Este protocolo demonstra a injeção de veias temporais para a entrega intravenosa de células cancerígenas pediátricas a camundongos neonatais, permitindo modelagem precisa e reprodutível das respostas imunes em início de vida contra o câncer. O método permite avaliar o impacto de intervenções, como imunomodulação ou terapia, quando aplicadas durante o período neonatal.
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Artigo de método
Um modelo de transplante intravenoso neonatal para avaliação das atividades imunológicas na infância contra células cancerígenas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mais da metade de todos os cânceres pediátricos são iniciados in utero, com a progressão para doença manifesta continuando durante o período neonatal. Embora as imunoterapias agora ofereçam novas opções de tratamento para muitas crianças com câncer, como a imunidade na vida precoce influencia a progressão do câncer e a resposta terapêutica ainda não é completamente compreendida. Abordar essa lacuna exigirá a avaliação das intervenções terapêuticas durante o período neonatal, quando as respostas imunes diferem fundamentalmente das da infância avançada e da vida adulta.
Aqui, descrevemos um modelo de transplante neonatal que se integra com imagens bioluminescentes in vivo para investigar o impacto da modulação imune na vida inicial nos cânceres pediátricos.
A injeção na veia temporal de células marcadas com luciferase, derivadas de dois cânceres iniciados no útero, resultou em transplante tumoral reprodutível em receptores sintéticos de 1 a 2 dias de idade, sem mortalidade relacionada a procedimentos e com alto sucesso procedimental, conforme confirmado por imagens bioluminescentes. Usando a modulação imune impulsionada por infecção como variável experimental, mostramos então que a infecção intraperitoneal com citomegalovírus murino cinco dias após o transplante resulta em uma redução significativa da carga da leucemia linfoblástica aguda (LLA), mas não do neuroblastoma (NB). Essa plataforma possibilita o estudo de diferenças específicas de câncer em resposta à modulação imunológica na vida precoce e ressalta a importância do contexto tumoral ao modelar as interações imuno-câncer na infância.
Coletivamente, essa metodologia oferece uma plataforma versátil e altamente reprodutível para investigar mecanismos imunes neonatais relevantes para a imunovigilância do câncer, modulação imune impulsionada por infecções e intervenção terapêutica. Além da ALL e NB, essa abordagem pode ser adaptada a malignidades pediátricas adicionais e estratégias imunomoduladoras, apoiando estudos mecanicistas e avaliação pré-clínica de intervenções em câncer na fase inicial da vida.
Introdução
Avanços recentes na imunoterapia melhoraram significativamente os resultados para certos pacientes com câncer, mas sua aplicação ideal em crianças pequenas exige uma compreensão profunda de como o sistema imunológico em desenvolvimento identifica e erradica as células cancerígenas. Embora aproximadamente 50% dos cânceres infantis tenham origem in utero, incluindo leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e NB, evidências crescentes sugerem que eventos pós-natais influenciam criticamente a evolução da doença e o desfechoclínico 1,2.
As respostas imunes neonatais diferem quantitativa e qualitativamente das dos adultos3. Na ausência de uma imunidade adaptativa totalmente desenvolvida, a proteção dos recém-nascidos depende fortemente dos anticorpos maternos e das células imunes inatas. Esses efetores inatos, no entanto, são funcionalmente menos eficientes do que seus equivalentes adultos devido à hipo-responsividade intrínseca à célula e à ativação aumentada das vias imunossupressoras, deixando os recém-nascidos particularmente suscetíveis à infecção 4,5,6. No entanto, o impacto dessas características na capacidade do sistema imunológico imaturo de implementar respostas anticancerígenas eficazes ainda é pouco compreendido.
Modelar a imunidade anticâncer na infância requer a entrega precisa e reprodutível de células cancerígenas e moduladores imunológicos ou patógenos durante a curta janela pós-natal, quando a função imune é limitada. A injeção na veia temporal é um método de administração intravenosa neonatal (IV) que melhor atende a esses requisitos e oferece alto sucesso procedimental, baixa mortalidade, estresse mínimo no manuseio e compatibilidade com intervenções sequenciais, como desafio de infecção ou administraçãoterapêutica 7,8,9,10.
Neste estudo, desenvolvemos e modificamos técnicas de parto intravenoso neonatal previamente validadas e a versatilidade da imagem bioluminescente in vivo para descrever um modelo de transplante que estuda o impacto da infecção precoce na progressão das células cancerígenas pediátricas. Essa abordagem permite a administração intravenosa de células B-ALL ou NB marcadas com luciferase para filhotes de 1–2 dias de vida, seguida pela modulação imune por meio da administração intraperitoneal (i.p.) de citomegalovírus murino (mCMV) no dia pós-natal 7 (P7). A progressão do câncer foi avaliada posteriormente 10 dias após a infecção (P17).
Embora o acesso à veia temporal seja restrito a uma janela pós-natal limitada (P0–P3), essa metodologia aprimora a reprodutibilidade e o controle experimental, oferecendo uma plataforma versátil para investigar a influência dos mecanismos imunológicos da vida inicial na imunovigilância do câncer, interações infecção–câncer e respostas à imunoterapia. Além disso, essa abordagem apoia o homing eficiente das células transplantadas, permitindo assim o estabelecimento reprodutível de modelos de doenças para investigações mecanicísticas.
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Protocolo
Todos os procedimentos (Figura 1) foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados Animais e aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade da Colúmbia Britânica (protocolo A23-0169).
1. Geração de células leucêmicas marcadas com luciferase
- Isolamento de Células Leucêmicas de camundongos leucêmicos Eμ-Ret
- Anestesiar os camundongos em uma câmara de indução de 1 L com 5% de isoflurano e 1 L·min-1 oxigênio até que um plano cirúrgico profundo seja alcançado (perda do reflexo de endireitamento e respiração lenta e regular).
- Uma vez confirmada a anestesia profunda, descontinuar o isoflurano e administrar dióxido de carbono (CO₂) em alta vazão (3–4 vezes a taxa padrão de deslocamento gradual; por exemplo, 6-8 L·min para uma câmara de 10 L) sem transferir o animal entre câmaras. Mantenha a exposição ao CO₂ por pelo menos 5 minutos após a respiração cessar para garantir a morte.
- Ventile e reaproveite os gases residuais antes de abrir a câmara.
- Confirme a morte por ausência de batimentos cardíacos e respiração, então realize a luxação cervical como método físico secundário, conforme a instituição.
- Transfira a carcaça para um armário de biossegurança, reconfirme a morte, registre o sexo e o peso corporal, e borrife o exterior com 70% de etanol.
- Faça uma incisão abdominal na linha média, reflita a pele e a parede peritoneal e retire o baço em 5 mL de PBS estéril.
- Dissecar tíbias e fêmures de ambas as pernas, removendo o excesso de tecido, e excisar o baço em condições estéreis. Transfira imediatamente o baço para uma solução estéril e gelada de Soro Fosfatado Tamponado (PBS) de 5 mL para preservar a viabilidade celular.
- Processe o baço.
- Homogeneize o tecido do baço em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) de 1× (use 2 mL para baços > 200 mg). Incube por 2–3 minutos em temperatura ambiente.
- Extingua a lise adicionando 10 mL de PBS + 2% de soro bovino fetal (FBS) (tampão FACS), filtre por um filtro de 40 μm e centrifuge a 350 × g por 5 minutos a 4 °C.
- Resuspenda o pellet de baço em um buffer FACS de 5 mL.
- Processe medula óssea.
- Retire ambas as epífises e lave cada osso com um buffer FACS de 1 mL usando uma seringa de 1 mL equipada com agulha calibre 29 em um tubo de 15 mL.
- Centrifugar a suspensão celular, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de lise de 1× glóbulos vermelhos, incubar por 2 minutos no RT, tênfase a lise adicionando 10 mL de tampão FACS, filtrar por um filtro de 40 μm e centrifugar a 350 × g por 5 minutos a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet BM em um buffer FACS de 1 mL, pipetando para cima e para baixo.
- Faça o vórtice suavemente e filtre por um coador de 40 μm se necessário.
- Resuspenda 0,5 × 10^6 células leucêmicas em meio de cultura celular de 200 μL (por exemplo, Meio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco) suplementado com 20% FBS e interleucina-7 (IL-7; 250 pg·mL-1).
Ponto de pausa: Mantenha as suspensões das células no gelo por até 2 horas antes de tingir.
- Transdução lentivária das células leucêmicas:
- Seme células estromais derivadas da medula óssea murina a 1 × 10^5 células por poço em uma placa de 24 poços 24 horas antes da transdução para permitir a adesão e alcançar 70–80% de confluência.
- Células leucêmicas de placas (0,5 × 10^6 células em volume final de 200 μL) em uma placa de 24 poços tratada sem cultura tecidual.
- Adicione um vetor lentiviral auto-inativante (SIN) codificando um repórter de dupla fusão composto por luciferase vermelha de besouro (CBR) e proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), impulsionado por um promotor constitutivo de ubiquitina, com multiplicidade de infecção (MOI): 10–20, título viral: ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (unidades transdutoras por mililitro) em volume final de transdução de 200 μL junto com polibrena (8 μg·mL-1; Sigma, H9268-5G).
ATENÇÃO: A polibrena é citotóxica em altas concentrações. Não exceda 8 μg·mL-1. Manusear o lentivírus sob contenção de Biossegurança Nível 2 (BSL-2). - Sele a placa com parafilme e centrífuga a 1.200 × g por 20 minutos em temperatura ambiente (RT).
- Após a espinoculação, transfira células leucêmicas transduzidas para a monocamada estromais e cultive por 24 horas a 37 °C, 5% de CO₂ em DMEM + 20% FBS + IL-7 (250 pg·mL-1) para apoiar a sobrevivência celular e a expressão do repórter.
NOTA: Antibióticos podem ser adicionados após 24 horas, se necessário, mas devem ser evitados durante a transdução viral. - Após 24 horas, colete células leucêmicas não aderentes e lave duas vezes com soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS), 350 × g por 20 minutos a 4 °C, para remover vírus residual e polibrene.
- Resuspender células em PBS estéril a 1 × 10^7 células·mL-1 para transplante.
Ponto de Pausa: Após a lavagem, as células podem ser mantidas sob a mesma condição de cultura por até 48 horas antes do transplante, se necessário.
- Transplante em camundongos adultos NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)
- Use camundongos NSG de 4 a 6 semanas como receptores.
- Aqueça o rato por 5 minutos usando um aquecedor ou abajur térmico para dilatar as veias caudais.
- Conter o rato usando um restritor de acrílico.
- Injete 1 × 10^6 células em PBS estéril de 100 μL via veia lateral da cauda usando uma seringa de insulina calibre 29. Não é necessário anestesia (a menos que seja exigido por diretrizes institucionais)
- Aplique uma pressão suave no local da injeção para evitar sangramentos.
ATENÇÃO: Evite extravasamento. A injeção intravenosa bem-sucedida resulta em ausência de inchaço visível. - Monitore os camundongos duas vezes por semana para o desenvolvimento da doença.
- Separação de células leucêmicas GFP+
- Com o início da doença, colha de cabe ou baço de camundongos leucêmicos NSG.
- Prepare uma suspensão de célula única conforme descrito acima.
- Células de coloração com corante de viabilidade (7-AAD).
- Use a Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para separar células leucêmicas GFP+.
- Para a separação, use classificador de células de alta velocidade e siga a estratégia de barragem direta (FSC) vs dispersão lateral (SSC) → excluir detritos, FSC-A vs FSC-H → singletes selecionados, corante de viabilidade negativo → células vivas selecionadas, porta GFP+ → isolar células leucêmicas repórter-positivas.
- Colete as células separadas em tubos contendo DMEM + 20% FBS. Pureza alvo pós-triagem: ≥ 95% de células GFP+.
Ponto de Pausa: Células separadas podem ser mantidas no gelo por até 2 horas antes da criopreservação.
- Criopreservação de células separadas
- Ressuspenda as células separadas a 5 × 10^6 células/mL em meio congelante contendo 90% FBS e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO).
- Aliquota 1 mL por criovial e coloque frascos em recipientes congelantes à base de isopropanol, armazenando a −80 °C durante a noite (12–18 h).
- Transfira frascos para nitrogênio líquido (LN₂) para armazenamento a longo prazo.
ATENÇÃO: O DMSO é tóxico e facilmente absorvido pela pele. Manuseie com luvas e trabalhe rápido.
Ponto de Pausa: As células podem ser armazenadas a longo prazo em nitrogênio líquido até serem usadas em experimentos de transplante neonatal.
2. Geração de células NB marcadas com luciferase
NOTA: Camundongos transgênicos TH-MYCN desenvolvem tumores espontâneos de NB e foram mantidos sob protocolos institucionais aprovados de cuidados com animais. O vetor lentiviral utilizado é o mesmo descrito na Seção 1.2.
- Colheita de tumores e dissociação de tecidos
- Eutanasie camundongos portadores de TH-MYCN de acordo com as diretrizes aprovadas de cuidados com animais.
- Colhe tumores NB subcutâneos ou abdominais em condições estéreis.
- Pese o tecido tumoral e triture em fragmentos de ~1–2 mm usando tesoura estéril.
- Transfira tecido para aproximadamente 5 mL de tampão digestivo por 0,5 g de tecido tumoral em um tubo cônico de 15 mL, composto por DMEM, desoxirribonuclease I (DNase I; 50–100 U·mL-1) e mistura enzimática à base de colagênese (concentração final de 10 μg·mL-1 ).
- Incube a 37 °C em uma incubadora agitada a 150 rpm por 30 minutos.
ATENÇÃO: Reagentes enzimáticos para a digestão podem causar irritação na pele e nos olhos. Use luvas e proteção para os olhos. - Após a digestão, pipete suavemente para cima e para baixo para dissociar ainda mais o tecido. Filtre a suspensão através de um filtro de célula de 70 μm para um tubo novo.
- Centrifuge a 300 × g por 5 minutos em temperatura ambiente (20–22 °C).
- Descarte o sobrenadante e resuspenda pellets em DMEM suplementado com 10% de FBS.
- Realize a lise dos glóbulos vermelhos usando o buffer de lise RBS, conforme descrito anteriormente na Seção 1.1.
- Centrifugar a 300 × g por 5 minutos e ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM de alta glicemia suplementado com 10% de FBS e 50 μM de 2-mercaptoetanol.
ATENÇÃO: O 2-mercaptoetanol é tóxico e volátil. Realize manuseio em uma exaustão química.
Ponto de Pausa: As células podem ser mantidas no gelo por até 1 hora antes da transdução.
- Transdução lentiviral
- Pellet 2 × 10^6 células NB a 300 × g por 5 minutos e remova completamente o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular diretamente em vetor lentiviral concentrado de 14 μL (mesmo vetor descrito na Seção 1.2; título viral ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, MOI aproximado: 10–20).
- Incube a mistura célula-vírus por 5 minutos a 37 °C em uma incubadora umidificada (% CO₂).
- Adicione 200 μL de DMEM com alta glicemia + 10% de FBS e continue a incubação por 2 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
ATENÇÃO: Vetores lentivirais devem ser manuseados sob condições BSL 2. - Lave as células transduzidas quatro vezes com DMEM de alta glicose para remover o vírus residual.
- Conte as células viáveis usando exclusão de azul de tripano.
IMPORTANTE: Mantenha a preparação da matriz sempre no gelo para evitar gelificação prematura.
- Implantação Subcutânea em Camundongos NSG
- Ressuspender células a 5 × 10^6 células por 100 μL em uma preparação de matriz de membrana basal fria (matriz extracelular reduzida por fator de crescimento).
- Anestesiar camundongos NSG de 6–8 semanas (ver Seção 1.1) usando isoflurano inalado (2–3% de oxigênio).
- Mistura célula de carga–matriz em uma seringa pré-refrigerada de 1 mL equipada com agulha calibre 27.
- Injetar 5 × 10^6 células em volume total de 100 μL subcutâneo na região do flanco.
- Monitore os camundongos até a recuperação total da anestesia.
NOTA: Injete imediatamente após a mistura com a matriz para evitar solidificação dentro da seringa. - Deixe os tumores crescerem até ~1 cm de diâmetro.
- Ordenação de células
- Colhe tumores e gere suspensões unicelulares conforme descrito nas Seções 2.1–2.2.
- Enriquecer células marcadas com luciferase por FACS com base na expressão de GFP, seguindo a estratégia de gate descrita na Seção 1.4.
- Realize duas rodadas sequenciais de triagem para alcançar ≥ pureza positiva de 95% para a GFP.
- Criopreservação
- Células ordenadas criopreservadas conforme descrito na Seção 1.5.
Ponto de pausa: As células podem ser armazenadas a longo prazo em nitrogênio líquido para futuros experimentos de transplante.
- Células ordenadas criopreservadas conforme descrito na Seção 1.5.
3. Preparar a suspensão celular para injeção na veia temporal
- O degelo criopante: as células leucêmicas marcadas com luciferase, ou células NB, rapidamente em um banho-maria a 37 °C até que reste um pequeno cristal de gelo.
- Desinfete imediatamente o exterior do frasco com 70% de etanol, depois transfira o conteúdo para 9 mL de meio DMEM pré-aquecido + 10% FBS em um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em PBS estéril e gelado.
- Determine a viabilidade usando exclusão de azul de tripano e um hemocitometro (ou contador celular automático). Use apenas suspensões com ≥ 80% de viabilidade.
- Passe a suspensão da célula por um peneiro de 40 μm para remover aglomerados.
ATENÇÃO: Aglomerados celulares aumentam injeções fracassadas e lesões teciduais. - Ajuste a concentração para preparar 20 μL por neonato contendo 1 × 10^4 células leucêmicas (para transplante leucêmico), ou 5 × 10^4 células NB (para transplante de NB).
- Mantenha a suspensão celular no gelo e misture delicadamente imediatamente antes de carregar a seringa para manter a homogeneidade.
Ponto de pausa: Mantenha as células no gelo por até 2 horas antes da injeção se a viabilidade permanecer ≥ 80%.
4. Injeção na veia temporal (filhotes P1–P2)
NOTA: A injeção neonatal na veia temporal pode ser realizada sem anestesia. No entanto, a imobilização hipotérmica breve é comumente usada para reduzir o movimento e melhorar a precisão da injeção. O uso de imobilização por hipotermia não é permitido por alguns comitês institucionais de cuidado animal – os pesquisadores devem consultar o comitê institucional correspondente antes de realizar esse procedimento. Se aprovado pela sua instituição, os seguintes passos são eficazes para a imobilização hipotérmica.
- Prepare um pequeno recipiente forrado com um guardanapo estéril e pré-resfrie colocando-o sobre gelo.
- Coloque filhotes (pós-natal dia 1–2; P1–P2) no guardanapo dentro do recipiente para imobilização hipotérmica por 2–3 minutos até que o movimento espontâneo seja marcadamente reduzido.
IMPORTANTE: Não permita que os filhotes entrem diretamente em contato com o gelo (use o recipiente e a barreira do guardanapo o tempo todo). - Coloque 60 μL da suspensão da célula em uma seringa de vidro de 100 μL e conecte uma agulha de calibre 30. Expulse a suspensão de volta para dentro do tubo para preencher o volume morto da seringa e da agulha. Uma vez que o volume morto esteja preparado, aspire 20 μL de suspensão da célula para injeção, garantindo que não haja bolhas de ar. Utilize camundongos BALB/c e TH-MYCN como receptores de células leucêmicas e NB, respectivamente.
- Prepare um palco transiluminado colocando uma fonte de luz fria sob uma plataforma de acrílico.
- Use óculos de aumento (ou um estereoscópio) para visualizar o local da injeção.
- Coloque um guardanapo estéril com um orifício central no palco e posicione o filhote de modo que a veia temporal fique visível.
- Coloque um pequeno pedaço de massa de modelar (massinha de modelar) ao lado da cabeça do filhote para ajudar a estabilizar a agulha durante a injeção.
- Insira o bisel da agulha na veia temporal visível e injete lentamente a suspensão celular, observando o preenchimento vascular para confirmar o sucesso da administração intravenosa.
- Após a injeção, aplique uma pressão suave no local da injeção usando um cotonete estéril. Coloque o filhote sobre uma superfície de recuperação aquecida (aproximadamente 37 °C, por exemplo, almofada térmica em baixa temperatura com uma barreira para toalhas) até que o movimento normal e a coloração rosa retornem.
- Monitore o filhote por 5 a 10 minutos após a recuperação, depois devolva-o à represa.
ATENÇÃO: Evite superaquecer durante a recuperação. Use uma camada de barreira e monitore continuamente. - Enxágue a seringa imediatamente com PBS, depois com uma solução de limpeza para seringa, e finalize com 70% de etanol.
5. Preparação e infecção do vírus
- Realizar todos os procedimentos envolvendo citomegalovírus murino (mCMV) sob contenção de BSL-2, de acordo com as aprovações institucionais de biossegurança e cuidados com animais.
- Manusear estoques de vírus em um armário certificado de segurança biológica Classe II e realizar infecções animais em áreas designadas para procedimentos BSL-2.
- Realizar a preparação e o manuseio do vírus em um gabinete certificado de segurança biológica Classe II e realizar as infecções animais em áreas designadas para procedimentos BSL-2.
- Use EPI adequado, incluindo jaleco ou avental descartável, luvas e proteção ocular. Trate todos os materiais que contenham vírus (seringas, roupas de cama, gaiolas e superfícies) como potencialmente infecciosos.
- Minimize o uso de objetos cortantes e descarte as agulhas imediatamente em recipientes aprovados para biohazard. Descontamine superfícies de trabalho e equipamentos após o uso. Descartar todos os resíduos sólidos e líquidos como resíduos bio-perigosos, conforme os procedimentos institucionais.
- Infectar camundongos em P7 (5–6 dias após o transplante de células leucêmicas).
- Descongele uma aliquota do vírus no gelo, misture suavemente por inversão e mantenha no gelo durante o preparo. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento (use alíquotas de uso único).
- Prepare o mCMV a 2 × 10^5 unidades formadoras de placas (PFU)/mL em PBS e injete as pus intraperitonealmente (i.p.) com 1 × 10^4 PFU em PBS de 50 μL usando uma agulha de calibre 30. Injete no quadrante inferior direito do abdômen em um ângulo raso para evitar os órgãos abdominais.
ATENÇÃO: o mCMV é infeccioso (BSL-2). Use contenção e descontaminação adequadas. - Registre a identificação do animal, idade, grupo experimental, dose, volume e detalhes da injeção.
6. Imagem por bioluminescência (BLI)
NOTA: Realize BLI em P7 (5–6 dias após a injeção celular e antes da infecção) e em P17 (10 dias após a infecção), conforme descrito abaixo.
- Dissolva D-Luciferina em PBS a 10 μg·μL-1. Esterilize com filtro usando um filtro de 0,22 μm, aliquota, e armazene a −20 °C protegido da luz.
ATENÇÃO: D-luciferina é sensível à luz. Minimize a exposição à luz durante a preparação e uso. - Injete D-luciferina i.p. a 50 μL por filhote usando uma agulha de calibre 30.
- Anestesiar os filhotes com isoflurano (indução 3–4%, manutenção 1,5–2%) em oxigênio (0,8–1,0 L·min-1). Mantenha a temperatura corporal em um palco de imagem aquecido (aproximadamente 37 °C).
ATENÇÃO: O isoflurano é um anestésico volátil. Use um vaporizador aprovado e um sistema de coleta de saqueadores. - Coloque filhotes anestesiados em um sistema de imagem para pequenos animais (detalhes do instrumento fornecidos na Tabela de Materiais).
- Adquira imagens bioluminescentes e de raios X usando configurações de exposição consistentes 10 minutos após a injeção de D-luciferina (configurações BLI: tempo de exposição 120 s para imagens P7 e 30 s para P17, binning B4 para imagens P7 e B4 para imagens P17, campo de visão (FOV) 25, f-stop 1,2, altura do objeto 1,5 e configurações de raio-X: resolução alta, potência alta).
Ponto de Pausa: Armazene arquivos de imagens imediatamente após a imagem; A análise pode ser concluída posteriormente. - Analise imagens usando software de imagem BLI apropriado, definindo regiões de interesse (ROIs) que abrangem todo o corpo de cada camundongo e quantificando a luz emitida como fótons·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1.
- Exporte valores quantificados de ROI para análise estatística posterior.
7. Colheita de células leucêmicas de camundongos transplantados
- Colhe células leucêmicas e gere suspensões unicelulares conforme descrito na Seção 1.1.
8. Coloração e aquisição de citometria de fluxo
- Conte células e suspensões de centrífuga a 300 × g por 5 minutos a 4 °C e resuspenda a 1 × 10^7 células·mL-1 no buffer FACS.
- Transfira 100 μL (1 × 10^6 células) para tubos de citometria de fluxo de poliestireno.
- Adicione anticorpo bloqueador dos receptores Fc (anti-CD16/32; 1 μL por tubo) e incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Prepare a mistura mestre de anticorpos no buffer FACS e adicione a cada tubo CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC e marcadores negativos de linhagem (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP), 1 μL de cada anticorpo por 1 x 10^6 células em tampão FACS de 100 μL.
- Incube por 20 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
- Lave com um tampão FACS de 5 mL, centrifuge e ressuspenda em um tampão FACS de 200 μL contendo 7-AAD (3 μL) e contando esferas (6 μL; 6.000 esferas).
- Prepare controles de compensação com uma única coloração usando esferas ou células de captura de anticorpos e adquira controles junto com amostras experimentais.
- Adquira amostras em um citômetro de fluxo usando configurações padrão de detectores FITC/PE/APC/PerCP e uma vazão média. Colete eventos até que 1.000 contas sejam adquiridas.
- Exporte arquivos FCS e analise usando software de análise de citometria de fluxo (listado na Tabela de Materiais) usando a estratégia de gate estabelecida (Figura 2D).
- Calcule o número absoluto de células por baço ou medula óssea usando contagem de contas, multiplicando o número de eventos-alvo adquiridos em 1.000 esferas por um fator de escala de 6 (6.000 contas adicionadas), e normalizando para a celularidade total dos órgãos com base na fração de células coradas (1 × 10^6 células).
9. Plotar gráficos e análise estatística
NOTA: Gerar gráficos e realizar análises estatísticas para dados de BLI e citometria de fluxo usando um pacote de software estatístico (listado na Tabela de Materiais).
- Apresente os dados como média ± erro padrão da média (SEM).
NOTA: Nenhum animal foi excluído deste estudo. - Para BLI, compare os grupos PBS e mCMV separadamente em P7 e P17 usando testes de Mann–Whitney não pareados, com correção de Holm–Šídák aplicada para ajustar múltiplas comparações entre pontos de tempo.
- Analise os resultados da citometria de fluxo usando um teste de Mann–Whitney sem pareamento bilaterais.
- Defina significância estatística como p < 0,05.
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Resultados
A injeção de veias temporais permite o enfratemento neonatal eficiente de leucemia e neuroblastoma
Para modelar o impacto da infecção na infância na progressão do câncer pediátrico, células B-ALL marcadas com luciferase, derivadas de camundongos adultos Eμ-Ret leucêmicos, ou células NB derivadas de camundongos Th-Mycn moribundos, foram administradas por via intravenosa via veia temporal em filhotes sintéticos de 1 a 2 dias de vida. O transplante bem-sucedido foi confi...
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Discussão
Compreender como o desenvolvimento imunológico na infância da vida influencia a progressão do câncer é essencial para projetar estratégias imunomoduladoras adequadas à idade. Neste estudo, descrevemos uma plataforma reprodutível de transplante neonatal que permite o controle temporal preciso do transplante de células cancerígenas e da modulação imune durante uma janela crítica de imaturidade imunológico pós-natal. Ao combinar o parto intravenoso mediado por veias temporais com o BLI, ess...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esse trabalho foi apoiado por bolsas operacionais dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde para G.S.D.R. (MOP-126122). A.F. foi beneficiário de uma bolsa de pós-doutorado do Programa de Pesquisa do Câncer Infantil Michael Cuccione (MC3RP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100µL, Microliter Syringe, Luer Tip | Hamilton | 80601 | - |
| 30 G Needle | BD | 305106 | - |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | - |
| Ami-X imaging system | Spectral Instruments Imaging | - | - |
| anti-mouse B220- APC | Biolegend | 103212 | - |
| anti-mouse CD19-FITC | Biolegend | 152404 | - |
| anti-mouse CD3ε- PerCP | Biolegend | 100326 | - |
| anti-mouse Ly-51-PE | Biolegend | 108308 | Also called BP1 |
| anti-mouse TER119- PerCP | Biolegend | 116226 | - |
| anti-mouse/human CD11b- PerCP | Biolegend | 101230 | - |
| Aura software | Spectral Instruments Imaging | - | version 4.0.8 |
| BD Accuri C6 | BD | - | - |
| BD Fortessa X-20 | BD | - | - |
| Cleaning solution | Hamilton | 18310 | - |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 2770930 | 6 µL contains 6000 beads |
| D-Luciferin | GoldBio | eLUCK-1G | - |
| DMEM | Gibco | 11965092 | - |
| DNase I | Sigma | 1.13E+10 | - |
| Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged | FALCON | 352340 | - |
| FBS | Gibco | A5256701 | - |
| FlowJo software | BD | - | v10.8 |
| GeltrexTM | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | - |
| GraphPad Prism software | Dotmatics | - | v10.4.1 |
| LE.5209 Cold light source | Euromex | - | - |
| Liberase™ TM Research Grade | Sigma | 5.4E+09 | - |
| NSG mice | Jackson Labrotary | 5557 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ |
| Polybrene | Sigma | H9268-5G | - |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101301 | - |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | - |
Referências
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous Injections in Neonatal Mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread Gene Delivery and Structure-Specific Patterns of Expression in the Brain after Intraventricular Injections of Neonatal Mice with an Adeno-Associated Virus Vector. J Virol. 75 (24), 12382-12392 (2001).
- Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
- Farrokhi, A., et al. Early-life infection depletes preleukemic cells in model of hyperdiploid B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 144 (8), 809-821 (2024).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
- Pavathuparambil, A. M. N., et al. Facial vein injection of human cells in severe combined immunodeficiency (SCID) neonatal mice. MethodsX. 5, 1281-1286 (2018).
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