Cultura neonatal de Ovários de Camundongos e Quantificação de Folículos em Montagem Integral: Uma Abordagem Eficiente In Vitro para Estudar a Regulação Folicular Primordial

Edgar  A. Diaz Miranda; Grace Anne Dyer; Faith Wilson; Mariel English; Emma Parry; Taylor VanDeVoorde; Lei Lei

doi:10.3791/69498

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Artigo de método

Cultura neonatal de Ovários de Camundongos e Quantificação de Folículos em Montagem Integral: Uma Abordagem Eficiente In Vitro para Estudar a Regulação Folicular Primordial

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DOI:

10.3791/69498

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19 de dezembro de 2025

Edgar A. Diaz Miranda¹ , Grace Anne Dyer¹ , Faith Wilson¹^,² , Mariel English¹ , Emma Parry¹^,² , Taylor VanDeVoorde¹ , Lei Lei¹^,²

¹Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, ²Division of Biological Sciences, University of Missouri

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta protocolos para cultivar ovários de camundongos pós-natais em inserções de membrana e para quantificação de folículos de montagem completa em um ovário inteiro. Os resultados demonstraram que o manuseio técnico durante a cultura dos ovários afeta significativamente a contagem de folículos primordiais, destacando a importância de manter a consistência para minimizar a variação não biológica.

Resumo

Em mamíferos fêmeas, os folículos primordiais se formam durante o desenvolvimento ovariano fetal e servem como a única fonte para sustentar a função ovariana adulta. Mecanismos subjacentes à forma como os folículos primordiais se formam, mantêm dormência, ativam para o desenvolvimento folicular e sofrem a morte celular são importantes para entender a fisiologia ovariana e as condições patológicas. Este estudo apresenta um protocolo para cultivar ovários de camundongos pós-natais em inserções de membrana, uma abordagem que permite a cultura e tratamento farmacêutico de ovários intactos por até 10 dias, dependendo do estágio de desenvolvimento do ovário. Mudanças nas condições da cultura podem ser obtidas transferindo insertos contendo ovários cultivados entre poços em uma placa, evitando assim interferência física com os tecidos durante a cultura. Os ovários P5 foram isolados e cultivados em um inserto de 12 mm em uma placa de 24 poços, por exemplo. Cada ovário foi separado dentro de uma gota de meio DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS, 3 mg/mL de BSA, 10 mIU/mL de FSH e Antibiótico-Antimicolético, e suavemente estabilizado no inserto de membrana. O meio era alterado a cada dois dias, e a cultura era mantida por um total de cinco dias. Após a cultura, os ovários foram fixados em paraformaldeído a 4% por 2 horas e processados para coloração total de anticorpos do marcador de oócito DDX4. Os folículos foram escalonados e quantificados com base no tamanho dos oócitos e na morfologia nuclear das células foliculares somáticas. Os resultados mostraram que o número de folículos primordiais em cada ovário foi significativamente afetado pela colocação correta dos tecidos na inserção de membrana. Além disso, diferenças no número de ovários em cada inserto podem introduzir variações não biológicas e devem ser evitadas.

Introdução

A oogênese é um processo altamente regulado e complexo que resulta na produção de óócitos maduros. Nos mamíferos, a oogênese inicia-se nos ovários fetais, onde as células germinativas primordiais (PGCs) se diferenciam em oócitos primários. Cada oócito primário é envolto por uma camada de células pré-granulosas escamosas, formando um folículo primordial. A maioria desses folículos primordiais torna-se dormente após a formação, servindo como reserva^ovariana ^1,2,3. No ovário adulto, a ativação periódica dos folículos primordiais para o desenvolv....