Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Ao estabelecer modelos em ratos de lesão do plexo braquial superior do tronco esquerdo ao nível das raizes, reparadas com enxerto nervoso ou transferência nervosa, descobrimos que ambos os grupos alcançaram força muscular semelhante; Os animais enxertados mostraram coordenação de movimento superior.
Lesões do tronco superior (C5-C6) do plexo braquial prejudicam a abdução do ombro e a flexão do cotovelo. Para rupturas C5-C6 com tocos proximais preservados, o enxerto nervoso (NG) permanece a abordagem convencional. As transferências nervosas (NT) representam a única opção viável nas avulsões C5-C6. O padrão global atual para NT envolve procedimentos de transferência tripla: nervo acessórios espinhal (SAN) para nervo supraescapular (SSN), procedimento de Oberlin e procedimento de Leechavengvong. Tendências clínicas recentes indicam uma ampliação das indicações da NT para incluir cenários de ruptura radicular, motivada pela justificativa de que a NT distal reduz significativamente a distância de regeneração axonal. Para possibilitar a comparação direta, este estudo estabeleceu dois modelos de ratos que simulam essas estratégias clínicas: 1) um modelo NG onde os tocos C5-C6 foram enxertados ao SSN e ao tronco superior; 2) um modelo NT múltiplo compreendendo os três procedimentos acima. A recuperação funcional (escore de Ochiai, teste de falha do pé de Barth e teste de tosa de Terzis), parâmetros eletrofisiológicos e a regeneração dos axônios sensoriais foram avaliados em 8 e 16 semanas pós-operatórias. Às 8 semanas, não havia diferenças estatisticamente significativas nos desfechos funcionais entre os grupos. Às 16 semanas, embora os escores de Ochiai e os resultados de Terzis permanecessem comparáveis, a NG demonstrou desempenho significativamente superior no teste de Barth. Eletrofisiologicamente, o NT apresentou taxas significativamente melhores de recuperação para os nervos musculocutâneo, axilares e supraescapulares às 8 semanas. No entanto, essas vantagens eletrofisiológicas deixaram de ser estatisticamente significativas às 16 semanas. Às 8 semanas, a NG já carregava mais axônios sensoriais regenerados nos nervos musculocutâneos e axilares, enquanto as contagens de SSN eram semelhantes. Às 16 semanas, a NG superou a NT em número de axônios sensoriais para os três nervos. Esses achados em um modelo de rato de transeção aguda C5-C6 indicam que, dentro de um período pós-operatório de 16 semanas, a NG alcança uma recuperação funcional e eletrofisiológica comparável à NT, ao mesmo tempo em que proporciona uma restauração superior da função sensorial e motora coordenada. No entanto, são necessários estudos adicionais com acompanhamento mais longo para determinar a relevância translacional desses achados.
Lesões do plexo braquial são geralmente classificadas em lesão do tronco superior (C5–C6, com ou sem envolvimento do C7), lesão do tronco inferior (C8–T1) e lesão do plexo pan-aberto (C5–T1). Uma força compressiva direcionada à cabeça e ao ombro normalmente causa uma lesão na parte superior do tronco. Como os ligamentos transforaminais superiores nos níveis radiculares C5–C7 dissipam parcialmente a transmissão ascendente da força traumática, a ruptura dessas raízes — especialmente C5 — no forame intervertebral não é incomum1. No entanto, violência severa ainda pode resultar em avulsões radiculares e pode até se estender à parte inferior do tronco. Quando o membro superior é forçadamente distraído no plano horizontal, predominam avulsões radiculares do tronco inferior; Com maior força, pode ocorrer avulsão completa do plexo braquial. Devido à ausência de ligamentos transforaminais superiores protegendo as raízes C8–T1, praticamente todas as lesões traumáticas da parte inferior do tronco são avulsõesradiculares 2. Portanto, em relação ao padrão de lesão radicular, as raízes C5–C6 têm maior probabilidade de romper, enquanto as raízes C7–C8–T1 são mais propensas à avulsão. Essas características patoanatômicas são fundamentais para a escolha da estratégia cirúrgica adequada.
Lesões na parte superior do tronco são caracterizadas clinicamente pela perda de abdução do ombro e flexão do cotovelo. Em pacientes com rupturas C5–C6 nos quais ainda estão presentes tocos radiculares proximais viáveis, a estratégia convencional tem sido o enxerto nervoso (NG): as raízes residuais de C5 e C6 são conectadas — geralmente com autoenxertos surais — às divisões anterior e posterior do tronco superior e ao nervosupraescapular 3. Quando as raízes C5 e C6 são avulsadas, a transferência nervosa (NT) torna-se a única opção reconstrutiva. O algoritmo cirúrgico adotado pela maioria dos centros no mundo combina três procedimentos: o nervo acessório espinhal ao nervo supraescapular, um fascículo do nervo ulnar ao ramo bíceps do nervo musculocutâneo (procedimento de Oberlin) e o ramo longo da cabeça do tríceps do nervo radial ao ramo anterior do nervo axilar (procedimento de Leechavengvongs).
Na última década, as indicações para NT na reconstrução do plexo braquial se ampliaram progressivamente: alguns autores agora defendem técnicas de transferência mesmo para rupturas radiculares, argumentando que transferências distais encurtam significativamente a distância regenerativa e, assim, aceleram a recuperaçãomotora 5,6,7. Até o momento, porém, esses relatórios focaram exclusivamente nos resultados de força muscular pós-operatória; Avaliações de destreza e movimento coordenado, variáveis que determinam criticamente a qualidade da recuperação funcional, permanecem ausentes.
Considerando que tocos radiculares residuais contêm uma proporção maior de fibrassensoriais 8 e evitam a necessidade de remapeamento cortical a longa distância após areconstrução 9, hipotetizamos que, para rupturas pós-ganglionares C5–C6, a NG usando os tocos radiculares viáveis de C5–C6 como fonte de axônios regeneradores resulta em uma qualidade geral superior de recuperação funcional em comparação com NT. Como o rato é amplamente aceito como o modelo experimental ideal para lesão e reparação do plexobraquial 10,11,12, estabeleceremos dois modelos adultos de lesões pós-ganglionares C5–C6 reconstruídas com NG ou NT, respectivamente. Avaliações comportamentais, eletrofisiológicas e contagens de axônios sensoriais regenerados serão empregadas para comparar os dois grupos e testar a hipótese apresentada.
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Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Ética do Departamento de Ciências de Animais de Laboratório da Universidade Fudan (Aprovação nº: 2019 Hospital Huashan JS-008).
Estabelecimento do modelo do rato
Lesão por ruptura do tronco superior do lado esquerdo
A temperatura ambiente era mantida entre 23 e 25 °C. Ratos Sprague-Dawley foram anestesiados com pentobarbital de sódio intraperitoneal a 1% (0,4 mL/100 g de peso corporal). Após a indução da anestesia, o rato era colocado em posição supina sobre a tábua de operação, com os membros anteriores abduzidos 90° do tronco. O pescoço, peito, axila e, apenas em animais NG, ambos os membros posteriores foram raspados. A pele foi desinfetada com povidona-iodo. Foi feita uma incisão cervical de 3 cm na linha média da cartilagem cricoide até a borda superior do manúbrio esterni. Sob um microscópio cirúrgico, o tecido subcutâneo e a fáscia profunda foram dissecados camada por camada para expor os músculos esternohioide, esternomastoide, peitoral maior e peitoral menor. Esses quatro músculos eram retraídos usando retratores estéreis e personalizados em forma de clipe de papel. As extremidades distais dos retratores eram fixadas à placa de operação com elásticos, e a tensão era ajustada para obter a exposição ideal enquanto protegia a veia jugular interna. Os músculos escalenos anterior e médio foram identificados, e a porção supraclavicular do plexo braquial no espaço interescaleno foi exposta (Figura 1A). As raízes C5 e C6 foram seccionadas 5 mm distal em relação aos respectivos forames intervertebrais, depois um segmento de 5 mm foi ressecado para criar uma lacuna definida (Figura 1B). No grupo NT, os tocos proximais de C5 e C6 foram suturados ao tecido mole adjacente para impedir que axônios regeneradores entrassem na via distal.
Estabelecimento do modelo NG
Foi feita uma incisão em forma de L ao longo da face dorsolateral da pata traseira, atravessando a maléola lateral e subindo pela parte lateral da perna inferior. Sob um microscópio cirúrgico, o tecido subcutâneo e a fáscia profunda foram dissecados camada por camada, cuidando para proteger a pequena veia safena, e então o nervo sural foi exposto e coletado. Os nervos surais bilaterais tinham um comprimento total de 8 cm. Após aparar o tecido conjuntivo perineural, cada nervo foi dividido em oito segmentos de 1 cm. O nervo supraescapular foi seccionado em sua origem a partir do tronco superior. Um enxerto foi usado para fazer a ponte do C5 ao nervo supraescapular; três enxertos de C5 e quatro enxertos de C6 para o tronco superior (Figura 1C).
Estabelecimento do modelo NT
A incisão cervical da linha média foi estendida aproximadamente 2,5 cm distalmente em direção ao braço superior. No ponto onde emerge o ramo cutâneo do peitoral lateral, o músculo peitoral maior foi inciso na direção da fibra, entre o peitoral maior e o bíceps. O peitoral menor mais profundo foi dissecado de forma contundente para expor os cordões do plexo braquial que passam sob o peitoral maior. O nervo ulnar surge da medula medial e segue o curso mais medialmente dentro do segmento da medula (Figura 1D). O nervo musculocutâneo origina-se na medula lateral, passa sob a borda inferior da rejeita maior para o braço e, finalmente, entra no músculo bíceps braquial, correndo mais lateralmente dentro do segmento da medula (Figura 1D). O nervo radial se origina na medula posterior, passa sob a borda inferior do tendão do dorsal grande até o braço posterior e produz três ramos que irrigam as cabeças longa, medial e lateral do tríceps. O nervo axilar também surge da medula posterior, atravessa o espaço quadrangular e se divide em ramos anterior e posterior que inervam o músculo deltóide.
Transferência do nervo acessório espinhal para o nervo supraescapular
O músculo esternocleidomastoide foi retraído dentro da incisão cervical da linha média para expor o nervo acessórios da coluna. O nervo emerge por baixo do músculo digástrico, alcança o terço médio da borda medial esternocleidomastoide, emite o ramo esternocleidomastoideo, continua ao longo da borda posterior desse músculo e desce lateralmente no pescoço para inervar o trapézio. O ramo esternocleidomastoide foi cortado para eliminar a tração no nervo acessório que, de outra forma, poderia perturbar o local de coaptação após a transferência. O ramo trapézio era dividido em seu ponto de entrada no músculo. O nervo supraescapular foi seccionado em sua origem distal ao tronco superior. O ramo trapézio do nervo acessório foi coaptado ao nervo supraescapular com uma única sutura sintética de polipropileno 10-0 (Figura 1E).
Transferência do fascículo do nervo ulnar para o ramo motor do bíceps do nervo musculocutâneo (procedimento de Oberlin)
O tronco principal do nervo musculocutâneo foi mobilizado distalmente até que todo o ramo motor do bíceps estivesse totalmente exposto. No nível do terço médio do ramo motor do bíceps, um fascículo de 6 mm do lado lateral do nervo ulnar foi colhido, e sua extremidade distal foi abruptamente seccionada. O ramo motor do bíceps foi seccionado em sua origem a partir do tronco nervoso musculocutâneo. O fascículo ulnar mobilizado foi acoplado ao ramo motor do bíceps com uma única sutura sintética de polipropileno 10-0. A exposição completa do ramo motor do bíceps serve a dois propósitos: (1) identificar o local exato para a colheita do fascículo do nervo ulnar e (2) garantir uma coaptação sem tensão após a transferência (Figura 1F).
Transferência do ramo radial do tríceps de cabeça longa para o ramo anterior do nervo axilar (procedimento de Leechavengvongs)
O rato foi reposicionado na posição deitado com o membro anterior abduzido 90° em relação ao tronco. A parte dorsal do braço superior esquerdo foi raspada e desinfetada. Foi feita uma incisão longitudinal de 3,5 cm na face dorsal do braço superior esquerdo, estendendo-se da articulação do ombro até o nível médio-humeral. Sob o microscópio cirúrgico, o tecido subcutâneo e a fáscia profunda foram dissecados camada por camada. O músculo deltóide foi retraído para expor o espaço quadrangular subjacente, onde o tronco principal do nervo axilar e os vasos humerais circunflexos posteriores acompanhantes foram vistos saindo desse espaço. O nervo axilar foi mobilizado distalmente até que todas as divisões anterior e posterior estivessem totalmente expostas, pouco antes de entrarem no ventre do músculo deltóide. Dentro da mesma incisão, o tronco principal do nervo radial foi identificado entre as cabeças longa e lateral do tríceps. O nervo radial foi mobilizado distalmente até que todo o ramo motor até a cabeça longa do tríceps estivesse claramente visualizado (Figura 1G). O ramo do tríceps de cabeça longa era cortado em sua entrada no músculo e refletido proximalmente para aproximar o ramo anterior do nervo axilar. O ramo anterior do nervo axilar foi seccionado em sua origem a partir do tronco principal, e refletido distalmente. O ramo do tríceps de cabeça longa para o ramo anterior do nervo axilar foi coaptado com uma única sutura sintética de polipropileno 10-0 (Figura 1H).
Após a conclusão de todas as reconstruções nervosas, cada campo cirúrgico foi irrigado com soro fisiológico estéril, e cada local de coaptação foi meticulosamente inspecionado para confirmar a integridade. Todas as incisões foram fechadas em camadas: o músculo peitoral maior foi aproximado com suturas de seda 5-0 não absorvíveis (necessárias apenas na incisão cervical do grupo NT), seguidas pela fáscia subcutânea e pele. Como toda coaptação nervosa foi realizada sem tensão, a imobilização pós-operatória dos membros superiores foi desnecessária.
Avaliação comportamental
Ochiai pontuação13
O rato era levantado pela cauda de modo que seu corpo ficasse suspenso 30 cm acima da mesa, e a postura dos dois membros anteriores era observada. O rato foi colocado em uma pista confinada (50 cm de comprimento × 10 cm de largura) sobre a mesa para observar a marcha do membro anterior enquanto caminhava. Toda a pista foi coberta com papel branco, e a ponta de partida foi umedecida com tinta preta. À medida que o rato avança, pegadas claras são obtidas. 0 pontos – quando suspensos, ambos os membros anteriores ficam retos em direção ao chão de forma relaxada (Figura 2A-1); durante a caminhada, nenhum dos membros anteriores é arrastado (Figura 2A-2). 1 ponto – quando suspenso, o membro anterior afetado é levemente aduzido e flexionado (Figura 2B-1); ao caminhar, observa-se um arrastar leve devido à flexão limitada dos cotovelos (Figura 2B-2). 2 pontos – quando suspenso, o membro anterior afetado está totalmente flexionado e aduzido (Figura 2C-1); durante a caminhada, é evidente arrastar severamente (Figura 2C-2).
Teste de falha do pé de Barth13
Uma grade metálica horizontal (50 cm × 38 cm) foi preparada elevada 11 cm acima da mesa; cada quadrado de grade mede 1,5 cm. O rato foi colocado na grade; sempre que o membro anterior afetado escorrega por uma abertura de grade, é registrado como uma "falha do pé" (Figura 3). O número de falhas no pé feitas pelo membro afetado em 2 minutos foi contado.
Teste de tosa de Terzis14
O rato foi colocado em uma caixa de observação transparente aberta. Aproximadamente 1–3 mL de soro fisiológico normal foram pulverizados no focinho e no rosto do rato, e foram observadas tentativas de remover as gotículas de água.
Grau 0 – sem resposta do membro afetado.
Grau 1 – o membro afetado flexiona no cotovelo e alcança a boca, mas não consegue alcançar o nariz (Figura 4A).
Grau 2 – o membro afetado alcança o nariz (Figura 4B).
Grau 3 – o membro afetado alcança acima do nariz, mas não alcança o olho (Figura 4C).
Grau 4 – o membro afetado alcança o olho, mas não alcança o ouvido (Figura 4D).
Grau 5 – o membro afetado alcança a orelha ou atrás dela (Figura 4E).
Potencial de ação muscular composto (CMAP)
O rato foi anestesiado, imobilizado e preparado conforme descrito anteriormente no protocolo, e a porção supraclavicular e o segmento da corda do plexo braquial foram expostos. O eletrodo preto da agulha de registro era inserido na barriga do músculo alvo (bíceps braquial, deltóide ou infraespinoso). O eletrodo vermelho de gravação era inserido na junção tendão-músculo do mesmo músculo. O eletrodo de referência verde foi colocado entre os eletrodos preto e vermelho (Figura 5). Todos os eletrodos são inseridos a uma profundidade de 2 mm, e sítios de inserção idênticos são usados em ambos os lados. O nervo foi suavemente elevado com o eletrodo estimulante para teste. Foi entregue um único pulso de onda quadrada com intensidade de 0,5 mA e duração de 0,2 ms; A latência e amplitude do CMAP foram registradas. O lado contralateral (saudável) foi usado como referência (atribuído a 1). A taxa de atraso de latência ([latência do lado afetado/latência do lado saudável] × 100%) e a taxa de recuperação de amplitude ([amplitude do lado afetado/amplitude do lado saudável] × 100%) foram calculadas.
Coloração por Imunofluorescência
Fibras mielinizadas foram marcadas com anti-neurofilamento 200 (NF200); entre elas, fibras mielinizadas motoras foram distinguidas pela co-marcação com a acetiltransferase anti-colina (ChAT). Fibras positivas para NF200, mas negativas para ChAT foram, portanto, classificadas como fibras mielinizadassensoriais 15.
Para o grupo do enxerto nervoso, o tronco principal dos nervos musculocutâneo, axilar e supraescapular foi colhido distal até o segundo local de sutura no membro afetado. Para o grupo de transferência nervosa, o ramo bíceps do nervo musculocutâneo, o ramo anterior do nervo axilar e o nervo supraescapular foram levados distalmente em relação aos respectivos locais de coaptação. Um segmento de 3 mm de cada nervo foi imerso em paraformaldeído a 4% e fixado a 4 °C por 24 horas.
Os espetáculos eram orientados perpendicularmente ao eixo longitudinal, embutidos em parafina e seccionados em série a 3 μm. Após a deparafinização, a recuperação de antígeno foi realizada em tampão EDTA 0,01 M (pH 8,0) usando um micro-ondas. As seções foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários diluídos em PBS (ChAT, 1:200; NF200, 1:500), seguido por lavagens com PBS e incubação de 50 minutos em temperatura ambiente com anticorpos secundários (anti-coelho conjugado com Cy3, 1:300; Alexa Fluor 488-conjugado para cabras anti-camundongo, 1:400) protegida contra a luz. Núcleos foram contra-coloridos com DAPI. Seções transversais inteiras de cada nervo foram fotografadas sob um microscópio de fluorescência equipado com scanner de lâminas.
NF200 foi visualizado com fluorescência verde e ChAT com fluorescência vermelha; Perfis NF200-positivo/ChAT-negativo foram contabilizados como fibras mielinizadas sensoriais. Cinco seções selecionadas aleatoriamente de cada nervo foram analisadas com o ImageJ. O número total de fibras mielinizadas sensoriais em toda a seção transversal foi contado para cada seção, e o valor médio das cinco seções foi tomado como a contagem final para aquela amostra nervosa.
Análise estatística
O tamanho da amostra (n = 8 por grupo) foi calculado prospectivamente com G*Power usando o tamanho do efeito piloto de contagem de axônios sensoriais (d de Cohen = 2,31) para obter ≥ 80% de potência a α = 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism. Os dados são apresentados como mediana (intervalo interquartil) [M (p25–p75)]. Comparações entre grupos foram realizadas com o teste Mann-Whitney U. Um valor P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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No primeiro dia pós-operatório, tanto ratos NG quanto NT apresentaram perda completa de abdução do ombro e flexão do cotovelo no membro operado; Quando a parte dorsal do membro anterior afetado foi picada enquanto o animal estava contido, nenhum dos grupos apresentou retirada ou vocalização. Com 8 semanas, a função do ombro e cotovelo melhorou em ambos os grupos; O mesmo estímulo agora provocava a abstinência. Às 16 semanas, uma recuperação adicional — embora ainda incompleta — foi obser...
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O objetivo deste estudo foi testar nossa hipótese de que a reconstrução de lesões do plexo braquial usando enxerto residual da raiz nervosa produz um resultado geral superior em comparação com a transferência nervosa. Ratos adultos com rupturas C5–C6 foram divididos em dois grupos: um passou por reconstrução do tronco superior por enxerto nervoso, e o outro por transferência do nervo acessório da coluna vertebral, do ramo tríceps de cabeça longa do nervo radial e de um fascículo do nervo...
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Os autores não têm nada a revelar.
Este estudo foi patrocinado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82201525, para JS).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1× Solução de Coleta de Antígeno de Citrato | Servicebio | G1219-1L | |
| 1× Solução de Recuperação de Antígeno Tris-EDTA (ph 8.0) | Servicebio | G1207-1L | |
| 1× Solução de Recuperação de Antígeno Tris-EDTA (ph 9.0) | Servicebio | G1218-1L | |
| 10-0 PROLENE | Johnson & Johnson Med Tech | W2790 | |
| 5-0 MERSILK | Johnson & Johnson Med Tech | SA82G | |
| Alexa Fluor 488-conjugado Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Servicebio | GB25301 | |
| Anti-160 kDa Neurofilamento Médio de Mouse mAb | Servicebio | GB12763-100 | |
| Anti-Colina Acetiltransferase PAb do Coelho | Servicebio | GB11070-1-100 | |
| Agente de Revestimento Antifluorescente | Servicebio | G1401 | |
| Albumina Sérica Bovina | Servicebio | GC305010-5g | |
| ChAT | Servicebio | GB11070-1 | |
| Cy3 conjugado Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Servicebio | GB21303 | |
| DAPI | Servicebio | G1012-10 | |
| Máquina de embedding | GET Electronics (Hui ZHOU) Co., Ltd. | JB-P5 | |
| Microscópio de fluorescência | Nikon | Eclipse C1 | |
| Eletromiógrafo de quatro canais | Dantes | DT440 | |
| G*Power | Universidade Heinrich Heine Dü Sseldorf | 3.1.9.7 | |
| Controlador de Câmera de Alta Velocidade | Nikon | DS-U3 | |
| ImageJ | Institutos Nacionais de Saúde | 1.8.0 | |
| Instrumentos microcirúrgicos | Fábrica de Microinstrumentos de Ningbo Chenghe | 6804 | |
| Micro-ondas | Galanz | P70D20TL-P4 | |
| Microscópio operador | Fábrica de Instrumentos Ópticos Médicos de Xangai | SXP-1B | |
| Pipeta | Eppendorf | 100221588457 | |
| Prisma | GraphPad & nbsp; Software | 10.1.2 | |
| Microtomo Rotativo | Leica | RM2016 | |
| Scanner | Epson | V300 | |
| Rato-de-Dawley de Sprague | Animal de Laboratório Shanghai Sippe-Bk | OR-1001 | |
| Extinção de Autofluorescência de Teiduis | Servicebio | G1221-5ML | |
| Caneta de Marcação de Tecidos | Tecnologia Genética | GT1001 |
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