Imagem de cálcio baseada em fluorescência em culturas epiteliais primárias das vias aéreas humanas usando segmentação celular automatizada

Resumo

A imagem de sinalização de cálcio por células vivas é amplamente utilizada para estudar a mobilização de cálcio em linhagens celulares estáveis cultivadas em monocamadas. Este protocolo descreve imagens de fluorescência de células vivas da sinalização de cálcio usando corantes de células vivas em tecidos primários complexos, e também utiliza software de aprendizado de máquina para quantificar simultaneamente a intensidade de fluorescência de milhares de células individuais, otimizando assim as análises.

Resumo

A sinalização de cálcio é fundamental em uma infinidade de processos biológicos, reforçando a necessidade de desenvolver métodos para estudar o fluxo de cálcio em tecidos primários. O estudo da sinalização de cálcio em resolução de célula única em culturas epiteliais primárias complexas é desafiador e, portanto, ainda é pouco estudado. Este estudo apresenta métodos adaptados para monitorar a sinalização de cálcio vivo em culturas epiteliais primárias das vias aéreas e abordagens inovadoras para análises baseadas em aprendizado de máquina. Utilizando culturas epiteliais primárias das vias aéreas derivadas do paciente, diferenciadas na ALI (interface ar-líquido) carregadas com um corante indicador fluorescente extrínseco, a mobilização de cálcio foi medida em resolução de célula única usando um microscópio epifluorescente. Desenvolvemos um software inovador que utiliza segmentação celular baseada em aprendizado de máquina para atribuir intensidades de fluorescência a células distintas ao longo do tempo. No geral, o setup de imagem adaptado e o software permitem uma abordagem rápida e imparcial para analisar células individuais nas culturas epiteliais primárias. O protocolo passo a passo apresentado aqui permitirá o estudo futuro do cálcio em células individuais e tipos celulares que compõem as culturas epiteliais primárias.

Introdução

Mudanças na mobilização intracelular do cálcio ditam uma grande variedade de processos celulares, incluindo alterações na expressão gênica e modulação das respostas imunes^inatas. Os níveis intracelulares de cálcio podem ser alterados pela liberação de reservas intracelulares de cálcio, como o retículo endoplasmático e as mitocôndrias ^1,2,3. O influxo extracelular de cálcio no espaço intracelular também pode alterar o cálcio citosólico tanto por meio de transporte passivo quanto^{ativo 2}. A imagem de células vivas da mobilização de cálcio é ensaiada principalmente por corantes intracelulares ou corantes geneticamente codificados, GCaMP (Multimer/Proteína Ativada por Cálcio Verde⁾⁴. Comuns na literatura são os corantes conjugados com AM (acetoximetil), que permitem que o corante permeie a membrana^plasmática 5,6,7,8. Ao entrar na célula, a metade AM é clivada por esterases intracelulares endógenas, e o corante ganha carga negativa, que o prende no espaço^{citosólico 9}. Devido a essa carga ganha, o corante pode ser bombeado por canais anônicos orgânicos residentes na membrana plasmática. Portanto, o probenecida, um inibidor dos transportadores de efluxo de ânions orgânicos, é adicionado para prevenir o efluxo celular do corante e reter o sinal citosólico^{ideal 10,11}. Estudos comumente utilizam Fura-2 AM, um corante ratiométrico, e Fluo-4AM, um corante intensitométrico, para testar sinalização de cálcio em linhagens celulares estáveis cultivadas em uma monocamada. Este estudo emprega um protocolo adaptado para imagem epifluorescente de culturas multicamadas cultivadas na interface ar-líquido, utilizando o recentemente desenvolvido corante intensitométrico de cálcio, Cal-520 AM, que apresenta sensibilidade aumentada em comparação com o Fluo-4 AM. Assim, é adequado visualizar robustamente sinais sutis em resolução celular única a partir de culturas epiteliais primárias complexas. A literatura atual é rica em imagens de cálcio vivo das respostas globais de linhagens celulares estáveis. No entanto, agora é amplamente conhecido que, in vivo, os tecidos constituem uma paisagem celular diversificada que suporta diferentes papéis específicos de tipo celular na manutenção da homeostase^tecidual 12,13,14,15. Apesar desse conhecimento comum, os mecanismos pelos quais distintos tipos celulares coordenam sinais de cálcio e regulam a homeostase do íon de cálcio permanecem desconhecidos. Portanto, os métodos apresentados aqui permitirão a detecção de sinalização de cálcio por células únicas e aumentarão o débito das análises a jusante nos tecidos primários das vias aéreas.

Estamos utilizando nossos modelos de cultura epitelial primária previamente publicados e rigorosamente validados do epitélio nasal humano como ferramenta para imagear cálcio citosólico de células vivas em um modelo 16,17,18 mais biologicamente relevante. Resumidamente, as células epiteliais são isoladas das escovas nasais do paciente e cultivadas em uma membrana semipermeável em um poço trans, que fica suspenso dentro de um poço de cultura para manter uma interface ar-líquido (ALI). Essa interface, acoplada a meios especializados, foi rigorosamente testada usando técnicas ortogonais para a presença de diferentes tipos^celulares 16,17,18. Além disso, foi demonstrado que os métodos atuais são transferíveis para culturas brônquicas primárias que são cultivadas de forma semelhante às nossas culturas nasais^{primárias 19}.

Este artigo apresenta um método adaptado para medir e analisar a sinalização de cálcio vivo em resolução de célula única nessas culturas epiteliais primárias das vias aéreas. Essas culturas multicamadas são difíceis de visualizar usando microscopia; No entanto, a configuração atual nos permite focar de forma confiável em camadas individuais dentro das culturas multicamadas, permitindo detectar a mobilização de cálcio dessas camadas específicas. Esse sistema tem várias vantagens, pois não requer um sistema de perfusão, que muitas vezes é caro e difícil de adaptar, a menos que microscópios especializados sejam empregados. A microscopia de epifluorescência tem sido empregada, oferecendo melhor resolução temporal em comparação com a imagem confocal. O uso de diodos emissores de luz (LEDs) minimiza a fototoxicidade em relação a sistemas confocais baseados em laser. Corantes intensiométricos extrínsecos são usados no protocolo apresentado aqui, pois permitem mudanças rápidas e relativas de cálcio em toda a população celular e são compatíveis com a maioria dos sistemas de microscopia de fluorescência. Isso é benéfico em relação aos corantes ratiométricos comuns, que requerem excitação ultravioleta profunda (UV) que não está disponível em muitos microscópios. Além disso, o GCaMP requer transfecção ou transdução, o que fortalece a técnica para imagens de cálcio mais direcionadas em tipos celulares específicos. Devido à baixa transdução e eficiência de transfecção em culturas epiteliais primárias, a técnica é pouco adequada para monitorar toda a população celular.

Além disso, este estudo desenvolveu um software inovador e especializado baseado em aprendizado de máquina que permite a segmentação de célula única baseada em coloração nuclear viva. O software então consegue registrar valores de intensidade de fluorescência para cada célula ao longo do tempo. Uma linha celular epitelial estável (Calu-3) foi inicialmente empregada para otimização de métodos. Depois, esses métodos foram traduzidos para estudar a mobilização de cálcio em células individuais em culturas epiteliais primárias. Variáveis como concentração do corante de cálcio e do probenecídio, o momento das etapas de incubação, bem como a configuração de imagem, foram otimizadas. Aqui, a sinalização de cálcio é registrada a uma taxa de quadros de 0,2 fps (quadros por segundo), o que é adequado para monitorar a sinalização de cálcio. A taxa de quadros pode ser aumentada para medir transientes de cálcio mais^{rápidos 20}. As variáveis ótimas foram então aplicadas e otimizadas ainda mais em culturas nasais primárias mais complexas.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Manutenção e cultivo de células Calu-3

1. Manter células de Calu-3 em frascos T-25 em meio de cultura EMEM suplementado com 20% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Pré-aqueça o substrato e troque em dias alternados (5 mL/frasco).
2. Quando as células estiverem 70% confluentes no frasco, aspire o meio no frasco.
3. Lave o frasco com 5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
4. Adicione 1 mL de Triple diretamente às células por 10-15 minutos a 37 °C, 5% de CO₂. Certifique-se de que todas as células tenham se separado do fundo do cantil e estejam dissociadas em uma suspensão de célula única.
5. Neutralize a reação com 4 mL de meio cultivado fresco (passo 1.1), depois misture bem as células com uma pipeta sorológica para garantir uma semeadura uniforme.
6. Placar as células em uma placa de 96 poços em confluência de 90%-100% (aproximadamente 40.000 células/poço).
   1. Para semear poços, adicione 200 μL/poço de suspensão de célula bem misturada.
   2. Deixe as células aderirem à placa de 96 poços durante a noite.
7. Troque o meio todos os dias (200 μL/poço) até estar pronto para experimentos.
8. Deixe de 2 a 5 dias após a confluência dentro dos poços para iniciar a experimentação antes de realizar experimentos, permitindo a diferenciação.

2. Protocolo para carregamento de células Calu-3 com Cal 520 AM ou Fluo-4 AM

ATENÇÃO: Fluo-4 AM e Cal-520 AM são dissolvidos em DMSO, considerado perigoso. Probenecid está listado como um risco agudo. Por favor, use luvas e jaleco ao manusear produtos químicos para evitar contato com a pele. Descarte todos os produtos químicos em lixeiras específicas para resíduos químicos.

1. No dia do experimento, remova o meio dos poços pipeteando e lave as células duas vezes (200 μL/poço) em tampão de cálcio pré-aquecido (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM_{MgCl 2}, 2 mM_{CaCl 2 e} 10 mM Hepes, ajustados para pH 7,38 (NaOH) 291 mOsm), para remover células mortas.
2. Incubar células com 200 μL/poço de um coquetel de 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM de probenecida e 1:5000 de coloração nuclear Hoechst em tampão de cálcio (passo 2.1) por 1 h em uma incubadora ajustada a 37°C e 5% de CO₂.
   1. Para experimentos de Fluo-4 AM, incube células com 200 μL/poço de um coquetel de 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM de probenecida e 1:5000 de coloração nuclear de Hoechst em tampão de cálcio (passo 2.1) por 1 hora a 37 °C e 5% de CO₂.
      NOTA: Mantenha os tubos de corante no escuro, cobrindo-os com papel alumínio.
3. Durante a incubação, prepare a thapsigargin em tampão de cálcio (passo 2.1). Ajuste as concentrações intermediárias do estoque para garantir concentrações finais adequadas dentro do poço.
   NOTA: Aqui, 50 μL de medicamento são adicionados a 100 μL do tampão de cálcio existente. Portanto, foi preparado um estoque intermediário 3x de 6 μM.
4. Após 1 hora, aspire o corante pipeteando e lave o corante extracelular com tampão de cálcio (passo 2.1) duas vezes (200 μL/poço).
5. Após lavagens, adicione 100 μL/poço de probenecídeo de 2,5 mM diluído em tampão de cálcio (passo 2.1) para manter o corante no espaço citoplasmático.
6. Envolva a placa em papel alumínio para protegê-la da luz. As células agora estão prontas para imagem.

3. Preparando a microscopia para a linha celular estável Calu-3

1. Utilizando o microscópio de epifluorescência equipado com um Objetivo SuperFluor, uma fonte de luz estável de estado sólido e uma câmera de fluorescência CMOS (tamanho de pixel de 6,5 μm). A intensidade da iluminação é definida em 500 mW.
2. Coloque a placa de células no palco usando o adaptador de placa de 96 poços. Usando Campo Claro, foque na camada celular em baixa ampliação para encontrar a monocamada de células (use 5-10x o objetivo do ar).
   NOTA: Esta etapa é opcional, mas útil para obter foco inicial na camada celular de forma eficiente.
3. Depois que a camada celular for identificada, use o campo claro e mude para uma ampliação maior (objetivo de ar 20x) e refoque na camada celular.
   NOTA: Certifique-se de foco adequado na monocamada com Campo Claro; Os limites das células devem ser claros.
4. Identifique o sinal do corante de cálcio usando o GFP (LED de 475 nm). Certifique-se de que a potência do LED fique entre 5% e 10% para evitar o fotobranqueamento, e o tempo de exposição seja adequado para visualizar o sinal verde de base sem saturar demais o sinal, tipicamente entre 300-500 ms.
   NOTA: Para garantir reprodutibilidade e até mesmo carga de corantes, analise qualitativamente a camada celular; A maioria das células deve apresentar o mesmo brilho. Foque nos campos de visão com poucas células mortas, que vão fluorescer intensamente antes de qualquer estimulante ser adicionado. A intensidade relativa de fluorescência de base pode ser medida usando Fiji (passo 7.9). A variação de fluorescência de base entre as células deve estar próxima de 10%-15% se o corante tiver sido carregado de forma uniforme (passo 7.9).
5. Identifique a coloração nuclear Hoechst usando o LED DAPI (405 nm). A potência do LED deve estar entre 2% e 5%, com tempo de exposição entre 50 e 100 ms.
   NOTA: Se as células estiverem em foco, os núcleos devem aparecer com contornos nítidos. Certifique-se de que o sinal nuclear não atinja saturação, pois núcleos podem interferir no canal verde.

4. Aquisição de vídeo ao vivo de cálcio

1. Inicie um vídeo ao vivo usando um intervalo de 1 quadro a cada 5 s (0,2 fps) por uma duração de 10 minutos.
   NOTA: Capture cada canal fluorescente (DAPI 405 nm e GFP 475 nm) em cada quadro.
2. Depois que o vídeo começar, permita uma leitura de referência de 5 minutos antes de adicionar agonistas.
3. Usando uma pipeta P200, adicione 50 μL de thapsigargin em um estoque intermediário 3x ao poço contendo 100 μL de probenecídeo de 2,5 mM em tampão de cálcio (passo 2.1). Suspenda suavemente 1 a 2 vezes no poço para garantir que o medicamento seja distribuído uniformemente. Continue lendo por 5 minutos após a adição do thapsigargin.
   NOTA: A etapa de adição de medicamentos é fundamental; A ponta da pipeta não deve entrar em contato com a placa para deslocar o plano de foco. Em vez disso, flutue a ponta da pipeta para contato apenas com o tampão dentro do poço. Se os medicamentos forem misturados com muita intensidade, as células podem se desprender da placa e interferir no sinal.
   NOTA: Certifique-se de anotar o quadro em que o medicamento é adicionado para análise posterior.
4. Salve o vídeo e a foto tirada antes do experimento. Prossiga para a análise de dados.

5. Protocolo para carregamento de células primárias das vias aéreas com Cal 520 AM ou Fluo-4 AM

1. No dia do experimento, remova o meio basolateral do poço trans e lave os lados apical e basolateral do inserto duas vezes usando 750 μL de basolateral e 300 μL de apical do tampão de cálcio (passo 2.1).
2. Incubar as células com 600 μL de basolateral e 200 μL apical dos corantes Cal-520 AM ou Fluo-4 AM por 1 hora a 37 °C e 5% de CO₂. Prepare o corante da mesma forma que para as células Calu-3, para Cal-520 AM, Cal-520 AM 3 μM, probenecídio 2,5 mM e Hoechst 1:5000 em tampão de cálcio (passo 2.1). Para Fluo-4 AM, 3 μM de Fluo-4 AM, 2,5 mM de probenecida e 1:5000 de Hoechst no mesmo tampão de cálcio.
3. Durante o período de incubação, prepare a thapsigargin em um estoque intermediário de 3× para uma concentração final de 2 μM (estoque intermediário de 6 μM).
4. Em seguida, aspire o contraste e lave as células duas vezes com 300 μL de tampão apical e 750 μL de basolateral contendo cálcio (passo 2.1).
5. Após lavagens, adicione 100 μL de apical e 500 μL de basolateral de 2,5 mM de probenecida em tampão de cálcio (passo 2.1).
6. Mantendo a transmissão bem dentro da placa, envolva a placa em papel alumínio. As células já estão prontas para imagem.

6. Configuração da microscopia para as inserções nasais primárias

1. Adquira uma placa de Petri com fundo de vidro adequada para imagem, pinças e fita adesiva fina. Certifique-se de que a placa de Petri esteja limpa limpando-a rapidamente com etanol 70% e deixando secar completamente.
2. Coloque a placa de Petri com fundo de vidro dentro do pequeno adaptador circular para o microscópio de epifluorescência.
3. Usando uma pinça, coloque cuidadosamente o inserto no centro da travessa de vidro.
   NOTA: Tenha cuidado para não derramar o buffer, que está colocado no compartimento apical do insert.
4. Para garantir que o insert não se mova durante a adição do medicamento, use fita adesiva para fixar a parte superior do plástico do insert nas laterais do prato de vidro.
5. Coloque o adaptador com o inserto preso ao palco do microscópio e comece focando nas células usando o objetivo de campo claro de ar 10x.
6. Identifique o sinal do corante de cálcio usando o GFP (LED de 475nm). Certifique-se de que a potência do LED fique entre 5% e 10% para evitar o fotobranqueamento, e o tempo de exposição seja adequado para visualizar o sinal verde de base sem supersaturá-lo, tipicamente entre 300-500 ms.
   NOTA: Por favor, consulte a NOTA abaixo do passo 3.4 para garantir a carga adequada de corante de cálcio.
7. Identifique a coloração nuclear Hoechst usando o LED DAPI (405 nm). A potência do LED deve estar entre 2% e 5%, com tempo de exposição entre 50 e 100 ms.
   NOTA: Se as células estiverem em foco, os núcleos devem aparecer com contornos claros e definidos. Foque na camada mais apical das células. Ajuste o eixo z do microscópio para identificar o plano focal mais alto onde as células permanecem em foco nítido. Certifique-se de que os núcleos não atinjam a saturação do sinal, pois o sinal nuclear pode interferir no canal verde.
8. Para obter o vídeo ao vivo do cálcio, siga os passos 5.1-5.4. Durante a etapa de adição do medicamento, adicione no centro do insert e ressuspenda lentamente usando uma pipeta P200.
   NOTA: Certifique-se de anotar o quadro em que o medicamento é adicionado para análise posterior.

7. Análise usando o software de Fiji

1. Abra o aplicativo Fiji e selecione Arquivo \ Abrir, envie o arquivo de vídeo e, na janela pop-up resultante, mantenha todas as configurações padrão.
2. Se desejar, em Imagem \ Ajustar \ Brilho/Contraste, altere o brilho e o contraste dos canais de fluorescência separados para ter a visão mais otimizada das células.
3. Para facilitar o rastreamento de células, mescle os canais de coloração nuclear ou campo claro usando Canais Imagem \ Cor \ Fusão e selecione os arquivos apropriados para cada canal individual no pop-up.
4. Para rastrear células específicas com base nos limites celulares e na coloração nuclear, use Analyze \ Tools \ ROI Manager e marque tanto mostrar tudo quanto rótulos no pop-up resultante.
5. Trace cuidadosamente as células usando a ferramenta de seleção à mão livre e pressione t para adicionar uma célula.
   NOTA: Certifique-se de que as células estejam traçadas em todos os 4 cantos e no centro do vídeo.
6. Depois que todas as células forem rastreadas corretamente, dentro da aba aberta com todos os ROIs, clique em Mais \ Multi Measure e pressione OK no pop-up resultante.
7. Copie toda a folha no pop-up resultante intitulado Resultados em um arquivo Excel.
   NOTA: A folha resultante terá 6 subtítulos (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) para cada ROI, com um valor numérico após cada um, que corresponde à respectiva célula rastreada. O valor importante para a análise a jusante será a média de cada ROI.
8. Para monitorar a variação entre a intensidade de fluorescência, calcule a fluorescência média durante a linha de base para cada célula e calcule a variância percentual. Experimentos normalmente têm variância entre 20% e 30%.
   
9. Normalize todas as leituras dividindo os valores médios de intensidade pela primeira leitura da linha de base para cada uma das células traçadas.
10. Crie uma coluna adicional para o tempo em segundos, com o primeiro quadro correspondente ao quadro 0 e os pontos de tempo subsequentes aumentando em 5, o que corresponde ao intervalo de 0,2 fps.
11. Copie os dados para um software de análise e gráficos e gere uma curva de variação na fluorescência ao longo da linha de base ao longo do tempo.
    NOTA: Para gerar gráficos de máximos de célula única, use a função =MAX() no Excel para encontrar o referencial em que a intensidade máxima de fluorescência é atingida para cada célula e plote usando o GraphPad Prism.

8. Análise usando o Conjunto de Cálcio

1. Usando Fiji, abra o arquivo de vídeo e siga os passos 8.1 e 8.2.
2. Uma vez que os canais nuclear e verde estiverem otimizados para visualização, duplique um único quadro do vídeo clicando em Imagem \ Duplicar. No pop-up resultante, desmarque a pilha Duplicate Hyper. Dentro do mesmo pop-up, em canais, tipo 1. Salve como um arquivo de imagem PNG.
3. Repita o passo 9.2 e abaixo dos canais, tipo 2.
   Unam as duas imagens seguindo o passo 8.3. Faça upload da imagem na interface gráfica Cell-Pose (Interface Gráfica do Usuário) para gerar uma máscara celular.
4. Faça upload da imagem na interface gráfica Cell-pose e segmente usando a coloração nuclear (Canal 1) e as colorações citoplasmáticas (Canal 2) selecionando o modelo Cyto3.
5. Salve a imagem como um arquivo PNG, depois abra o arquivo PNG em Fiji e converta para um arquivo TIFF.
   NOTA: A interface gráfica de pose celular produz um arquivo PNG em preto e branco.
6. Abra tanto o arquivo de máscara quanto o arquivo de vídeo na Calcium Suite arrastando e soltando, e então clique em Analisar Dados para gerar um gráfico baixável, assim como um arquivo de .csv para download contendo valores de intensidade normalizados e brutos para todas as células contadas pelo software.

Resultados

Para medir a mobilização de cálcio em células vivas, células de Calu-3 ou culturas nasais primárias diferenciadas são incubadas com um corante intracelular. A mudança relativa no sinal dependente de cálcio é medida como um aumento na mobilização do cálcio, seja a partir dos estoques intracelulares de cálcio ou do espaço extracelular para o citosol. Um aumento sustentado de cálcio no citosol é representado por um aumento da fluorescência após a adição de thapsigargin, um inibidor irrevers...

Discussão

Este artigo apresentou métodos para analisar a sinalização de cálcio unicelular em culturas nasais primárias e brônquicas vivas, bem como em uma linha celular epitelial estável. Tanto os repórteres de cálcio Cal-520 AM quanto Fluo-4 AM são indicadores úteis de cálcio em ambos os sistemas. O Cal-520 AM é mais sensível, pois possui rendimento quântico maior de 0,75 em comparação com o Fluo-4 AM de 0,16 e afinidade ligeiramente maior pelo cálcio (o Kd do Cal-520 AM é de 320 nM e o do Fluo-4...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 24 poços	Thermofisher	142475
Inserts transwell de 24 poços	Corning	CLS3470-48EA
Microplacas de poliestireno preto com fundo plano transparente de 96 poços e tratadas com TC	Corning	3603
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130	Alicotado e armazenado em -20°C; C, dissolvido no DMSO
Software de Suíte de Cálcio	O código pode ser solicitado entrando em contato com nosso grupo de laboratório
EMEM, 1xs	Wisent	320-005-CL	Armazenado em 4° C
Soro Fetal Bovino	Wisent	080-450	Alicotado e armazenado em -20°C; C
Fluo-4 AM & nbsp;	AAT Bioquest	20550	Alicotado e armazenado em -20°C; C, dissolvido no DMSO
HEPES	Bioshop	HEP001.5	Armazenado à temperatura ambiente
Hoechst	Thermofisher	H3570	Armazenado em 4° C
Linha Celular Epitelial Epitelial Humana de Adeoncarcinoma Colorretal	ATCC	HTB-55
Cloreto de Magnésio	Sigma	7786-30-3	Armazenado à temperatura ambiente
Micro-prato 35mm, fundo de vidro baixo	Ibidi	80137	Armazenado em temperatura ambiente
Solução de Penicilina-Estreptomicina	Wisent	450-200-EL	Armazenado em 4° C
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Wisent	3111-010-CL	Armazenado em temperatura ambiente
Cloreto de potássio	Sigma	7447-40-7	Armazenado em temperatura ambiente
Probenecid	Thermofisher	P36400	Alicotado e armazenado em -20°C; C, solúvel em água
cloreto de sódio	Bioshop	SOD004	Armazenado em temperatura ambiente
Thapsigargin	Thermofisher	T7458	Alicotado e armazenado em -20°C; C dissolvido em DMSO
TripLE Express Enzyme (1X), fenol vermelho	Thermofisher	12605010	Armazenado em 4° C