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Artigo de método

Cultura neonatal de Ovários de Camundongos e Quantificação de Folículos em Montagem Integral: Uma Abordagem Eficiente In Vitro para Estudar a Regulação Folicular Primordial

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DOI:

10.3791/69498

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19 de dezembro de 2025

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1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta protocolos para cultivar ovários de camundongos pós-natais em inserções de membrana e para quantificação de folículos de montagem completa em um ovário inteiro. Os resultados demonstraram que o manuseio técnico durante a cultura dos ovários afeta significativamente a contagem de folículos primordiais, destacando a importância de manter a consistência para minimizar a variação não biológica.

Resumo

Em mamíferos fêmeas, os folículos primordiais se formam durante o desenvolvimento ovariano fetal e servem como a única fonte para sustentar a função ovariana adulta. Mecanismos subjacentes à forma como os folículos primordiais se formam, mantêm dormência, ativam para o desenvolvimento folicular e sofrem a morte celular são importantes para entender a fisiologia ovariana e as condições patológicas. Este estudo apresenta um protocolo para cultivar ovários de camundongos pós-natais em inserções de membrana, uma abordagem que permite a cultura e tratamento farmacêutico de ovários intactos por até 10 dias, dependendo do estágio de desenvolvimento do ovário. Mudanças nas condições da cultura podem ser obtidas transferindo insertos contendo ovários cultivados entre poços em uma placa, evitando assim interferência física com os tecidos durante a cultura. Os ovários P5 foram isolados e cultivados em um inserto de 12 mm em uma placa de 24 poços, por exemplo. Cada ovário foi separado dentro de uma gota de meio DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS, 3 mg/mL de BSA, 10 mIU/mL de FSH e Antibiótico-Antimicolético, e suavemente estabilizado no inserto de membrana. O meio era alterado a cada dois dias, e a cultura era mantida por um total de cinco dias. Após a cultura, os ovários foram fixados em paraformaldeído a 4% por 2 horas e processados para coloração total de anticorpos do marcador de oócito DDX4. Os folículos foram escalonados e quantificados com base no tamanho dos oócitos e na morfologia nuclear das células foliculares somáticas. Os resultados mostraram que o número de folículos primordiais em cada ovário foi significativamente afetado pela colocação correta dos tecidos na inserção de membrana. Além disso, diferenças no número de ovários em cada inserto podem introduzir variações não biológicas e devem ser evitadas.

Introdução

A oogênese é um processo altamente regulado e complexo que resulta na produção de óócitos maduros. Nos mamíferos, a oogênese inicia-se nos ovários fetais, onde as células germinativas primordiais (PGCs) se diferenciam em oócitos primários. Cada oócito primário é envolto por uma camada de células pré-granulosas escamosas, formando um folículo primordial. A maioria desses folículos primordiais torna-se dormente após a formação, servindo como reservaovariana 1,2,3. No ovário adulto, a ativação periódica dos folículos primordiais para o desenvolvimento folicular, conhecida como foliculogênese, é essencial para sustentar a produção de óócitos maduros e hormônios esteroides ovarianos 4,5. Na ausência de sinais de ativação, os folículos primordiais humanos podem permanecer quietos por até 50 anos. A dormência prolongada pode contribuir para a redução da qualidade dos oócitos, bem como para o aumento da taxa de perda de folículos primordiais em ováriosenvelhecidos 6. Os mecanismos subjacentes a como um conjunto específico de folículos é ativado enquanto outros permanecem quietos e passam por morte celular periódica permanecem questões em aberto.

O processo de oogênese é altamente conservado em mamíferos, tornando os camundongos um modelo ideal para estudar a oogênesede mamíferos 7. Em camundongos, a formação do folículo primordial é concluída no dia pós-natal 4 (P4). Uma pequena proporção de folículos primordiais passa pelo desenvolvimento folicular imediatamente após sua formação. Durante o desenvolvimento do folículo, o ovocito aumenta de tamanho devido ao aumento da organogênese, além da síntese de mRNA eproteínas 4. As células da granulosa escamosa fazem a transição para células cúbicas da granulosa e tornam-seproliferativas 8. Esses folículos em desenvolvimento crescem até o estágio ovulatório por volta do dia 21, que é quando as camundongos fêmeas atingem a puberdade. Essa fase do desenvolvimento folicular nos ovários pós-natais é comumente chamada de 'folliculogênese da primeira onda'. Como a folliculogênese da primeira onda reflete de perto o processo de desenvolvimento do folículo, os ovários de camundongos pós-natais fornecem um modelo ideal para estudar a regulação folicular primordial e a foliculogêneseovariana 9.

A classificação dos folículos ovarianos baseia-se principalmente na morfologia nuclear das células somáticas do folículo e no tamanho do oócito. Nos ovários de camundongo, o folículo primordial dormente é identificado por uma única camada de células pré-granulosas escamosas que envolve um oócito primário, com diâmetro de aproximadamente 20 μm. Os folículos em desenvolvimento podem ser categorizados em folículos primários, secundários, terciários e antrais. O folículo primário contém um oócito que tipicamente tem mais de 25 μm de diâmetro e é cercado por uma única camada de células cúbicas da granulosa (Figura Suplementar 1). O folículo secundário possui duas camadas de células da granulosa, enquanto o folículo terciário é composto por três ou mais camadas de células da granulosa. O folículo antral é maior que o folículo terciário, contém múltiplas camadas de células da granulosa e possui uma cavidade cheia de líquido conhecida como antrum. À medida que os folículos se desenvolvem, o óócito aumenta de tamanho, atingindo aproximadamente 80 μm no momento da ovulação. Além disso, os folículos em desenvolvimento são cercados por várias camadas de células finas de theca, localizadas fora das células dagranulosa 10,11,12.

O tamanho relativamente pequeno dos ovários de camundongos pós-natais torna a cultura de ovários inteiros uma abordagem prática para pesquisa. Esse método possibilita efetivamente o estudo do desenvolvimento ovariano e folicular dentro de um ovário intacto, pois preserva os microambientes físicos e fisiológicos enquanto minimiza a interferência dos tecidoscircundantes 12. Essa abordagem permite experimentos que seriam desafiadores de conduzir em modelos in vivo. Exemplos incluem imagens ao vivo do desenvolvimento ovariano, tratamentos multifármacos controlados pelo tempo e a análise da atividade secretora ovariana por meio do perfil proteico do meiode cultura 13,14. Além disso, essa abordagem pode ser aplicada para investigar o efeito dos fatores secretores sem interação direta célula-célula por meio de experimentos de co-cultura. Nesses experimentos, diferentes tipos de tecidos podem ser colocados em inserções de membrana separadas dentro de um meiocompartilhado 15. Além disso, o uso condicional de ovários de camundongos com gene-knockout in vitro pode ajudar a elucidar mecanismos-chave envolvidos na ativação e crescimento do folículo primordial.

Neste artigo, apresentamos métodos para cultivar ovários de camundongos pós-natais usando inserções de membrana e para quantificação de folículos de montagem total em um ovário inteiro (Figura 1). As técnicas aqui descritas incluem 1) dissecação de ovários de camundongos neonatais, 2) cultura de ovários de camundongos neonatais, 3) mudança do meio durante a cultura, 4) fixação de tecidos e coloração de anticorpos em montagem completa, e 5) imagem de tecidos e quantificação de folículos. Além disso, este estudo utilizou doxorrubicina para induzir experimentalmente a perda folicular primordial, fornecendo um modelo para investigar os mecanismos subjacentes à depleção da reserva ovariana. Os resultados mostraram que o número de ovários por inserto e sua posição dentro do inserto durante a cultura influenciaram a contagem de folículos primordiais. Isso destaca a importância de manter uma configuração consistente da cultura para evitar variações não biológicas nos resultados experimentais.

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Protocolo

Ratos machos e fêmeas CD-1 foram alojados juntos em proporção de 1:1 como pares reprodutores. A data de nascimento dos filhotes novos foi designada como dia pós-natal 0. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal (IACUC) da Universidade do Missouri (número de protocolo: 36647).

1. Reagentes e Mídia Cultural

  1. Todos os reagentes usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. Prepare todos os materiais e materiais antes da cultura dos ovários.
  2. Meios de cultura: Produza ~5 mL de meio DMEM/F-12 suplementado com 3 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA), soro fetal bovino (FBS) a 10% e 10 mIU/mL de hormônio folicular-estimulante (FSH).
    NOTA: A mídia deve ser preparada recentemente adicionando os estoques de BSA (30 mg/mL), FBS e FSH (10 IU/mL) ao meio DMEM/F-12. Equilibre o meio em uma placa de Petri por cerca de 30 minutos em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 °C. Armazene os caldos a -20 °C e descongele imediatamente antes do uso. Aliquot estoques em volumes adequados para evitar congelamentos e descongelamentos repetidos dos estoques.

2. Cultura de ovários

  1. Eutanasiar camundongos Fêmeas P5 por decapitação. Remova os ovários e o tecido bursal anexado usando tesoura cirúrgica e pinças. Coloque os ovários em uma placa de Petri de 60 mm com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) pré-resfriado contendo antibiótico-antimicótico (Figura 2A,B).
  2. Usando um par de seringas de insulina (1 mL), disseque e remova o tecido bursoso do ovário sob estereoscópio (Figura 2C,D). Transfira os ovários usando uma pipeta de 1 mL para uma placa de Petri de 30 mm contendo 3 mL de meio de cultura e coloque a placa em uma incubadora deCO2.
    NOTA: Evite cutucar ou apertar os ovários. Faça incisões limpas e uniformes através da bursa ovariana usando as seringas de insulina para liberar o ovário. Preencha a ponta da pipeta com aproximadamente 50 μL de meio, coloque a ponta da pipeta ao lado do ovário e aspire-a para a ponta para transferência.
  3. Sob o exaustor de fluxo laminar, prepare a placa colocando 400 μL de meio e um insert em cada poço (Figura 2E, E'). O meio fica fora do inserto, e a membrana do insert fica opaca quando é imerso pelo meio.
  4. Para a cultura com tratamento Dox de 24 horas, prepare um meio contendo Dox a 0,1 mg/mL de concentração fresca, diluindo o estoque Dox (10 mg/mL) com o meio.
    NOTA: Mídias contendo Dox devem ser descartadas adequadamente, de acordo com as diretrizes dos comitês institucionais de biossegurança e saúde e segurança ambiental.
  5. Sob estereoscópio, transfira até três ovários para um inserto usando uma pipeta de 1 mL (Figura 2F,G). Minimize a quantidade de mídia transferida para o inserto e remova imediatamente qualquer material excedente após a transferência. Uma vez que os ovários sejam colocados suavemente no inserto, use uma pipeta de 200 μL para transferir aproximadamente 200 μL de meio do poço para o inserto, garantindo que a membrana esteja completamente coberta pelo meio. Transfira o meio de volta para o poço e centre os ovários na membrana. Encha a ponta da pipeta com substrato de cultura para evitar que o ovário seja sugado para dentro da ponta ao centralizá-lo. Certifique-se de deixar espaço suficiente entre os ovários e que eles estejam estabilizados no inserto de membrana (Figura 2H), em vez de permanecerem suspensos no meio (Figura 2I). Tome cuidado para não cutucar os ovários e a membrana.
  6. Em uma cultura de 5 dias, troque o meio a cada dois dias removendo 200 μL de meio (metade da quantidade total) do poço e adicionando 200 μL de meio cultivado fresco de volta ao poço (Figura 2J).
  7. Para a cultura com tratamento medicamentoso de 24 horas, transfira o inserto com ovários para um novo poço com 400 μL de meio fresco após as primeiras 24 horas, usando os seguintes passos:
    1. Remova o inserto contendo os ovários do poço usando um par de pinças.
    2. Enxágue brevemente o fundo do inserto, submergindo-o em um recipiente de 60 mm com substrato fresco para cultura.
    3. Bata suavemente na parte inferior do inserto em uma antena vazia de 60 mm para remover o excesso de mídia do inserto. Coloque o inserto no poço com meio de cultura fresco.
      NOTA: Remova o excesso de meio do inserto para garantir que os ovários estejam estabilizados na membrana imediatamente após trocar o meio ou transferir o inserto.

3. Fixação e imunocoloração de montagem integral

  1. Para fixar os ovários cultivados, remova o inserto da placa usando uma pinça e coloque-o em uma placa de Petri de 60 mm contendo 5 mL de DPBS. Transfira aproximadamente 100 μL de DPBS ao lado dos ovários e resuspenda-os usando uma pipeta de 1 mL.
  2. Usando uma pipeta de 1 mL, transfira os ovários do inserto para um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Remova o DPBS do tubo e adicione 500 μL de paraformaldeído a 4%. Fixe os ovários a 4°C por 2 horas.
    NOTA: A ponta da pipeta pode precisar ser aparada mais ampla para evitar danos aos tecidos caso os ovários sejam grandes demais para atravessá-la.
  3. Lave os ovários fixos em 1 mL dePBST 2 (PBS, 0,1% Tween [v/v], 0,5% Triton [v/v]) pelo menos três vezes, 1 hora cada em um shaker giratório. Recomenda-se deixar os tecidos em PBST2 durante a noite (12-16 h) a 4 °C para potencializar a penetração de anticorpos.
    NOTA: Este pode ser um ponto de parada; os tecidos podem ser armazenados emPBST 2 até três dias antes da incubação primária de anticorpos.
  4. Incubar os ovários com helicase anti-dead-box 4 (DDX4) em 100 μL de tampão de diluição de anticorpos (1% BSA [v/v], 10% soro de burro [v/v], 0,1 M glicina, 0,1% Tween e 0,5% Triton em PBS) a uma diluição de 1/400 (2,3 μg/mL) a 4 °C por 12-16 horas.
  5. No dia seguinte, remova o anticorpo primário e adicione 1 mL de PBST2 à trompa. Lave os lenços pelo menos três vezes, 1 hora em cada um em um shaker giratório.
    NOTA: Este pode ser um ponto de parada; os tecidos podem permanecer emPBST 2 até três dias após a incubação primária de anticorpos.
  6. Dilua o anticorpo secundário donkey anti-rabbit AF488 com diluição de 1/500 (1,5 μg/mL) emPBST 2. Incube o tecido com pelo menos 100 μL do anticorpo secundário diluído a 4 °C por 12-16 horas.
  7. No dia seguinte, lave os tecidos extensivamente em PBST2 pelo menos três vezes, 1 hora em cada um em um shaker giratório. Recomenda-se lavar os tecidos por até 8 horas para reduzir o fundo. Certifique-se de cobrir os tubos com papel alumínio para protegê-los da luz desse passo à frente.
  8. Remova PBST2 e adicione 100 μL de DAPI com uma diluição de 1/1000 (1 μg/mL) em PBS ao tubo. Incube os tecidos em DAPI por 30 minutos em temperatura ambiente.
  9. Lave os ovários em PBST2 uma vez por 30 minutos e monte-os em uma lâmina microscópica com um espaçador de imagem. Transfira os ovários para o centro do espaçador usando uma pipeta de 1 mL e remova o excesso dePBST 2. Adicione cerca de 5 μL do meio de montagem antifade e coloque uma lâmina de microscópio no topo do espaçador. Sele as bordas do espaçador com esmalte transparente para armazenamento a longo prazo.
    NOTA: Antes de imaginar os slides, certifique-se de que o esmalte está completamente seco e que não há meio de montagem na parte externa do encaixe da capa. Esses reagentes podem danificar os objetivos do microscópio. Além disso, evite usar excesso de meio de montagem, pois os ovários precisam permanecer estacionários durante a imagem.
  10. Fotografe os ovários com um microscópio confocal com ampliação de 10x e tamanho de passo Z de 10 μm. Ajuste as configurações e use a compensação Z (ganho de excitação) para fotografar todo o ovário. Isso pode ser feito usando os seguintes passos:
    1. Ajuste a potência de excitação e o ganho do detector monitorando a saturação do sinal usando o histograma, pois pode variar entre os tecidos. Comece com baixa potência do laser e aumente gradualmente conforme necessário.
    2. Para imagens de regiões mais profundas, ative a compensação Z para o detector de ganho, pois a intensidade do sinal pode diminuir com a profundidade. Use uma média de quadros de pelo menos 10 e ative a varredura X bidirecional a uma velocidade de 600 Hz.
      NOTA: Com essas configurações, a imagem não deve exceder 10 minutos por ovário (~200 μm). A coloração imunofluorescente em montagem total dos ovários com anti-DDX4 é tipicamente robusta e raramente descolora foto.

4. Quantificação do folículo

  1. Para quantificar os folículos em cada ovário, abra as imagens usando o software ImageJ. Ao abrir, certifique-se de que o modo de cor esteja selecionado como colorizado e que os canais divididos estejam marcados na caixa abaixo de dividir em janelas separadas. Selecione a imagem de interesse e use a ferramenta imagem/transformação/rotação para posicionar o ovário simetricamente na imagem.
    NOTA: As imagens adquiridas pelo confocal podem ser visualizadas e analisadas em 3D usando o software Imaris (Figuras 3A,B) ou o softwareImageJ 16.
  2. Use a ferramenta analisar/ferramentas/grade para dividir o ovário em grades (Figura 3C,C').
  3. Use a ferramenta plugins/analyze/cell counter para marcar todas as grades que cobrem o ovário (Figura 3D, D', grades marcadas por 4). Dessas grades, marque cada duas grades em cada linha para quantificação dos folículos (Figuras 3E, E', grades marcadas por 8). As grades na borda do ovário que tenham menos de 10 oócitos não são incluídas para quantificação do folículo.
    NOTA: Inicialize o contador de células e escolha os tipos de contadores que considerar fáceis de ler.
  4. Os oócitos podem ser identificados pela presença de uma estrutura em formato de anel positiva para DDX4 ao redor de um núcleo que é positiva para DAPI. Os folículos primordiais possuem óócitos com tamanho de aproximadamente 20 μm de diâmetro cercados por células somáticas escamosas. Folículos em desenvolvimento possuem óócitos com diâmetro superior a 25 μm e cercados por uma ou mais camadas de células cúbicas da granulosa (Figura Suplementar 1).
  5. Conte os folículos primordiais em cada grade marcada (como visto na Figura 3E, E' com o contador Tipo 8). Revise os folículos usando seções/pilhas ópticas na grade e marque-os usando a ferramenta de contador celular, respectivamente. Certifique-se de não contar duas vezes os folículos primordiais em duas seções/pilhas ópticas consecutivas. Conte os folículos em desenvolvimento em todas as grades marcadas com o contador Tipo 4.
    NOTA: Use a opção de zoom para ajudar a visualizar e contar os óócitos através das pilhas.
  6. Calcule o número de folículos primordiais em todo o ovário (nf) multiplicando o número médio de folículos primordiais por grade (nfgrid) pelo número de grades que abrangem o ovário (ngrades). nf = grade nf × ngrids.
    NOTA: Análises estatísticas foram realizadas e gráficos foram gerados usando o software Prism 10.2.0 (GraphPad Software, versão 10, Inc., CA). As diferenças entre os grupos foram avaliadas usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. A significância estatística foi considerada em p < 0,05. Os dados são apresentados como a média ± erro padrão (SE).

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Resultados

Neste artigo, demonstramos os métodos de cultura neonatal de ovários, coloração de anticorpos em montagem completa, imagem confocal e quantificação de folículos para avaliar se o número e a posição dos ovários no inserto durante a cultura afetam o resultado experimental, especificamente, a contagem de folículos no ovário. Cultivamos ovários com as seguintes configurações: um, dois ou três ovários por inserto para cultura estabilizada, e três ovários por inserto para cultura flutuante. Os ovários foram cultivados sob duas...

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Discussão

Neste estudo, demonstramos métodos para cultura neonatal de ovários de camundongos e para quantificação de folículos ovarianos em montagem completa. A abordagem de cultura pode sustentar folículos primordiais e em desenvolvimento inicial in vitro. O método de quantificação do folículo com montagem completa requer processamento mínimo de tecido, o que economiza tempo e preserva a integridade do tecido, garantindo uma quantificação precisa do folículo.

O número ...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse a serem divulgados.

Agradecimentos

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R35GM158131. O EADM foi apoiado pela Fundação Lalor. Os autores agradecem com gratidão ao University of Missouri Advanced Light Microscopy Core pelo apoio e assistência neste trabalho

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura celular de 24 poçosFisher Scientific & nbsp;09-761-146 
Alexa Fluor 488 Anti-Coelho de BurroLaboratórios de ImunoPesquisa Jackson711-546-152
Anti-Anti (100X)Gibco15240-062
Albumina Sérica BovinaSigma-AldrichA1470-25G
CD-1 IGS MouseLaboratórios Charles River & nbsp;022Ratos
Inserções de Cultura CelularMilliporePICM01250
Seringa de insulina Comfort Point com Agulha 1cc 28G x 1/2Exel26027
DAPITermo Científica62248
DDX4 Rabbit mAbAbcamab13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)Gibco11320-033
Doxorubicina cloridrato Sigma-AldrichPHR1789
DPBS (1X)Gibco14190-144
Soro Fetal BovinoSigma-AldrichF0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, EUA (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
Misturadores de Nutação Fisherbrand - Velocidade VariávelFisher Scientific & nbsp;88-861-043Shaker
Hormônio Folículo-EstimulanteSigma-AldrichF4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160Termociência e comércio;i160Incubadora de CO2
GlicinaFisher Scientific & nbsp;BP381-500
Imaris Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsSN 8100001409Confocal
Soro de Burro NormalLaboratórios de ImunoPesquisa Jackson017-000-121
Olympus SZ61Microscópios OlympusSZ61Estereoscópio
Paraformaldeído Fisher Scientific & nbsp;15714
Espaçador de imagem SecureSealGrace Bio-Labs654002
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
PRÉ-ADOLESCENTES 20Sigma-AldrichP1379-500ML
Meio de Montagem Antifade VECTASHIELDLaboratórios VectorH-1000

Referências

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