Artigo de método

Abordagem Multimodal para Avaliar a Regeneração Óssea e o Desempenho em Andaimes

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DOI:

10.3791/69483

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13 de fevereiro de 2026

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1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

Neste artigo

Resumo

Propomos um protocolo para avaliar a regeneração óssea em vários níveis hierárquicos. Essa abordagem multimodal permite a análise estrutural em diferentes escalas de comprimento, enfrentando efetivamente os desafios na preparação da amostra. Também oferece um fluxo de trabalho confiável para avaliar a eficácia dos biomateriais na promoção da regeneração óssea.

Resumo

O sucesso clínico de um implante depende em grande parte de sua capacidade de promover a reparação óssea e facilitar a osteointegração. Embora avanços significativos tenham sido feitos no design de novos andaimes, uma avaliação minuciosa do sucesso do implante em várias escalas de comprimento ósseo ainda não foi suficientemente investigada. O osso é um tecido organizado hierarquicamente, com uma estrutura intrincada que vai desde a organização das fibrilas de colágeno e sua mineralização nas escalas de nanômetro e micrômetro até a disposição macroscópica do osso compacto e canceloso. Essa organização hierárquica é crucial para garantir a função óssea e o desempenho mecânico. Nesse contexto, uma avaliação abrangente dos efeitos dos biomateriais na reparação óssea em múltiplas escalas de comprimento é essencial para avaliar a eficácia e a segurança dos materiais implantados. No entanto, preparar amostras para análises multimodais integradas apresenta um desafio técnico. Neste trabalho, apresentamos um protocolo projetado para avaliar a regeneração óssea em vários níveis hierárquicos e analisar a interface entre o osso recém-formado e o andaime implantado. Essa abordagem oferece um método robusto para avaliar a eficácia dos andaimes na indução da reparação óssea. A combinação de técnicas selecionadas de imagem 3D e 2D é crucial para uma avaliação adequada do tecido mineralizado complexo que se forma durante o processo de cicatrização óssea

Introdução

Osso é um tecido complexo e organizadohierarquicamente 1,2. Compreender sua organização estrutural é essencial para abordar questões fundamentais relacionadas a como as células contribuem para a arquitetura dos tecidos e como as mudanças estruturais impactam a função mecânica3. Nesse contexto, a remodelação óssea após uma lesão continua sendo um tema central de investigação. A cicatrização de fraturas é um processo complexo em múltiplas etapas, que começa com uma resposta inflamatória inicial, seguida pela angiogênese e pela diferenciação das células progenitoras em condrócitos e osteoblastos 4,5. Muito tem sido debatido sobre o papel dos biomateriais em estimular a osteointegração, especialmente sobre biocompatibilidade e sua capacidade de prevenir o encapsulamentofibroso 6.

Um método comumente adotado para avaliar osteointegração estimulada por biomateriais é a microscopia óptica, que permite análises histológicas quantitativas e qualitativas. Essa abordagem demonstrou ser uma forma confiável e eficaz de avaliar o sucesso dos implantesósseos 7,8. No entanto, várias questões relacionadas à organização hierárquica óssea não podem ser exploradas usando uma única abordagemde imagem, especialmente a histológica, que é limitada ao menos em parte pela restrição de ampliação do método.

Avanços em imagem tridimensional têm se mostrado essenciais para entender a organização hierárquica óssea. Técnicas como tomografia microcomputorizada (microCT; radiação síncrotron ou fontes convencionais de raios X de laboratório)9,10,11, microscopia eletrônica de varredura de feixe duplo (FIB-SEM) associada à tomografia de corte evisualização 12,13,14 e tomografia eletrônica de transmissão 15,16 forneceram novos insights sobre a arquitetura óssea em múltiplas escalas.

Com base em diferentes abordagens de imagem 3D, foi proposto um modelo de organização hierárquica óssea, que inicialmente identificou nove níveis distintos de organização estruturalóssea 1. Esse esquema foi recentemente revisado e expandido para abranger aproximadamente 12 níveis hierárquicos, servindo como uma referência valiosa para explorar a relação entre estrutura e função no tecidoósseo 2,17. Importante, esse modelo hierárquico proposto fornece uma base para avaliar o sucesso do reparo ósseo após lesões. Avaliar se o tecido ósseo regenerado reproduz a estrutura hierárquica nativa é um padrão fundamental para avaliar a qualidade da cicatrização óssea, especialmente quando biomateriais são usados no local danificado.

Embora o uso de múltiplas técnicas de imagem para investigar a organização óssea tenha sidodiscutido 6,7,18,19,20, pouco foi explorado sobre um fluxo de trabalho que integre diferentes modalidades de imagem para avaliar a organização mineral óssea em múltiplas escalas espaciais. Como mencionado, o osso é um tecido composto complexo, composto por uma fase orgânica (células, colágeno e macromoléculas) e uma matriz mineralizada. Do ponto de vista da preparação da amostra, essa complexidade apresenta desafios técnicos relacionados à permeação do solvente através da amostra, à separação de uma amostra dura e à integração de diferentes estratégias de imagem na mesma amostra.

A principal inovação neste trabalho é o estabelecimento de um fluxo de trabalho de imagem reproduzível, correlativo e multiescala, utilizando técnicas tridimensionais e complementares. Como ilustrado na Figura 1A, o fluxo de trabalho é projetado para que a mesma amostra possa ser examinada sequencialmente usando diferentes modalidades de imagem. Como algumas dessas técnicas são destrutivas ou exigem secção, o fluxo de trabalho segue uma ordem que começa com métodos não destrutivos e avança para abordagens que envolvem corte ou remoção de material.

Esse fluxo de trabalho de preparação e análise de amostras é amplamente aplicável a amostras duras ou mineralizadas, incluindo osso cortical e trabecular, andaimes pré-implantacionais e a avaliação da interface osso/biomateriais após a implantação. Ao combinar modalidades de imagem que abrangem diferentes campos de visão e faixas de resolução (Figura 1B), o fluxo de trabalho permite a análise de amostras desde a escala centímetro até as escalas micrômica e nanômetra. Embora a sequência seja otimizada para suportar a análise correlativa de um único espécime, cada técnica também pode ser aplicada independentemente de acordo com o objetivo experimental. Essa abordagem permite uma avaliação detalhada da osteointegração dos biomateriais e da avaliação do crescimento ósseo regenerado na área de cicatrização.

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Protocolo

Os resultados apresentados neste protocolo foram obtidos a partir de um procedimento experimental realizado em um estudoanterior 21. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes éticas do Comitê Ético para o Uso e Cuidado de Animais Experimentais da Universidade Federal Fluminense, Brasil (CEUA/UFF: 779). Brevemente, 20 ratos Wistar machos pesando entre 300 e 400 g foram aleatoriamente divididos em dois grupos: implantação sham e cHA-microsfera. Todos os animais passaram por cirurgia na qual foi criado um defeito de 2 mm na diáfise tibial. O grupo Sham serviu como controle de coágulos para avaliar a regeneração óssea em um defeito não crítico, enquanto o grupo experimental recebeu microesferas CHA37 implantadas no local do defeito. Após 7 e 21 dias, os animais foram eutanasiados com uma overdose de anestesia geral, e bloqueios do osso tibial de cada grupo e momento (7 e 21 dias) foram coletados. A qualidade óssea e a extensão do osso recém-formado foram avaliadas por microscopia óptica e microtomotomografia.

1. Fixação de amostras e embedding de resina

  1. Imediatamente após a eutanásia, remova a tíbia contendo o biomaterial implantado e transfira-a para um frasco contendo solução fixadora de Karnovsky (2,5% glutaraldeído, 4% formaldeído em tampão cacodilato 0,1 M). Armazene a amostra a -4 °C por pelo menos 1 dia.
    NOTA: Prepare e manuseie o fixador sob uma exaustão exaustiva para evitar a exposição a substâncias voláteis. Todo manuseio químico deve ser realizado utilizando equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, e medidas técnicas adicionais de segurança devem ser implementadas sempre que necessário.
  2. Transfira a amostra do fixativo para um frasco contendo 0,1 M de tampão cacodilato. Mantenha a amostra em rotação suave, trocando o buffer 2x em intervalos de 10 minutos. Nessa etapa, apare as bordas da amostra usando uma pequena serra para facilitar a infiltração de resina. Ao cortar a amostra, mantenha-a úmida no tampão de cacodilato de 0,1 M para evitar que ela seque.
    NOTA: Sempre mantenha a amostra em um volume de buffer que seja pelo menos 2x o volume da amostra. Isso deve ser seguido para todas as soluções e resinas usadas neste protocolo. Ao manusear os componentes químicos mencionados acima, trabalhe dentro de uma exaustão e use o EPI adequado. Recolha a solução fixadora e os resíduos do tamponador cacodilato em recipientes claramente rotulados, quimicamente compatíveis, com tampas devidamente ajustadas. Siga os Procedimentos Operacionais Padrão (SOPs) institucionais para o armazenamento e descarte seguros de resíduos químicos perigosos.
  3. Inicie o processo de desidratação usando concentrações crescentes de acetona (10%, 30%, 50%, 70%, 90% e 100%). Mantenha a amostra sob rotação por 30 minutos em cada concentração. Repita o passo 100% de acetona anidro 3 vezes.
    NOTA: Ao manusear acetona, trabalhe dentro de uma exaustão e use o EPI adequado. Após usá-lo, recolha qualquer solvente residual em recipientes de resíduos claramente rotulados e quimicamente compatíveis, com tampas devidamente ajustadas. Siga os procedimentos padrão institucionais para o armazenamento e descarte seguros de resíduos químicos perigosos.
  4. Infiltre-se com resina de esporão transferindo a amostra por uma série de razões acetona-resina graduadas: 2:1, 1:1, 1:2 e, por fim, resina pura. Cada etapa deve durar 12 horas e ser realizada em rotação em temperatura ambiente. Após a infiltração graduada de acetona para resina, troque a resina pura 2x. Por fim, transfira a amostra para um molde contendo resina pura e polimerize a amostra a 70 °C por 24 horas.
    NOTA: A resina foi preparada de acordo com a ficha técnica para alcançar dureza média. Ao manusear resina de esporão, trabalhe dentro de uma exaustão e use EPI adequado. Após o uso, recolha qualquer resíduo em recipientes de resíduos claramente rotulados e quimicamente compatíveis, com tampas devidamente ajustadas. Siga os procedimentos padrão institucionais para o armazenamento e descarte seguros de resíduos químicos perigosos.

2. Visualização de amostras usando tomografia de raios X microcomputadorizada (microCT)

NOTA: a microCT é usada para avaliar o posicionamento do implante e a regeneração óssea. Também ajuda a identificar regiões potenciais de interesse para análises adicionais. Essa etapa deve ser realizada com a amostra embutida na resina.

  1. Utilize um suporte de amostra fornecido pelo fabricante como base, garantindo que a amostra esteja posicionada de forma segura para evitar movimentos durante o escaneamento. Use materiais de baixa densidade para suporte, como poliestireno, gaze ou tubos de microcentrífuga.
  2. Visualize usando os seguintes parâmetros ótimos de varredura: tensão/corrente da válvula = 60 kV/133 mA; passo angular = 0,33°; média de quadros = 5; Tamanho voxel = 5 μm; modo de rotação = 180°. Para amostras contendo implantes metálicos, use uma rotação de 360° e um filtro de alumínio de 0,5 mm.
    NOTA: Durante a regeneração óssea, a espessura do osso tecido trabecular normalmente está dentro dos limites de resolução da microTC convencional. Para quantificar com precisão os parâmetros morfométricos convencionais do osso trabecular, como espessura, separação e número trabecular, recomenda-se usar o menor tamanho de voxel (5 μm, conforme especificado). Se a Região de Interesse (ROI) exceder o Campo de Visão (FOV) nessa resolução nominal, primeiro use o recurso multiscan para tile o ROI. Considere aumentar o tamanho do voxel apenas como último recurso se o ROI não puder ser capturado via multiscan.
  3. Após a varredura, os dados brutos de aquisição consistem em uma série de arquivos de imagem numerados. Realize a reconstrução usando o software fornecido pelo fabricante, com foco em minimizar artefatos na região de interesse da amostra.
    NOTA: É comum encontrar artefatos de imagem ao longo das bordas das imagens, especialmente em áreas que não serão analisadas. O volume final pode ser cortado usando o software do fabricante para eliminar essas regiões.
  4. Analise o volume reconstruído usando várias opções de software de visualização 3D, como Avizo, VGStudio Max, CTVox eDragonfly 22. Aplique filtros digitais de imagem para remover artefatos. Nesse caso, use o método de Denoising de Meios Não Locais para essepropósito 19.
    NOTA: Meios não locais de desruido dos valores de suavização do filtro devem ser mantidos o mais baixos possível, para não prejudicar os detalhes importantes da interface.

3. Preparação da amostra para microscopia óptica

  1. Selecione a direção de seção da amostra de acordo com o objetivo experimental. A tíbia pode ser seccionada transversal ou longitudinalmente ao longo do eixo longo do osso. Use corte transversal para produzir seções seriadas que cobrem todo o volume do defeito. A seção longitudinal é apropriada para avaliar a regeneração óssea ao longo da direção do eixo longo. No entanto, essa abordagem fornece apenas uma única seção do defeito.
    1. Use um disco de serra diamantado de baixa velocidade para seccionar a amostra em fatias de 1 mm, seguindo a estratégia experimental.
      NOTA: Recomenda-se usar um disco de diamante com espessura de 0,006 a 0,012 polegadas. Lâminas mais finas permitem cortes altamente precisos, com perda mínima de material devido à espessura da lâmina.
    2. Encha o reservatório líquido até que o nível do fluido cubra a borda inferior da pá.
      NOTA: Água destilada é adequada para amostras ósseas. No entanto, se houver aquecimento excessivo, como em amostras contendo implantes metálicos, use o óleo fornecido pelo fabricante do equipamento para preencher o reservatório.
    3. Fixe a amostra no suporte da amostra e prenda-a ao braço do instrumento. Certifique-se de que a amostra esteja estável e horizontal em relação à superfície do disco. Use os botões de posicionamento para ajustar a região de corte da amostra ao disco.
    4. Comece a cortar a amostra usando configurações de velocidade mais altas (210 - 250 RPM) e aplique baixa pressão até que uma marca se forme na amostra. Depois, reduza a velocidade (para 93 - 124 RPM) para completar a seção de forma suave e evitar vibrações excessivas.
    5. Pare a serra imediatamente após o corte terminar. Ajuste o sistema corretamente para garantir que o corte pare assim que a amostra for destacada do bloco original.
  2. Examine a amostra usando um estereoscópio. Comece com baixa ampliação (por exemplo, 5x-10x) para inspecionar toda a amostra, depois aumente a ampliação (por exemplo, 20x-40x) para selecionar a região de interesse conforme a questão científica. A faixa exata de ampliação pode variar dependendo do instrumento utilizado. Neste trabalho, regiões que apresentam maior densidade de interfaces entre ossos recém-formados e o biomaterial foram selecionadas para análises adicionais.
  3. Montagem de amostras para desbaste
    1. Monte a amostra em um suporte para facilitar o manuseio adequado durante o polimento. Se a amostra for destinada exclusivamente à análise por microscopia óptica, prenda-a diretamente a uma cobertura plástica usando supercola no lado previamente polido.
      NOTA: Slides plásticos são recomendados devido à sua melhor aderência. Slides de vidro também podem ser usados (após lavagem extensa com sabão neutro). No entanto, lâminas de vidro aumentam o risco de descolamento da amostra durante o polimento.
    2. Para amostras que serão analisadas posteriormente usando uma abordagem correlativa, monte-se em um conjunto de tubos de alumínio em duas partes. Nesse protocolo, foi desenvolvido um conjunto caseiro de tubos de alumínio, consistindo em um cilindro sólido interno com diâmetro de 2,5 cm e um cilindro oco externo que fornece suporte mecânico durante o polimento. A amostra é acoplada ao cilindro sólido interno.
    3. Coloque o cilindro interno de alumínio sobre uma placa quente e aqueça-o até uma temperatura adequada para derreter a cera (tipicamente em torno de 60-70 °C, dependendo do tipo de cera utilizada).
      NOTA: Cera de abelha também é adequada. Ao manusear cera de montagem, trabalhe dentro de uma exaustão e use o EPI adequado. Após o uso, recolha o resíduo em recipientes de resíduos claramente rotulados e quimicamente compatíveis, com tampas devidamente ajustadas. Siga os procedimentos padrão institucionais para o armazenamento e descarte seguros de resíduos químicos perigosos.
    4. Aplique uma pequena quantidade de cera na superfície do cilindro e deixe que derreta completamente.
    5. Depois de derretida, coloque a amostra com a superfície de interesse sobre a superfície revestida de cera e pressione suavemente para garantir o contato completo.
      NOTA: A superfície de interesse deve estar voltada para a superfície do cilindro para que o afinamento seja realizado do lado oposto. Evite usar cera em excesso, pois isso pode levar a uma montagem desigual e afetar a qualidade do polimento.
    6. Remova o cilindro da placa quente e deixe a cera solidificar em temperatura ambiente.
  4. Monitoramento da espessura da amostra durante o polimento
    1. Para monitorar a espessura da amostra durante o processo de polimento, utilize microscopia de reflexão em ampliação baixa a intermediária (por exemplo, 10x-20x). Um diagrama ilustrando a calibração do microscópio e a medição da espessura da amostra é mostrado na Figura 2.
    2. Calibre o eixo Z do microscópio com um deslizamento padrão de cobertura, que normalmente tem cerca de 150 μm de espessura. Marque um lado da ficha com uma caneta permanente vermelha e uma área adjacente do lado oposto com uma caneta azul. Monte a cobertura em um ferrolho de vidro.
    3. Usando o botão de foco fino e a escala micrométrica, foque primeiro na superfície inferior do engolcool e depois na superfície superior.
    4. Registre o valor do deslocamento Z. Esse valor corresponde à espessura do revestimento (aproximadamente 150 μm) e serve como referência.
    5. Durante o polimento da amostra, use periodicamente essa calibração do eixo Z para estimar a espessura da amostra sem removê-la do cilindro de alumínio.
      NOTA: Essa técnica permite uma estimativa rápida e não destrutiva da espessura durante o polimento. Alternativamente, a amostra pode ser retirada do suporte e medida com um calibre digital ou micrômetro.
  5. Desbaste e polimento
    1. Comece o polimento grosso e intermediário usando lixa com granulação 1200, 2500 e 4100. O objetivo desta etapa é reduzir a espessura da amostra para aproximadamente 0,15 mm, removendo irregularidades significativas na superfície.
    2. Comece com lixa de 1200 grão, depois progrida para 2500 de grão. Aplique uma leve pressão durante esse processo. Periodicamente, monitore a espessura da amostra usando microscopia de reflexão durante o polimento.
    3. Uma vez atingida a espessura desejada, polida ambos os lados da amostra usando lixa de grão 4100. O polimento pode ser realizado manualmente ou com uma máquina semiautomática ajustada para baixa velocidade de rotação. Limpe a amostra cuidadosamente com água destilada continuamente em cada etapa de polimento.
      NOTA: Manter as amostras e lixas úmidas durante o polimento ajuda a reduzir o calor e evita a contaminação superficial causada pelas lixas mais ásperas.
    4. Para o polimento final, aplique uma pequena quantidade de pasta de diamante (por exemplo, 6 μm ou 3 μm) sobre um pano de polimento de feltro montado em um disco de polimento. Selecione o tamanho da partícula da pasta de diamante de acordo com a rugosidade da superfície da amostra.
      NOTA: Uma pasta de 6 μm é adequada para polimento fino preliminar, enquanto uma de 3 μm é recomendada para o polimento final em espelho. Quando possível, usar ambas as pastas sequencialmente gera os melhores resultados. No entanto, ainda é possível obter polimento satisfatório usando apenas a pasta de 6 μm.
    5. Polia suavemente ambos os lados da amostra com pressão mínima. Use ar comprimido ou algodão para secar a superfície polida da amostra antes das investigações de microscopia.
    6. Para destacar a amostra do cilindro, aqueça a cera usando uma placa quente e limpe qualquer cera residual da amostra usando acetona anhidra.
      NOTA: Ao manusear cera de montagem e acetona anhidra, trabalhe dentro de uma exaustão e use EPI adequado. Após o uso, recolha o resíduo em recipientes de resíduos claramente rotulados e quimicamente compatíveis, com tampas devidamente ajustadas. Siga os procedimentos padrão institucionais para o armazenamento e descarte seguros de resíduos químicos perigosos.
    7. Monte a amostra entre uma lâmina de vidro e um coverslip usando óleo de imersão como meio de montagem e avalie a orientação das fibras de colágeno usando microscopia de luz polarizada. Comece com baixa ampliação (por exemplo, 5x-10x) para pesquisar a amostra e aumente para ampliação intermediária (por exemplo, 20x-40x) para identificar regiões potenciais para exploração adicional usando microscopia eletrônica.
      NOTA: Para prosseguir com o fluxo de trabalho correlativo e a subsequente análise da amostra por microscopia eletrônica de varredura, é recomendável não selar a amostra.

4. Preparação da amostra para microscopia eletrônica de varredura

  1. Remova cuidadosamente a amostra da lâmina de vidro. Deslize suavemente a cobertura do lâmina de vidro usando uma ponta de pipeta. Use papel de filtro para remover o excesso de óleo de imersão. Lave a amostra com sabão neutro. Faça a lavagem dentro de um recipiente pequeno para evitar perda acidental de amostra.
    NOTA: Se ainda houver óleo de imersão residual na amostra, limpe suavemente a superfície usando um cotonete levemente umedecido com 70% de etanol.
  2. Deixe a amostra secar ao ar em um papel filtrante. Ar comprimido ou algodão também podem ser usados para secar a amostra. Quando estiver completamente seco, monte a amostra em um toco usando fita de carbono. Aplicar uma camada de ouro de 10 nm na amostra com sputter para evitar a carga durante a imagem.
  3. Utilize o microscópio FIB-SEM de feixe duplo para explorar a amostra por vários métodos.
    1. No modo SEM (microscopia eletrônica de varredura), utilizando elétrons secundários ou elétrons retroespalhados, avalia a morfologia da amostra, o biomaterial e a interface óssea recém-formada em regiões previamente selecionadas por microscopia óptica.
    2. No modo de microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focados (FIB-SEM), realize tomografia de corte e visualização.
  4. No modo SEM com o detector secundário de elétrons, selecionam áreas que já foram analisadas usando microscopia de luz polarizada e SEM para prosseguir com a aquisição de tomografia slice-and-view.
  5. Ajuste os parâmetros para volume da trincheira, tamanho dos pixels e espessura da fatia com base nas características de interesse. Em nosso montagem, a tomografia de corte e visualização foi realizada com um volume de trincheira de 15 μm x 10 μm x 10 μm, tamanho de pixel de 20 nm e espessura de corte de 60 nm. Recomenda-se usar um tamanho de voxel isométrico sempre que possível para melhorar a qualidade de imagem em todas as três dimensões (XYZ).
    NOTA: Esses parâmetros podem variar dependendo do sistema FIB-SEM específico. Consulte o operador do equipamento para determinar as condições ideais com base em seus requisitos analíticos e nas capacidades do sistema.

5. Alinhamento, processamento de filtros e segmentação da tomografia de corte e visualização FIB-SEM

  1. A tomografia slice-and-view gera uma série de imagens numeradas sequencialmente. Para prosseguir com o alinhamento, converta a série em um arquivo MRC, comumente chamado de pilha.
  2. Realize geração de arquivos MRC e alinhamento da pilha de imagens usando o software IMOD.
    NOTA: Outros softwares, como Avizo e FIJI/ImageJ, também oferecem plugins de alinhamento de pilha. Para orientações detalhadas, consulte cada documentação específica de software. Além disso, o trabalho de Peddie etal 23. oferece uma visão geral das abordagens adotadas durante o alinhamento de pilhas.
  3. Para gerar o arquivo MRC, abra o terminal ou prompt de comando, navegue até a pasta contendo a sequência de imagens e execute o seguinte comando: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. Para imagens que não estão no formato TIFF, use raw2mrc em vez disso. Adicione -g (por exemplo, tif2mrc -g) para converter imagens RGB de 24 bits para escala de cinza de 8 bits. Isso reduzirá substancialmente o tempo de computação.
  4. Inicie o Etomo pelo terminal e selecione a opção Alinhar Seções Seriais. Siga a sequência para alinhar a pilha: (1) Carregue a pilha desalinhada em um único quadro. (2) Aba de álgine usando Alinhamento Automático Inicial. (3) Faça uma aba de Pilha usando Fazer Pilha Alinhada, depois abra a pilha alinhada.
    NOTA: Esse processo pode levar vários minutos, dependendo do tamanho da pilha e do desempenho do sistema.
  5. Uma vez concluído, revise o resultado. O arquivo de pilha alinhado será nomeado stackname_ali.mrc.
    NOTA: Este procedimento usa as configurações padrão do sistema para alinhamento de pilha. No entanto, parâmetros relacionados ao alinhamento inicial e à geração final da pilha podem ser modificados de acordo com as preferências do usuário. Para orientações detalhadas, consulte a documentação do IMOD: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Realize filtragem adicional de imagem usando o software Avizo. Abra a pilha alinhada e aplique sequencialmente os seguintes filtros: Filtro de transformada rápida de Fourier (FFT), disponível no plugin Sandbox Filter (selecione a opção de orientação da faixa vertical, valor de tolerância: 2), assistente de correção de sombreamento (ajuste da seleção de máscara para cobrir toda a área de sombra da imagem, use fator de normalização de 100), equalização de histograma (configuração padrão) e Médias não locais (ajuste dos valores para 5; 0,1; 10; 3).
    NOTA: Filtros equivalentes estão disponíveis em outros softwares de análise de imagem. No FIJI/ImageJ, recomendamos a seguinte sequência: filtro FFT, Subtrair Fundo, Melhorar Contraste Local (CLAHE) e Filtro de Meios Não Locais.
  7. Prossiga para segmentação de imagens e renderização 3D usando o software. Diferentes estratégias de segmentação estão disponíveis, incluindo segmentação manual e segmentação baseada em limiar. Ferramentas adicionais, como o algoritmo Watershed, podem ajudar a automatizar o processo e reduzir o tempo necessário para segmentação.

6. Preparação da amostra para microscopia eletrônica de transmissão

  1. Prepare as lamellas usando microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focados (FIB-SEM) para avaliar a interface osso/biomaterial.
    NOTA: Se o biomaterial implantado não for cerâmico ou metálico, como neste estudo, seções ultrafinas adequadas para microscopia eletrônica de transmissão (MET) podem ser preparadas usando um ultramicrôtomo. No entanto, é importante notar que seccionar materiais mineralizados pode reduzir significativamente a vida útil da faca de diamante.
  2. Pós-tinga as seções ultrafinas por 20 minutos em uma solução aquosa de acetato de uranila a 5%.
    NOTA: Ao manusear acetato de urânila, trabalhe dentro de uma exaustão e use o EPI adequado. Após o uso, recolha qualquer solvente residual em recipientes de resíduos claramente rotulados e quimicamente compatíveis, com tampas devidamente ajustadas. Siga os procedimentos padrão institucionais para o armazenamento e descarte seguros de resíduos químicos perigosos.
  3. Analise as seções usando TEM. Para uma análise abrangente, combine imagens com difração de elétrons de área selecionada (SAED), espectroscopia de raios X dispersiva de energia (EDS) e tomografia eletrônica.

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Resultados

A análise inicial de amostras embutidas em resina é realizada usando tomografia microcomputadorizada (microCT). Essa técnica não destrutiva facilita a visualização 3D de toda a área do defeito, possibilitando análises quantitativas e qualitativas da amostra. O contraste na imagem por microTC deriva principalmente das diferenças de densidade dos materiais presentes na amostra. A Figura 1 ilustra a análise microCT de um defeito não crítico em uma tíbia de rato...

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Discussão

Diferentes técnicas de imagem foram empregadas para investigar a arquitetura óssea e avaliar a eficácia de biomateriais na indução da osteointegração 7,21,22,23,24. Neste protocolo, estabelecemos um fluxo de trabalho que incorpora microtomografia de raios X, microscopia óptica e microscopia eletrônica para analisar o tecido ó...

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Divulgações

Os autores afirmam que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado por bolsas aos autores das seguintes agências brasileiras: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brasil) e Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Agradecemos à LABNANO/CBPF e à CENABIO/UFRJ pelas instalações de microscopia eletrônica. O refinamento da linguagem e a revisão gramatical foram realizados usando o ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Todas as edições foram revisadas e verificadas pelos autores.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acetona Merck67-64-1
Cilindro de alumíniocaseiraN/A
Versão Avizo 2022.1ThermoFisherN/Asoftware para filtragem de imagens, segmentação e visualização 3D
Ácido Cacodílico, Sal de Sódio, triidratoTed Pella18851pó para Cacodylate Buffer. Prepare uma solução de estoque de 0,2 M
Composto de Polimento de Diamante 3 & Micro; M tamanhoTed Pella895-8
Composto de Polimento de Diamante 6 & micro; M tamanhoTed Pella895-9
Roda de Diamante x.006Tecnologia South BayDWH 3063
Roda de Diamante x.012Tecnologia South BayDWH 4122
Pano de polimento de feltroTed Pella816-20
Cápsulas de Embedding PlanasEMS70021
Cobertura de vidroKnittelN/A
Slide de vidroKnittelN/A
Glutaraldeído, grau EM 25%Ted Pella18426/18427
Sputter de ouro K550XEMITECHN/A
ImageJInstitutos Nacionais de Saúde (NIH)software para configuração de imagens, filtragem, segmentação e visualização 3D
IMOD versão 5.1Universidade do Coloradosoftware para iluminação de imagens, segmentação e visualização 3D
Máquina de Polimento Lapping eTecnologia South BayModelo 910
Serra de Roda de Diamante de Baixa Velocidade  Tecnologia South BayModelo 650
Kit de Embedding de Baixa ViscosidadeEMS14300Kit para resina SPURR. Prepare-se de acordo com as especificações da Folha de Dados  
Micro-CT Skyscan 1273 BrukerN/A
Microscópio Jeol 2100F 200kV JeolN/A
Microscópio Olympus BX51OlympusN/A
Microscópio Tescan Lyra3TescanN/A
Microscópio Zeiss AxioplanZeissN/AEquipado com uma placa lambda de primeira ordem
Paraformaldeído, grau EMSigmaP6148Pó para solução de formaldeído. Prepare uma solução de estoque de 16%
Ferrolho de plásticoExakt41500
Cera de montagem QuickStick 135Tecnologia South BayN/A
Lixa  Tamanhos de grão: 1200N/AN/A
Lixa  Tamanhos de grão: 2500N/AN/A
Lixa  Tamanhos de grão: 4100N/AN/A
Super ColaLoctiteN/A
Líquido de Arrefecimento Solúvel em Água  Tecnologia South BayN/A
Papel de filtro Whatmann grau 1sigmaWHA1001150

Referências

  1. Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. Bone hierarchical structure in three dimensions. Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).
  2. Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists. J Str Biol: X. 6, (2022).
  3. Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration. Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).
  4. Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 86, 119-130 (2016).
  5. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  6. Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface. Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).
  7. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  8. Sim, J. H., Yeo, I. S. Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces. Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).
  9. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  10. Müller, R. Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).
  11. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  12. Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy. J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).
  13. Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning. J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).
  14. Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures. Bone. 52 (2), 676-683 (2013).
  15. Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale. Science. 360 (6388), 2189(2018).
  16. Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM. Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).
  17. Micheletti, C., et al. mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces. Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).
  18. Micheletti, C., Shah, F. A. Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges. Bone Rep. 22, (2024).
  19. Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. 50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy. Bone Res. 7 (1), (2019).
  20. Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils. J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).
  21. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  22. Keklikoglou, K., et al. Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols. Eur J Taxonomy. (522), (2019).
  23. Peddie, C. J., et al. Volume electron microscopy. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).
  24. Costa De-Moraes, S. L., et al. Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep. Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).
  25. Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. 3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds. Micron. 142, (2021).
  26. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  27. Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone. Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).
  28. Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
  29. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
  30. Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
  31. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  32. Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition. , 447-466 (2018).
  33. Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants. Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).
  34. Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering. Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).
  35. Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures. Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).
  36. McMahon, G., Malis, T. Ultramicrotomy of nanocrystalline materials. Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).
  37. Bassim, N. D., et al. Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials. J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).
  38. Witzke, K., et al. Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale. Materials. 15 (9), 3084(2022).
  39. Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy. Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).
  40. Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface. J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).
  41. Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography. Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).

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