode ser utilizado para quantificação absoluta de bactérias e hongos no solo⁵. Como a ddPCR depende do mesmo DNA extraído usado para avaliar mudanças de composição microbiana, os dados de abundância da ddPCR podem ser diretamente vinculados aos dados de composição da comunidade²⁶ e usados para quantificar a biomassa microbiana do solo.

Este estudo fornece uma metodologia para quantificar fungos e bactérias em solos usando PCR digital de gotículas (ddPCR). Esse método otimizado foi aplicado a solos de cinco diferentes localizações globais e usos do solo. Locais de amostra foram selecionados para abranger um amplo espectro de propriedades do solo, condições ambientais e práticas de manejo, permitindo assim a avaliação da robustez e generalidade de nossa abordagem em diversos contextos. Esses dados permitiram determinar a razão F:B como bioindicador molecular da qualidade ecológica do solo. Por fim, foi realizada uma comparação da biomassa microbiana estimada entre os dados microbianos ddPCR e os métodos convencionais de fumigação com clorofórmio.

Protocolo

Um esquema geral desses protocolos é mostrado na Figura 1. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Amostragem de solo

1. Colete amostras compostas de solo superficial (0–20 cm) de cinco locais globais, com três amostras de pontos selecionados aleatoriamente dentro de uma área de 25 m de cada local.
   NOTA: Todas as amostras foram coletadas de sistemas agrícolas representativos do uso regional do solo em que estavam localizadas. A textura do solo foi caracterizada usando difração a laser, medida por um analisador de tamanho de partículas de difração a laser (Tabela 1). As amostras foram transportadas à temperatura ambiente e armazenadas a 4 °C até análise adicional.

2. Extração de DNA

NOTA: Realize a extração de DNA usando um kit de extração de DNA do solo seguindo as instruções do fabricante. A temperatura ambiente para todas as etapas foi de 20 °C.

1. Gire brevemente o tubo de batida de esferas de 2 mL para garantir que as esferas tenham se fixado no fundo. Adicione 100 mg de terra e 800 μL de Solução CD1. Vártice brevemente para misturar.
2. Homogeneize as amostras completamente usando um homogeneizador de esferas de esferas, com amostras lisadas por 40 s a 6 m s⁻¹.
3. Centrifuge um tubo de batida de esferas para lise mecânica de células a 15.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente.
4. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo de 2 mL.
   NOTA: O sobrenadante ainda pode conter partículas de solo.
5. Adicione 200 μL de Solução CD2 e vórtice por 5 segundos.
6. Centrifuge a 15.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente.
7. Transfira até 700 μL de sobrenadante para um tubo limpo de microcentrífuga de 2 mL, evitando o pellet. O pellet deve ser visível.
8. Adicione 600 μL de Solução CD3 e vórtice por 5 segundos.
9. Coloque 650 μL do lisado em uma coluna de spin e centrifuge a 15.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente.
10. Descarte o fluxo de fluxo e repita o passo 2.9 para garantir que todo o lisado tenha passado pela coluna de spin.
11. Coloque a coluna de centrifugação em um tubo de coleta limpo de 2 mL.
12. Adicione 500 μL de Solução EA à coluna de spin. Centrifuge a 15.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente.
13. Descarte o fluxo de fluxo e coloque a coluna de spin de volta no mesmo tubo coletor de 2 mL.
14. Adicione 500 μL de Solução C5 à coluna de spin. Centrifuge a 15.000 x g por 1 min em temperatura ambiente.
15. Descarte o fluxo e coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo coletor de 2 mL.
16. Centrifuge a até 16.000 x g por 2 minutos em temperatura ambiente.
17. Coloque a coluna de spin em um novo tubo de elução de 1,5 mL.
18. Adicione 50–100 μL de Solução C6 ao centro da membrana branca do filtro.
19. Centrifuge a 15.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente. Descarte a coluna de spin e salve o eluto a -20 °C.

3. Quantificação do DNA purificado

NOTA: O DNA purificado foi quantificado usando um fluorômetro e um kit de ensaio de dupla fita (dsDNA) Broad Range (BR) seguindo as instruções do fabricante.

1. Prepare uma solução funcional usando uma proporção de 199:1 de tampão para reagente.
2. Adicione 10 μL de cada padrão de DNA a 190 μL da solução de trabalho.
3. Adicione 1–20 μL de DNA purificado a 180–199 μL de solução de trabalho. O volume final deve ser de 200 μL. Vórtice e incubar amostras padrão e de DNA em temperatura ambiente por 2 minutos.
4. Analise os padrões antes das amostras de DNA no fluorômetro usando as instruções na tela.

4. Escolha do primer

1. Para a análise de microrganismos do solo, selecione primers específicos com base em referências relevantes. Para bactérias, foram usados primers 16S rRNA^25,27, e para fungos, primers 18S^{rRNA 16}.
2. Realize a amplificação usando a mistura master PCR em tempo real baseado em corante (qPCR) que liga o DNA e um ciclador térmico. As sequências de primer são fornecidas na Tabela 2.

5. Quantificação microbiana usando ddPCR

1. Degelo e vórtice são todos reagentes no gelo.
2. Configure a reação ddPCR da seguinte forma: 0,1 μL (10 μM) direto e 0,1 μL (10 μM) inverso 16S ou 18S primer, 10 μL ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 ng DNA molde X μL, usando água livre de nuclease (NFW) para ajustar o volume final da reação para 22 μL. Crie um controle negativo adicionando NFW em vez do molde para cada coluna.
3. Coloque a DG8 no suporte do cartucho.
4. Coloque um total de 20 μL da mistura de reação nos poços de amostra do cartucho.
5. Adicione 70 μL de óleo de geração de gotículas para Evagreen no cartucho bem rotulado como 'óleo'.
6. Coloque o cartucho no gerador de gotículas e cubra o cartucho com uma junta.
7. Transfira 40 μL das gotículas geradas para uma placa de 96 poços (semi-saia) para amplificação por PCR.
8. Sele a placa de 96 poços usando o selador de placas (temperatura, 180 °C por 5 s).
9. Use as seguintes condições de ciclagem com uma tampa aquecida ajustada a 105 °C.
   NOTA: (a) Bactérias: 98 °C por 5 min, 40 ciclos de; 94 °C por 30 s, 61°C por 60 s, 5 min a 4 °C, 10 min por 98 °C. (b) Fungos: 95 °C por 5 min, 40 ciclos de; 95 °C por 30 s, 55 °C por 1 min, 72 °C por 30 s, 5 min a 4 °C e 5 min a 90 °C.
10. Transfira a placa de 96 poços para o leitor de placa.
11. Avalie a concentração de cópias de cada poço usando a versão 1.2 do QuantaSoft. Ajuste o limiar da amplitude para separar gotículas negativas e positivas.
12. Calcule o número de cópias do gene por ng de DNA na reação multiplicando cópias/μL pelo volume final da reação (20 μL) e dividindo pelo total de DNA molde que entra na reação da seguinte forma: (cópias ^μL-1 x volume de reação) / Entrada total de DNA na reação.
13. Calcule o total de cópias genéticas por ng de DNA extraído multiplicando as cópias genéticas por ng pelo DNA total extraído (ng) da seguinte forma: (cópias gênicas por ng x DNA total extraído).
14. Calcule as cópias gênicas por grama dividindo o total de cópias gênicas por ng de DNA extraído pela quantidade de peso seco do solo processado na extração (g), da seguinte forma:
    cópias gênicas por grama = (total de cópias gênicas por ng de DNA extraído / grama de peso seco do solo (GDW) do solo processado na extração).
15. Calcule a contagem de células por GDW convertendo as cópias do gene usando o número médio de cópias do gene (GCN) seguindo a equação:
    Contagem celular = cópias gênicas por grama / Cópias médias de genes ^célula-1).
16. Converta os números celulares para carbono da biomassa microbiana (MBC) usando a seguinte equação:
    MBC para 16S (mg C ^g-1 solo) = células ^gdw-1 × (célula 100 ^fg-1) × 10⁻¹⁵ (g fg-1) × 10³(mg ^g-1)²⁸
    MBC para 18S (mg C ^g-1 solo) = células ^gdw-1 × (6 célula ^fg-1) x 10⁻¹² (g fg-1) × 10³ (mg ^g-1)²⁹
    O processo completo é explicado na Figura 2.
    NOTA: A cópia média do gene 16S rRNA (média ± SD) para 46 filos^{bacterianos 20} foi calculada e usada como fator de correção para bactérias, com um valor final de 2,48. Enquanto para fungos, o número de cópias do gene foi calculado com um fator de correção de 113 segundo Lofgren et ^al.17. O carbono da biomassa microbiana (MBC) foi estimado a partir das contagens celulares derivadas da ddPCR, usando teores celulares de carbono assumidos de 100 fg por célula^{bacteriana 28} e 6 pg por célula^{fúngica 29}.

6. Análise molecular do solo a partir do sequenciamento do genoma completo

1. Prepare a biblioteca de sequenciamento seguindo o protocolo Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114, usando o Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) (veja a Tabela de Materiais). Certifique-se de usar um código de barras, fornecido no kit, para cada amostra.
2. Sequencie a biblioteca preparada usando uma célula de fluxo Oxford Nanopore Technologies R10.4.1.
3. Realize basecalling no MinKnow durante a execução do sequenciamento selecionando o modelo de super precisão (SUP) e selecionando o corte de código de barras "ON". Versão Dorado: 0.7.2+9ac85c6.
4. Realize a classificação taxonômica das leituras de sequências de DNA usando o classificador taxonômico Kraken2 (v2.1.3)³⁰ contra o banco de dados de proteínas não redundantes (nr) do NCBI, confiança 0,05.
5. Inspecione os arquivos de relatório Kraken2 para classificações totais de bactérias e fungos.
6. Calcule a abundância relativa de bactérias e fungos para cada amostra.

7. Estimativa de carbono da biomassa microbiana do solo por fumigação com clorofórmio

1. Pese amostras de solo fresco em formas pré-pesadas e seque no forno a 105 °C por 24 horas.
2. Calcule o teor de umidade do solo subtraindo o peso seco do solo fresco e dividindo a diferença pelo peso do solo fresco.
   Conteúdo de umidade (%) = (W _úmido –_{W seco})/ W_seco) × 100
3. Use o teor de umidade para calcular a matéria seca do solo.
   Matéria Seca (%) = 100 – Conteúdo de umidade (%)
4. Adicione 5 g de solo a dois tubos centrífugos individuais de 50 mL, rotulados como não fumigados e fumigados.
5. Adicione um total de 25 mL de 0,5 M_{K 2}SO₄ ao tubo rotulado não fumigado.
6. Agite as amostras não fumigadas em um agitador orbital por 1 hora em temperatura ambiente.
7. Adicione 2 mL de clorofórmio sem etanol diretamente ao solo nos tubos rotulados como fumigados. Feche e fixe as tampas com parafilme, e incube no escuro por 24 horas em temperatura ambiente.
8. Centrifuge a amostra não fumigada por 10 minutos a 2.500 x g em temperatura ambiente.
9. Decante o sobrenadante da amostra não fumigada, coe através de um filtro de celulose de 0,45 μm e armazene a -20 °C.
10. Remova as tampas das amostras fumigadas e ventile a exaustão por 2 horas, depois realize a extração K₂SO₄ (repetindo os passos 5-9) e armazene a -20 °C.
11. Meça a concentração de carbono do extrato tanto para amostras 'fumigadas' quanto 'não fumigadas', usando um analisador de Carbono Orgânico Total.
12. Calcule o carbono da biomassa microbiana (MBC) usando a seguinte equação: MBC = (Conteúdo de C Fumigado-Conteúdo de C não fumigado)/0,45. Normalize para solo seco por grama.

8. Estimativa do conteúdo de matéria orgânica do solo

1. Seque um cadinho de porcelana em um forno de convecção por 30 minutos, depois pese-o após esfriar até 20 °C (W_C).
2. Coloque até 2 g de terra no cadinho seco e pese novamente.
3. Seque as amostras de solo no cadinho preenchido em um forno de convecção a 105 °C por 24 horas.
4. Coloque em um dessecador lacrado para esfriar e pesar novamente (W_S).
5. Pré-aqueça um forno de abafamento a 550 °C, depois coloque o cadinho contendo o solo no forno por 4 horas.
6. Remova o cadinho com terra do forno e coloque-o em um dessecador para esfriar.
7. Pese o cadinho com terra (W_A).
8. Meça a porcentagem de SOM calculando a diferença no peso seco do solo antes e depois da incubação a 550 °C.
   _{SOM LOI} = [(W_S –_{W A})/(W_S –_{W C})] × 100

Resultados

Amostras de solo foram coletadas em cinco locais, e o teor de matéria orgânica do solo foi determinado por perda por inflamação. O conteúdo de matéria orgânica do solo variou de 3,38% a 10,34% em cada um dos solos usados no estudo (Tabela 1). Extrações de DNA foram realizadas em cada amostra de solo em triplicada, com rendimentos de DNA resultantes variando de 32 ng a 4.590 ng por grama de solo seco (Figura 3A).

A concentração de DNA diferiu significativamente entre solos com teor variável de matéria orgânica (ANOVA unidirecional p < 0,0001, R²=0,97). O solo com menor teor de matéria orgânica, o solo A, não apresentou a menor concentração de DNA. No entanto, o solo E, que tinha o maior teor de matéria orgânica, apresentava concentração significativamente maior de DNA de todos os outros solos (A–D, p < 0,0001), enquanto o solo B apresentava o menor conteúdo, diferindo significativamente de A e D (p < 0,05). O protocolo ddPCR foi realizado em DNA purificado de cada amostra de solo usando os primers do gene rRNA 16S e 18S. O número de cópias do gene por grama de peso seco do solo para cada um dos genes do rRNA 16S (Figura 3B) e do 18S (Figura 3C) foi determinado usando a ddPCR. Em todas as amostras de solo, havia menos cópias do gene 18S rRNA do que do gene 16S rRNA. Os testes pós-hoc de Tukey revelaram que o solo B tinha o menor número de cópias dos genes 16S e 18S rRNA, com uma média de 8,8 x 10⁷ e 4,6 x 10⁶ genes, respectivamente, por grama de solo seco. O Solo E diferia significativamente de todos os outros solos e apresentou o maior número de cópias dos genes 16S e 18S rRNA, com cópias^{dos genes} 4,4 x 10⁹ e 2,5 x 10 9, respectivamente, por grama de solo seco. Cópias fúngicas nos solos A a D não diferiam significativamente entre si, enquanto cópias bacterianas no solo D diferiram significativamente dos solos B e E.

O sequenciamento shotgun do genoma inteiro (WGS) foi empregado em DNA purificado de cada amostra de solo, e classificações taxonômicas foram realizadas usando Kraken2 contra o banco de dados nr NCBI. O número total de leituras de sequências de DNA classificadas contra bactérias e fungos foi usado para calcular a razão fungo:bacteriana (F:B) para cada solo e comparada com as razões fungo:bacterianas calculadas a partir do número de cópias de genes estimado por ddPCR (Figura Suplementar 1). Os valores de razão F:B obtidos com ddPCR variaram de 0,022 a 0,66 em todas as amostras de solo e foram maiores do que os obtidos com sequenciamento do genoma inteiro. A maior média F:B foi observada no solo E, com um F:B de 0,56 para ddPCR e 0,038 para os métodos WGS. Além disso, houve uma faixa maior de valores F:B identificados nas amostras de solo usando ddPCR em vez de WGS. Além disso, foi observada uma correlação positiva entre a razão F:B determinada pelo método ddPCR e os dados WGS (r = 0,59, R² = 0,35, p = 0,019), conforme mostrado na Figura Suplementar 1.

Um número médio de cópias genéticas para bactérias e fungos foi usado para converter cópias genéticas calculadas no número de células de bactérias e fungos nas amostras originárias (Figura Suplementar 2). Esses dados foram combinados para estimar o número total de células microbianas no solo (Figura 3D) e diferiram significativamente entre os solos (ANOVA unidirecional p < 0,0001). A análise comparativa em dois de Tukey mostrou que o maior conteúdo microbiano foi observado no solo E, enquanto o menor conteúdo microbiano foi encontrado em amostras coletadas do solo B, diferindo significativamente de A, D e E.

Fumigação com clorofórmio foi realizada em cada amostra de solo em triplicado para estimar o carbono total da biomassa microbiana (MBC) em cada amostra (Figura 4A). Entre 3,6 e 9,6 mg de carbono por grama de solo seco foram identificados nos solos utilizados, sem diferenças significativas observadas entre cada uma das amostras (ANOVA unidirecional p = 0,266). Um teor médio de carbono para células bacterianas e fúngicas foi usado para converter o número de células microbianas estimado por ddPCR em um carbono total estimado da biomassa microbiana. Essas estimativas derivadas da ddPCR foram comparadas com o método de fumigação com clorofórmio (Figura 4B). Para avaliar a relação entre a MBC medida pela fumigação com clorofórmio e o método ddPCR, foi realizada uma correlação de Pearson (n = 15). Foi encontrada uma correlação positiva entre os dois métodos (r = 0,43, R² = 0,18, valor p = 0,05). Valores aberrantes do solo E, caracterizados pelo maior teor de matéria orgânica, provavelmente contribuíram desproporcionalmente para esse resultado marginalmente significativo (Figura 4B).

Figura 1: Uma visão geral do processamento de amostras de solo. A figura ilustra os métodos moleculares usando DNA do solo para quantificação microbiana e os métodos convencionais para medir biomassa microbiana, carbono e matéria orgânica do solo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Fluxograma do processo de contagem celular desde cópias ddPCR tanto para 16S quanto para 18S até a estimativa final de carbono da biomassa microbiana, mostrando os passos 5.11–5.16 do protocolo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Quantificação microbiana dos solos. (A) A concentração média de DNA purificada de cada uma das amostras de solo. (B) Número médio total de cópias do gene 16S rRNA por grama de peso seco do solo usando ddPCR. (C) Número médio total de cópias do gene 18S rRNA por grama de peso seco de solo usando ddPCR. (D) Número médio total de células microbianas por grama de peso seco em amostras de solo. Todas as barras de erro exibem o erro padrão da média. Foram realizados um ANOVA unidirecional e o subsequente teste pós-hoc de Tukey para comparações par a par, e as diferenças significativas são mostradas usando display compacto de letras (limiar de significância = 0,05). As amostras são ordenadas do menor ao maior percentual de OM%. Origem do Solo (OM%) A: Holanda (3,38), B: Iraque (5,14), C: China (6,41), D: Reino Unido (8,19) e E: Reino Unido (10,34). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Carbono da biomassa microbiana medido por extração por fumigação com clorofórmio e estimativas celulares baseadas em genes. (A) MBC extraído por fumigação com clorofórmio - disposto de baixo a alto teor de matéria orgânica. Barras de erro exibem o erro padrão da média. Foram realizados um ANOVA unidirecional e o subsequente teste pós-hoc de Tukey para comparações par a par, e as diferenças significativas são mostradas usando uma exibição compacta de letras (limiar de significância = 0,05). (B) MBC estimado a partir da abundância celular (gdw ^{celular -1}) derivado do número de cópias do gene ddPCR e convertido em carbono de biomassa, plotado contra matéria orgânica total para a mesma amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Exemplo	Origem do Solo	pH	Porcentagem de teor de umidade	Matéria Orgânica%	Textura	Uso do solo
A	Texel, Holanda	7.16	19.04	3.38	Argila arenosa	Horticultura
B	Najaf, Iraque	7.58	8.33	5.14	Terra lixosa	Arroz
C	Jiangxi, China	4.11	8.45	6.41	Terra lixosa	Gergelim/Sementes de colza
D	Cambridge, Reino Unido	6.81	21.8	8.19	Terra lixosa	Trigo
E	Exeter, Reino Unido	5.44	20.27	10.34	Terra lixosa	Pradaria

Tabela 1: Propriedades fisioquímicas e características de uso do solo de cinco amostras de solo (A–E), para determinação da biomassa microbiana.

Alvo	BP	Avançar	Reverso	Referência
16S rRNA	180	5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG	5′- ATTACCGCGGCTGCTGG	(Le Geay et al., 2024; Ovreås et al., 1997)
18S rRNA	351	5′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG	5′-GSWCTATCCACAKCACGA	(Liu et al., 2012)

Tabela 2: Pares de primer selecionados para direcionar o gene rRNA 16S e 18S usando a ddPCR.

Figura suplementar 1: Uma correlação entre a razão F:B de todas as amostras de solo, determinada pelo método ddPCR e WGS. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Número de células em diferentes amostras de solo medido usando o método ddPCR direcionando: (A) bactérias; e (B) fungos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Os microrganismos do solo são os principais decompositores em ecossistemas terrestres e desempenham um papel essencial no ciclo de nutrientes e como armazenamento de carbono no solo. Apesar da importância dos microrganismos do solo, quantificar com precisão sua abundância absoluta usando métodos baseados em cópias genéticas é desafiador. Isso se deve a muitos fatores, como o número variável de genes-alvo em diferentes espécies. Este estudo demonstra como a biomassa microbiana do solo pode ser quantificada usando ddPCR, direcionando procariotos e eucariotos usando as respectivas regiões codificadoras do gene rRNA 16S e 18S. A maior razão F:B no solo E foi observada, onde essa amostra também apresentou a maior porcentagem de matéria orgânica. A segunda maior razão F:B foi observada na amostra C, que correlacionou-se com a alta acidez desses solos. Isso era esperado para amostras C e E, à medida que o crescimento fúngico aumenta com pH³¹ mais baixo. O sequenciamento do genoma completo foi realizado nos mesmos extratos de DNA usados nos métodos ddPCR. A razão F:B entre WGS e ddPCR foi comparada. A razão F:B calculada a partir dos dados do WGS foi menor para todas as amostras analisadas em comparação com a razão F:B calculada a partir dos dados da ddPCR. No entanto, a tendência geral da razão F:B entre as amostras foi visualmente comparável entre cada método. Isso resultou em razões F:B mais altas em amostras de solo em comparação com o sequenciamento do genoma completo e demonstrou maior variabilidade da razão F:B entre diferentes tipos de solo. A menor razão F:B observada nos dados do WGS provavelmente é causada pelas diferenças no tamanho do genoma entre fungos e bactérias, e as sequências fúngicas podem estar sub-representadas sem o enriquecimento³². Além disso, apesar do Solo A ter o menor teor de matéria orgânica, ele não apresentou o menor número de cópias microbianas e carbono da biomassa microbiana, destacando que o conteúdo de matéria orgânica nem sempre está diretamente correlacionado com a biomassa microbiana. Notavelmente, as tendências observadas entre a concentração de DNA originário (Figura 3A) e as células microbianas totais (Figura 3D) foram visualmente semelhantes, sugerindo que a concentração de DNA é um bom indicador da biomassa microbiana.

O ddPCR permite quantificar com precisão o número de cópias de genes em amostras de solo, e esse método pode ser usado para estimar o total de células microbianas. No entanto, existem limitações que precisam ser consideradas. O número de cópias dos genes de rRNA 16S e 18S varia amplamente entre táxons^{microbianos 23}. Como resultado, usar um único fator de correção para o número de cópias genéticas pode levar a uma superestimação ou subestimação da abundância microbiana em uma^{amostra 33}. Essa limitação pode ser corrigida incorporando conhecimento prévio da comunidade^{microbiana 18}, utilizando dados de sequenciamento do genoma completo e aplicando correções apropriadas no número de cópias de genes que representem a microbiota específica do solo. Embora os métodos moleculares ainda forneçam uma estimativa em vez de uma contagem exata, eles oferecem uma previsão mais precisa da abundância microbiana. Quando combinada com dados de composição comunitária, essa abordagem permite interpretações que vão além da abundância relativa^{apenas 19,34}.

O carbono da biomassa microbiana (MBC), estimado usando fumigação com clorofórmio, não mostrou diferenças significativas entre as amostras analisadas, embora altos graus de variação no MBC tenham sido observados entre as amostras A a D. Em contraste, foram detectadas diferenças significativas nas contagens totais de células microbianas medidas usando o método ddPCR, indicando que essa abordagem molecular pode fornecer maior resolução do que as técnicas convencionais. No entanto, calcular o carbono da biomassa microbiana a partir do número de células microbianas tem suas próprias limitações. A variabilidade no tamanho celular pode influenciar a conversão das contagens celulares em biomassa. Semelhante ao uso de um único fator de conversão para o número de cópias gênicas, usar um único fator de conversão para o conteúdo de carbono bacteriano e fúngico pode levar à superestimação ou subestimação do carbono da biomassa microbiana.

Além disso, métodos baseados em DNA podem ser especialmente problemáticos em comparação entre solos que apresentam grandes diferenças no grau de dominância entre bactérias e fungos. Tanto o rendimento de DNA quanto o GCN também podem ser afetados pela escolha do método de extração de DNA e pelo design do primer^35,36, tornando as comparações entre laboratórios^{difíceis 37}. Além disso, tanto os métodos de GCN quanto os métodos de produção de DNA podem ser vulneráveis à superestimação devido ao chamado "DNA relíquia", ou seja, DNA em organismos mortos ou ligado a^{argilas 14,38}. Embora os métodos ddPCR tenham demonstrado melhor precisão e repetibilidade, algumas desvantagens incluem seus processos complicados, altos custos e uso de corante de DNA inespecífico, ao usar a química^{Evagreen 5}. Isso pode criar falsos positivos fracos, dificultando a separação de gotículas positivas de negativas, e um pequeno desajuste do limiar pode impactar a razão F:B quando cópias genéticas estão em^{baixo 14}. Para aumentar o número de amostras que podem ser processadas usando esse método ddPCR, a automação com robótica de manuseio de líquidos pode ser usada para extrações de DNA e configuração^{de reação 39}. Além disso, o novo sistema ddPCR permite maior multiplexação, gerando gotículas para 96 amostras simultaneamente.

É importante notar que todas as medições de biomassa microbiana são estimativas e envolvem fatores de conversão generalizados para determinar os^{números 37}. Portanto, comparações entre métodos devem ser feitas com cautela, pois não se sabe quais são os mais precisos. Apesar disso, métodos de fumigação-extração com clorofórmio têm sido amplamente utilizados nas últimas décadas, dependendo de vapores de clorofórmio para fumigar o solo. Isso levantou muitas preocupações devido à sua toxicidade para humanos e para o meio ambiente, bem como sua eficácia na lisagem de células microbianas do solo⁴⁰. Além disso, a fumigação com clorofórmio pode levar a uma superestimação do MBC produzido a partir de fontes não vivas, como o resíduo vegetal⁴¹. Por fim, esse método também depende de quantidades relativamente grandes de solo em comparação com outros métodos moleculares que exigem quantidades muito baixas de solo (<500 mg).

Este estudo fornece evidências de que métodos baseados em ddPCR para medir a biomassa microbiana do solo em uma variedade de solos são robustos e não são impactados por diferentes tipos de solo e potenciais inibidores. O sucesso desse método é impactado pela amostra de DNA originária e, portanto, garantir uma purificação eficaz do DNA a partir das amostras é vital. Esse método mostra potencial para a detecção e quantificação microbiana em vários tipos e texturas de solo, complementando métodos existentes para estimativa de biomassa microbiana e possibilitando aplicações futuras valiosas no monitoramento da saúde e escalabilidade do solo para vigilância regional ou global do microbioma.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bettersizer S3 Plus	Bettersize, China	BT-803
Centrífuga	Termociência	SL16
Clorofórmio	ThermoScientific	L14759. AU
Placas de 96 Poços ddPCR	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	12001925
ddPCR Óleo Leitor de Gotas	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	1863004
Dessecador	Davisil
Suporte de Cartucho DG8	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	1863051
Cartuchos DG8 para Gerador de Gotículas QX200/QX100	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	1864008
Juntas DG8 para Gerador de Gotículas QX200/QX100	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	P33265
Kit pro DNeasy Power Soil & nbsp;	Qiagen, Alemanha	47017
Kit de ensaio de larga faixa (dsDNA) de larga distância (BR)	Invitrogen, Alemanha	P33230
FastPrep-24 5G	MP Biomédicas, Reino Unido	116005500
GridION	Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido	GRD-MK1CAPX
K2SO4	Merck, Reino Unido	7778-80-5
Esferas magnéticas Mag-Bind	Omega Bio-tek, EUA	M1378-01
Célula de fluxo MinION	Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido	FLO-MIN114
Forno abafado	Carbolite & nbsp;	AAF1100
Kit nativo de código de barras 24	Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido	SQK-NBD114.24
Vedação térmica da placa PCR, folha de alumínio, perfurável	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	1814040
Selante de placas PCR PX1	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	1814000
Fluorômetro de Qubits	Invitrogen, Alemanha	Q33226
Sistema Digital de PCR com Gotejos QX200	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	1864001
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	186-4033
Óleo de geração de gotículas QX200 para EvaGreen & nbsp;	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	1864005
QXDx Gerador de Gotas	Bio-Rad, Watford, Reino Unido	12001049
SENSOQUEST LABCYCLER	Geneflow, Alemanha	1120280125