Artigo de método

Execuções de placa única de testes de estresse de Mito e glicólise usando células aderentes ou não aderentes

200 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/69504

⸱

22 de maio de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta protocolos otimizados para realizar análises metabólicas em tempo real dos testes de estresse de Mito e glicólise simultaneamente na mesma placa. Os procedimentos são adaptados tanto para células aderentes (BMDMs) quanto para células não aderentes (linfócitos), permitindo uma avaliação precisa, reprodutível e paralela da função mitocondrial e glicolítica das células de interesse.

Resumo

A análise metabólica em tempo real fornece medições sem rótulo da respiração mitocondrial e glicólise, permitindo que pesquisadores relacionem o metabolismo energético celular com mecanismos de doenças e respostas terapêuticas em diversos campos. Ao comparar o metabolismo energético entre diferentes camundongos, outros animais, humanos ou células sob diferentes tratamentos, é fundamental realizar medições em uma única corrida para garantir resultados precisos e confiáveis. Além disso, o desenho experimental deve considerar o tipo celular analisado, por exemplo, se elas são aderentes, como macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs), ou não aderentes, como linfócitos. Portanto, foi desenvolvido um protocolo que permite a realização simultânea dos testes de Estresse Mito e Glicólise na mesma placa, apesar dos ensaios exigirem injeções de medicamentos distintos e programas analíticos. Protocolos de manuseio separados foram otimizados para análise tanto de células altamente aderentes (por exemplo, BMDMs) quanto de células "flutuantes" não aderentes (por exemplo, células T e outros linfócitos). Aqui, são apresentados protocolos detalhados para conduzir esses ensaios de forma eficiente e reprodutiva.

Introdução

O Analisador XF Seahorse é um instrumento único que permite a medição em tempo real da respiração mitocondrial e glicólise em muitos tipos celulares. Ao quantificar simultaneamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR), essa tecnologia permite a dissecação precisa de vias bioenergéticas sob condições fisiológicas ou de estresse. Sua versatilidade o tornou indispensável em diversas áreas de pesquisa, incluindo câncer1,neurociência 2,imunologia 3, envelhecimento3, 4, 5 e descoberta defármacos 6, onde a reprogramação metabólica é uma marca da progressão da doença e da resposta terapêutica. Ao vincular a bioenergética funcional aos fenótiposcelulares 7,8, a análise oferece uma plataforma poderosa para descobrir mecanismos, identificar vulnerabilidades metabólicas e avaliar os efeitos de intervenções genéticas ou farmacológicas.

Em muitas disciplinas, comparar os efeitos imediatos de medicamentos, pequenas moléculas, citocinas ou compostos naturais no metabolismo celular é melhor realizado sob condições experimentais idênticas, a mesma placa, tempo de incubação, parâmetros ambientais e horário do dia. Assim, essa abordagem consiste em placar células com diferentes tratamentos ou fundos genéticos na mesma placa e analisar múltiplos parâmetros metabólicos simultaneamente. Essa estratégia garante a comparação mais precisa das mudanças relacionadas a medicamentos ou genéticas no metabolismo energético celular.

Muitos tipos celulares se comportam de forma diferente em cultura. Os linfócitos permanecem em suspensão e nunca se fixam à placa9, os macrófagos aderem fortemente, dificultando sua transferência, e as células cancerígenas proliferam rapidamente, mas em taxas variadas dependendo da linha. Essas diferenças apresentam desafios para a análise metabólica em tempo real; portanto, cada tipo de célula no experimento requer um protocolo personalizado.

Este artigo fornece protocolos passo a passo para realizar esses ensaios usando análise metabólica em tempo real, garantindo eficiência e reprodutibilidade. Esses protocolos podem ser aplicados a todas as versões de analisadores disponíveis no mercado.

Protocolo

Os ratos foram cuidados de acordo com os procedimentos estabelecidos no protocolo do Comitê de Cuidados e Uso Institucionais de Animais (IACUC) do Meharry Medical College dos Institutos de Saúde e Institucional. Esta instituição é credenciada pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International e cumpre a Política do Serviço de Saúde Pública para o tratamento e uso de animais de laboratório em condições livres de patógenos. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Otimização para densidade celular

NOTA: Cada tipo celular apresenta características metabólicas únicas e considerável variação de tamanho. Ambos os fatores são críticos para determinar o número apropriado de células a serem carregadas por poço para obter resultados ótimos. Antes de realizar um ensaio experimental inicial, prepare e execute uma placa de teste com as células de interesse escolhidas em densidades variadas.

  1. Para células aderentes (por exemplo, células cancerígenas), teste as densidades de semeadura variando de 20.000 a 100.000 células por poço. Para células altamente metabólicas e/ou grandes (por exemplo, células cancerígenas humanas ou fibroblastos), a otimização da densidade começa em 10.000 células ou menos por poço.
  2. Para células não aderentes (por exemplo, linfócitos), otimize a densidade de semeadura na faixa de 100.000–500.000 células por poço. Para todos os tipos de células, busque uma monocamada uniforme de célula única para alcançar resultados ótimos (veja a Figura 1 para exemplo, disposição de placas das amostras).
  3. Execute o ensaio de Estresse de Mito (conforme abaixo). Os dados deste ensaio preliminar podem ser usados para determinar a densidade celular ideal para o experimento principal. Selecione a densidade que mostra a maior diferença entre as condições do ensaio.
    NOTA: Este protocolo não se aplica à análise de amostras 3D (por exemplo, esferoides celulares, organoides). No entanto, pode ser modificado para levar em conta a espessura da amostra e a superfície irregular.

2. Preparação para o ensaio

  1. No dia anterior à execução do ensaio, levante suavemente o cartucho sensor da placa de utilidade e adicione 200 μL de água livre de RNAase/DNAse a cada poço da placa de utilidade, e desça o cartucho sensor na placa de utilidade até que os sensores fiquem completamente submersos em água.
    NOTA: O nível da água deve estar alto o suficiente para garantir que os sensores fiquem completamente submersos durante a noite, pois os fluoróforos do cartucho do sensor não funcionarão se não forem devidamente hidratados. Se estiver usando um XF Hydrobooster para hidratar o cartucho, ele pode ser colocado diretamente em solução calibrante e a etapa de hidratação da água é excluída.
  2. Coloque o cartucho sensor hidratado/placa utilitária em uma incubadora de 37 °CCO-2 sem durante a noite. Para evitar a evaporação da placa, também coloque um recipiente com água duplamente destilada na incubadora.
  3. No dia do ensaio, remova o cartucho sensor/placa utilitária do incubadorsem CO 2 e remova suavemente o cartucho sensor da placa utilitária, colocando o cartucho com o sensor para cima na bancada.
  4. Descarte a água da placa de utilidade e seque com sacudição para eliminar quaisquer gotículas soltas, adicionando 200 μL de Solução de Calibrante XF a cada poço.
  5. Coloque delicadamente o cartucho sensor de volta na placa de utilidade para que os sensores fiquem completamente submersos na solução calibrante e coloque-o de volta na incubadora de 37 °CCO-less 2.

3. Preparação da mídia para ensaio

  1. Preparação para a mídia Mito Stress:
    1. Em um tubo de 50 mL, adicione o seguinte a 45 mL de meio RPMI XF: 500 μL de 100x piruvato de sódio (concentração final: 1 mM), 500 μL de 100x L-glutamina (concentração final: 2 mM) e 550 μL de solução de glicose a 45% (concentração final: 25 mM)
  2. Ajuste o pH para 7,4. Complete com XF RPMI medium até um volume final de 50 mL. Mantenha o meio preparado em um banho-maria ou banho seco a 37 °C antes de usar.
  3. Preparação do meio para ensaio de glicólise:
    1. Em um tubo de 50 mL, adicione 250 μL de 100x L-glutamina a 45 mL de meio XF RPMI.
  4. Ajuste o pH para 7,4, depois complete com o médio XF RPMI até um volume final de 50 mL. Mantenha o meio preparado em um banho de água ou seco a 37 °C antes de usar.
    NOTA: O pH tanto do meio de ensaio de Mito Estresse quanto do meio de glicólise deve ser reajustado para 7,4 após a adição de suplementos que alterem o pH, pois mesmo pequenos desvios podem afetar significativamente os resultados do ensaio.

4. Lavagem das células e troca de mídia antes da análise

NOTA: A etapa de lavagem das microplacas de cultura celular XFe96/XF Pro variará dependendo se estão usando tipos de células aderentes ou não aderentes. Por favor, consulte o passo 9, Células aderentes (células cancerígenas, células primárias BMDMs) e células não aderentes (células T e outros linfócitos), para determinar o melhor método de lavagem para o tipo celular utilizado.

  1. Remova 160–180 μL de meio de crescimento de cada poço usando um multi-pipetista, trabalhando uma fileira/coluna por vez para evitar que as células sequem. Evite tocar no fundo dos poços.
  2. Usando um pipetman de ponta única, remova os 20–30 μL restantes dos poços, evitando tocar a camada celular no fundo do poço.
  3. Adicione 180 μL de meio de ensaio de glicólise ou Mito Stress (veja passo 3) a cada poço, seguindo o layout da Figura 1. Para evitar perturbar a camada celular, dispense suavemente o meio ao longo da parede lateral de cada poço até que todos os poços estejam preenchidos. Ambos os ensaios estão na mesma placa.
    NOTA: Os poços que não contêm células e controlam poços também devem ser preenchidos com meios de ensaio.
  4. Coloque a microplaca em uma incubadora de 37 °CCO-less 2 por 40–45 minutos antes de iniciar o ensaio e comece a preparar os medicamentos.

5. Preparação de medicamentos e carregamento do cartucho

ATENÇÃO: Alguns medicamentos (FCCP, Antimicina A/ Rotenona, Oligomicina) são perigosos e devem ser manuseados com cuidado. São necessárias medidas apropriadas para proteger o pessoal; isso inclui o uso de luvas e outros equipamentos de proteção individual (EPI), bem como o descarte de materiais em uma lixeira ou recipiente de resíduos químicos aprovados pela instituição.

NOTA: A concentração ótima de FCCP/oligomicina depende do tipo celular e, antes do ensaio, é titulada empiricamente ao trabalhar com células particularmente sensíveis. As concentrações finais podem variar para medicamentos dependendo do tipo celular. Prepare medicamentos e meios de ensaio frescos no dia do uso. Não congele nem reutilize. A preparação do medicamento para ensaio pode ser concluída dentro desse período de 45 minutos para obter resultados ótimos.

  1. Utilizando o meio de ensaio de estresse e glicólise de Mito pré-aquecido da etapa 3, dilua os compostos conforme a Tabela 1 e/ou Tabela 2 até as concentrações apropriadas para cada tipo celular. Prepare cada composto em um tubo separado de 15 mL (se usar os seis compostos, serão necessários seis tubos).
  2. Remova o cartucho sensor/placa utilitária da incubadora sem CO2 de 37 °C e remova a tampa, colocando cuidadosamente o guia de carregamento XF fornecido com o kit, o guia de carga XF correspondente à porta do injetor (Guia A para a porta A) firmemente acima do topo do cartucho sensor (veja a Figura 2).
  3. Usando um piqueta multicanal e um reservatório de reagente para cada medicamento, adicione lentamente o volume necessário à porta correspondente (consulte as Tabelas 1 e 2 para volume). Mantenha a pipeta estritamente na vertical ao carregar os medicamentos (veja a Figura 2).
  4. Troque ou reutilize após enxaguar e secar cuidadosamente o guia de carregamento conforme necessário para cada porta (Porta A, B, C e D) e descarte as pontas da pipeta após cada carga.
    NOTA: As pontas da pipeta devem encaixar firmemente na porta guia, mas não apertar demais, pois as pontas da pipeta podem ficar presas no guia! Recomenda-se testar as pontas da pipeta/pipettor usadas nos guias antes de carregar os compostos para evitar descarregar as amostras de forma errada.
  5. Após carregar todos os compostos em suas respectivas portas, remova o guia, confirme visualmente que todas as portas estão cheias e prenda o cartucho com sua tampa. Os medicamentos devem corresponder ao ensaio em cada parte da mesma placa (Figura 1).
    NOTA: As concentrações finais de poço recomendadas para Estresse Mito são 1 μM de oligomicina, 1 μM de FCCP e 0,5 μM de Rotenona/Antimicina; para glicólise, 10 mM de glicose, 1 μM de oligomicina e 50 mM 2-DG.

6. Configuração do analisador Seahorse XFe96

  1. Ligue o analisador e abra o software WAVE (veja a Figura 3).
  2. Selecione o teste de estresse Mito XF.
    NOTA: Desde que o meio de ensaio e os compostos adequados sejam utilizados, o analisador pode realizar simultaneamente tanto os testes mitocondrial quanto o de glicólise na mesma placa usando o Teste de Esforço XF Mito.
  3. Selecione o número de 'Grupos' com base na configuração da placa e rotule cada grupo. Prossiga para a próxima aba para atribuir poços ao mapa das placas (veja a Figura 3). Ambos os ensaios são feitos na mesma placa.
  4. Destaque os poços de cada Grupo com base em como a placa está carregada.
  5. Ajuste o programa de acordo com o tipo de célula e o propósito experimental. Por exemplo, se a configuração incluir um grupo pré-ativado antes da análise ou se um ativador for adicionado durante a execução, estenda o tempo de incubação em cada ciclo para permitir que a ativação ocorra.
  6. Selecione a próxima aba, 'Executar Ensaio', e preencha as informações conforme necessário para salvar o arquivo de dados.
  7. Carregue o cartucho pré-hidratado com medicamentos (a partir da etapa 5) na máquina quando indicado para inicialização. A etapa de inicialização indicará se os sensores estão devidamente hidratados e funcionais.
  8. Inicie o ensaio e carregue e descarregue as placas conforme indicado pelos indicativos durante o programa.
    NOTA: Ao carregar o cartucho ou microplaca no analisador, certifique-se de que todas as tampas estejam removidas! Enquanto alguns modelos de analisadores possuem um recurso de segurança que pode detectar tampas, modelos mais antigos não possuem. Isso pode danificar a máquina se a tampa estiver intacta durante a passagem da placa.

7. Métodos de normalização: (SRB) e contagem de nucleares (coloração e imagem DAPI)

ATENÇÃO: Alguns reagentes do kit de ensaio SRB são corrosivos e queimam se entrarem em contato com a pele. O DAPI pode causar uma reação alérgica na pele. Recomenda-se o uso de luvas e outros EPIs, assim como o descarte de materiais em uma lixeira ou recipiente de resíduos químicos aprovado pela instituição.

NOTA: Selecione o método de normalização com base nas características e pré-tratamentos das células analisadas. Ambos os métodos são adequados ao comparar células com diferentes taxas de proliferação, pois ambos levam em conta tais variações. No entanto, se os tratamentos medicamentosos induzirem senescência, interrompendo a proliferação enquanto aumentam o tamanho celular, a coloração DAPI é a abordagem preferida de normalização. A DAPI pode não ser adequada para tipos celulares onde a coloração nuclear é difícil de visualizar (por exemplo, adipócitos, eritrócitos) ou células podem ser multinucleadas (ou seja, hepatócitos parênquimatos, miócitos).

  1. Para normalizar as células usando o ensaio SRB (Kit de Ensaio de Citoxicidade de Células B para Sulfohodamina) após análise metabólica em tempo real, remova a placa da máquina e adicione 1/4 do volume do meio (ex.: 50 μL em 200 μL de meio de cultivo) da Solução de Fixação a cada poço.
    1. Incube em temperatura ambiente por 1 hora ou durante a noite a 4 °C.
    2. Remova a solução e lave suavemente os poços três vezes com 200 μL de água livre de RNase/DNase, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Para armazenamento de curto prazo (se necessário), substitua a lavagem final por PBS e armazene a 4 °C.
    3. Para normalização imediata usando o ensaio SRB, remova a solução de lavagem e deixe a placa secar completamente ao ar em temperatura ambiente.
    4. Adicione 25 μL de solução SRB a cada poço e tinga por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro, ou envolva a placa em papel alumínio durante o período de incubação.
      NOTA: A solução de SRB é sensível à luz, e essa parte do experimento deve ser realizada em uma área de baixa luz.
    5. Remova a solução de mancha e adicione 100 μL de solução de lavagem 1x para lavar cada poço 2 a 3 vezes.
    6. Lave o mais rápido possível para evitar descolorimento e remova as soluções de lavagem o máximo possível por aspiração.
    7. Adicione 100 μL de 1x Solução de Solubilização em cada poço e coloque a placa sobre um shaker por 10 minutos em temperatura ambiente.
    8. Meça a Densidade Óptica (O.D.) a 565 nm em um leitor de placas para determinar a densidade do poço com base na saturação de cor (veja a Figura 3 para referência visual).
    9. Exporte os dados dos valores O.D. como um arquivo Excel. Essa planilha será colada no software WAVE para normalização (passo 8).
      NOTA: Se a cor intensa for observada (> O.D. 3,5) devido à sobrecarga celular, um comprimento de onda subótimo (por exemplo, 490–530 nm) pode ser usado para reduzir as leituras de volta à faixa linear do instrumento. Corrigir o fundo subtraindo a O.D. do controle contendo apenas o meio de cultura (poço de controle de fundo) das leituras de todas as amostras.
  2. Para coragem DAPI, dilua a solução DAPI original para 300 nM em 1x PBS.
    1. Lave cada poço da placa celular 3 vezes suavemente com 200 μL 1x PBS.
      NOTA: Se houver células não aderentes, centrifuge a placa a 200 x g por 3 minutos sem freio para garantir que as células fiquem suspensas no fundo de cada poço após cada etapa de lavagem.
    2. Fixe as células em PFA 2%–4% diluído em 1x PBS por 10–15 minutos em temperatura ambiente.
    3. Lave cada poço da placa celular 3 vezes suavemente com 200 μL 1x PBS.
    4. Adicione aproximadamente 150 μL dessa solução diluída de coloração DAPI a cada um, garantindo que as células estejam completamente cobertas em cada poço.
    5. Incube de 1 a 5 minutos em temperatura ambiente em uma área de pouca luz (ou placa de cobertura em papel alumínio).
    6. Remova a solução de mancha DAPI de cada poço.
    7. Lave cada poço da placa celular 3 vezes suavemente com 200 μL 1x PBS.
    8. Remova qualquer PBS restante.
    9. Imagine as células em qualquer Excitação/Emissão entre 358–461 nm ou sob qualquer configuração de filtro DAPI no microscópio.
    10. Exporte os dados dos valores de emissão como um arquivo Excel. Essa planilha será colada no software WAVE para normalização (passo 8).

8. Análise e normalização dos dados

NOTA: Para análise de dados, pode ser usado o "Wave" ou outro software. O protocolo fornecido é aplicável ao software Wave.

  1. Abra os resultados da análise em Wave (veja a Figura 3). A normalização é realizada usando valores obtidos do arquivo Excel gerado pelo leitor de microplacas após a coloração SRB (passo 7).
  2. Clique em "Normalizar".
  3. Na janela aberta, escolha "selecionar todos" seguido de "colar" para colar os dados copiados da planilha Excel gerada durante a etapa de normalização. Clique em "Aplicar". Esse procedimento normalizava automaticamente todos os dados experimentais.
  4. Para gerar um relatório, clique em "Exportar para", no painel que se abre à direita, selecione "Gerador de Relatórios de Teste de Estresse XF Cell Mito." Salve o arquivo gerado. Durante a análise, selecione apenas os poços atribuídos ao Teste de Estresse Mito (veja a Figura 3).
  5. Para gerar um relatório, clique em "Exportar para", no painel que abre à direita, selecione "Gerador de Relatórios do Teste de Estresse de Glicólise Celular XF". Salve o arquivo gerado. Durante a análise, selecione apenas os poços atribuídos ao Teste de Esforço de Glicólise (veja a Figura 3).

9. Células aderentes vs. não aderentes

NOTA: Células aderentes e não aderentes diferem em seu comportamento de crescimento, fixação superficial e necessidades de manuseio. Células aderentes (por exemplo, células cancerígenas, BMDMs) se fixam à superfície da cultura, então a placagem e a lavagem não exigem precauções especiais. Células não aderentes (por exemplo, células T, outros linfócitos) permanecem em suspensão e requerem diferentes métodos de centrifugação, ressuspensão e revestimento. Compreender essas diferenças é crucial para a semeadura celular precisa, tratamento medicamentoso e consistência nos ensaios.

  1. Certifique-se de que todas as células usadas para o experimento sejam cultivadas em um meio e recipiente de cultura celular de escolha pouco antes da execução do ensaio, mas depois transfira para a microplaca para realizar o ensaio.
    NOTA: Embora o meio XF RPMI seja recomendado para os tipos celulares descritos neste protocolo, para outros tipos de células, consulte o fabricante para garantir que o meio adequado seja utilizado.
  2. Para células aderentes (células cancerígenas, células BMDM), semear as células na Microplaca de Cultura Celular Pro XFe96/XF 4–5 horas antes do ensaio com uma densidade celular otimizada (ver passo 1) no meio de volume 200 μL e colocar em um incubador deCO2 a 37 °C.
    NOTA: As células BMDM podem ser placadas até 24 horas antes do ensaio, pois não proliferam e mantêm a mesma densidade celular. Para células aderentes de crescimento rápido, como linhagens celulares cancerígenas, recomenda-se placar no dia do ensaio caso não seja necessário tratamento adicional e analisá-las assim que as células estiverem ligadas para evitar o crescimento celular adicional. Se esse projeto não for possível, a normalização para quantidade/poço de proteína ou número/poço de núcleos é um passo necessário.
  3. Certifique-se de que os poços de canto para cada quatro cantos da microplaca estejam livres de células, mas preenchidos com meio, pois isso é medido como os poços de controle em branco.
  4. Após 3–5 horas de incubação, observe a microplaca para garantir que as células estejam fixadas à placa em um nível uniforme no fundo de cada poço.
  5. Se as células ainda não estiverem presas, a placa pode ser colocada na incubadora deCO2 a 37 °C por um tempo adicional até que as células estejam completamente fixadas.
  6. Em seguida, prepare a microplaca com células aderentes para lavagem conforme mencionado no passo 4 para prosseguir com o ensaio.
  7. Para células não aderentes (células T e outros linfócitos), recubra a microplaca com Poli-D-Lisina antes de adicionar as células à placa.
    NOTA: Embora o revestimento com Poly-D-Lisina seja recomendado neste protocolo, dependendo do tipo celular, outro revestimento de placa (por exemplo, colágeno, fibronectina, gelatina) pode ser mais adequado. Se estiver usando um revestimento alternativo, siga as instruções do fabricante para uso.
  8. Para revestir a microplaca, prepare 2,5 mL de uma solução de 20 μg/mL de Poli-D-Lisina (diluição 50x de 1 mg/1 mL de solução aquosa) em 0,1 M bicarbonato de sódio, pH 8,0 (o bicarbonato fornece o pH ideal para adsorção adesiva). Essa etapa pode ser realizada antes da realização do ensaio ou no próprio dia.
  9. Aplique 25 μL da solução em cada poço da placa e incube na bancada ou em um balancim de placa em temperatura ambiente por 20–30 minutos.
  10. Aspire ou pipete qualquer solução restante e lave cada poço duas vezes usando 200 μL de água livre de RNAase/DNAse.
  11. Espere até que os poços estejam secos (1–2 horas) antes de semear as células na microplaca.
  12. Em seguida, prepare a microplaca com células não aderentes para a etapa de lavagem, centrifugando a placa a 200 x g por 3 minutos sem freio, para garantir que as células fiquem suspensas no fundo de cada poço.
  13. Prossiga para a etapa 4 e continue o restante do ensaio conforme mencionado nos passos 5–7.

Resultados

Esse protocolo combinado foi desenvolvido para permitir que ambos os ensaios fossem realizados na mesma placa. Por exemplo, esse método foi usado para elucidar a sinalização crosstalk mGluR1−TCR sobre a proficiência metabólica das células T CD8+ durante aativação 10. Esse objetivo era avaliar o impacto da inibição de mGluR1 na transição para glicólise e nas mudanças da respiração mitocondrial, processos essenciais para o funcionamento ideal das células T, minimizando o número de células T usadas em cada experimento. A mesma técnica de placa única também foi aplicada efetivamente a outros tipos celulares, como macrófagos derivados da medula óssea aderente (BMDMs; Figura 4 e Figura 5), e para células não aderentes, como células mononucleares do sangue periférico humano (PMBCs; Figura 3). Foi demonstrado que o bloqueio de sinalização mGluR1 em células CD8+ CD8+ ativadas afeta a produção de energia mitocondrial e não mitocondrial. Em contraste, células ingênuas não apresentaram mudanças significativas em seus perfis metabólicos energéticos (Figura 6A,B). O teste de estresse de Mito com células T CD8+ ativadas mostrou alta respiração basal e máxima, bem como capacidade de reserva respiratória (Figura 6C). Células T tratadas com CPCCOEt, um antagonista não competitivo que bloqueia a sinalização a jusante quando o glutamato se liga ao mGluR1, apresentaram taxas de consumo de oxigênio (OCR) reduzidas como as células ingênuas e resultaram em diminuição da produção de ATP (Figura 6C). O ensaio de glicólise também mostrou que apenas células T CD8+ ativadas não tratadas produziam ATP via glicólise, e o tratamento com CPCCOE apresentou atividade metabólica comparável à condição naïve (Figura 6D). Esses resultados confirmam que a sinalização mGluR1 é essencial para o funcionamento correto das células T CD8⁺ durante a ativação.

figure-results-1
Figura 1: Esta figura ilustra a visão geral da configuração da placa microplate que inclui o ensaio de Estresse Mito e Glicólise na mesma placa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Carregando o cartucho de drogas. (A) Um mapa detalhado dos sensores e portas na parte traseira e frontal do cartucho, rotulando qual droga deve ser carregada em qual porta. (B) A orientação recomendada das guias no topo do cartucho para carregar as portas correspondentes e o posicionamento recomendado para usar a pipetadora multicanal sobre as guias. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Usando o programa WAVE para executar e analisar o ensaio. (A) O processo de implementação do programa inclui a seleção do tipo de ensaio, a atribuição de grupos, a criação do mapa de placas e a programação das portas de medicamentos. (B) A ordem dos medicamentos a serem carregados nas portas correspondentes depende se a amostra é Mito Stress ou Glicólise. (C) Um close da coloração SRB durante a última etapa da normalização. (D) Após a normalização, os dados da placa podem ser exportados separadamente tanto como Glicólise quanto como Teste de Estresse Mito para a mesma placa. (E) Os dados para Estresse Mito podem ser selecionados editando a seleção atual apenas para amostras de Estresse Mito. (F) Os dados para glicólise podem ser selecionados editando a seleção atual apenas para amostras de glicólise. Os dados de exemplo usados nesta figura são de uma análise de células mononucleares do sangue periférico humano. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Desempenho simultâneo da execução de Mito Stress na mesma placa. Macrófagos derivados da medula óssea, derivados de camundongos WT de 2 meses e camundongos Tusc2 KO, foram submetidos a ambos os tipos de análise. As células foram deixadas sem tratamento (sham) ou estimuladas com LPS (100 ng/mL) por 5 horas antes do placagem (30.000 células/poço). Testes de Estresse Mito e Glicólise foram realizados em paralelo para permitir uma comparação precisa, conforme mostrado na Figura 1. (A) Perfis de estresse Mito para diferentes tipos de células (WT e KO) e condições (ingênuas e ativadas), gerados usando software Wave. A normalização foi realizada por meio de coloração por SRB, conforme descrito no passo 7. (B) Gráficos de barras comparativos dos parâmetros analisados em cada teste. ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, teste T do aluno. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Realização simultânea dos testes de estresse de glicólise realizados na mesma placa. Macrófagos derivados da medula óssea, derivados de camundongos WT de 2 meses e camundongos Tusc2 KO, foram submetidos a ambos os tipos de análise. As células foram deixadas sem tratamento (sham) ou estimuladas com LPS (100 ng/mL) por 5 horas antes do placagem (30.000 células/poço). Testes de Estresse Mito e Glicólise foram realizados em paralelo para permitir uma comparação precisa, conforme mostrado na Figura 1. (A) Perfis de Estresse de Glicólise para diferentes tipos celulares (WT e KO) e condições (ingênuas e ativadas), gerados usando software Wave. A normalização foi realizada por meio de coloração por SRB, conforme descrito no passo 7. (B) Gráficos de barras comparativos dos parâmetros analisados em cada teste. ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, teste T do aluno. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Testes de Estresse Mito e Glicólise em uma única placa usando células T CD8⁺ purificadas de esplénócitos de camundongo. (A) Perfis representativos do Teste de Esforço Mitocondrial comparando mudanças dependentes de medicamentos na Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) de células T CD8+ realizadas com grupos de células T naïf, ativadas e ativadas + + inibidoras de mGluR1. (B) Perfis representativos do Teste de Glicólise comparando alterações dependentes de medicamentos na Taxa de Acidificação Extracelular (ECAR) de células T CD8+ realizadas em grupos inibidores naïf, ativado e ativado + + inibidor. (C) Gráficos de barras mostrando mudanças quantitativas em diferentes parâmetros da respiração mitocondrial de células T CD8+ em grupos inibidores naïf, ativado e ativado + + inibidor. As barras representam a média ± SEM (n = 4). (D) Gráficos de barras mostrando mudanças quantitativas em diferentes parâmetros de glicólise em células T CD8+ CD8+ naïf, ativadas e ativadas + inibidoras de mGluR1. As barras representam a média ± SEM (n = 4). ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, Teste T do Aluno. Esta figura é adaptada de Aquino et al.10. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Poço Final (μM)Volume da solução de estoque (μL)Volume de Mídia (uL)Porta 10x (μM)Volume adicionado à porta (μL)
Oligomicina do Porto A0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
Porto B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
Porto C Rotenona/Antimicina0.53002700524

Tabela 1: Preparação composta para carregamento de cartuchos sensores XFe96 para Mito Stress.

Poço FinalVolume da solução de estoque (μL)Volume de Mídia (μL)Porta 10xVolume adicionado à porta (μL)
Glicose Port A250 mM100240020
Oligomicina do porto B0,5 μM15028505 uM22
1,5 μM450255015 uM22
2,5 μM630189025 uM22
Porto C 2-DG50 mM30000500mM24

Tabela 2: Preparação do composto para carregamento de cartuchos sensores XFe96 para glicólise.

Discussão

O protocolo apresentado aqui permite comparações precisas e confiáveis de duas vias principais produtoras de energia, a fosforilação oxidativa (produção de ATP mitocondrial) e a glicólise anaeróbica (produção de ATP fora das mitocôndrias, sem necessidade de oxigênio), além de dois testes de esforço diferentes em uma única sequência. Além disso, o desenho experimental leva em conta o tipo de células analisadas, permitindo uma compreensão mais ampla da análise do metabolismo celular, ao mesmo tempo em que minimiza a quantidade de amostra e reagentes utilizados.

As diferenças entre os testes de Estresse Mito e Estresse de Glicólise realizados em protocolos de análise metabólica em tempo real projetados e vendidos pela Agilent, Inc. são substanciais. Esses dois ensaios exigem meios de ensaio distintos, medicamentos específicos e diferentes sistemas de instrumentos. O Teste de Esforço Mito utiliza meios de ensaio contendo glicose, L-glutamina e piruvanato, enquanto o Teste de Estresse de Glicólise utiliza meios sem glicose suplementados apenas com L-glutamina. Os ensaios são analisados com diferentes compostos: Oligomicina → FCCP → Antimicina A + Rotenona para o Teste de Esforço Mito, e Oligomicina → Glicose → 2-DG para o Teste de Esforço de Glicólise. Consequentemente, esses testes normalmente são realizados em placas separadas em momentos diferentes, já que o analisador metabólico em tempo real acomoda apenas uma placa por vez.

Para resolver essas limitações, foi desenvolvido um protocolo combinado que permite que ambos os ensaios sejam realizados na mesma placa usando o sistema de Teste de Estresse Mito em um artigoanterior 10. Estão fornecidas recomendações para analisar diferentes tipos celulares, incluindo células imunes, células cancerígenas, células aderentes e células em suspensão. Essas diretrizes podem ser aplicadas individualmente ou em combinação, oferecendo flexibilidade dependendo dos objetivos do experimentador e dos recursos disponíveis.

A normalização das células por meio do Ensaio SRB ou DAPI também permite maior flexibilidade, no caso de usar múltiplos tipos celulares com diferentes taxas/tamanhosde crescimento 9,11. Além disso, como essa técnica requer apenas uma placa para dois ensaios, ela pode ser combinada com uma variedade de tipos de amostras para medir processos metabólicos.

Fatores que influenciam o sucesso do método: (1) número ótimo de células por poço; (2) fixação eficiente de células; e (3) carregamento cuidadoso do cartucho, pois dois conjuntos distintos de medicamentos devem ser carregados em seções separadas do cartucho.

Vantagens científicas e experimentais do método incluem a comparação direta dentro do mesmo contexto biológico. Usar as mesmas células sob condições idênticas de cultura elimina a variabilidade entre placas ou colas e permite uma comparação mais precisa das funções mitocondrial e glicolítica na mesma amostra. Também inclui uma visão integrada do metabolismo celular. Medir simultaneamente tanto a fosforilação oxidativa (OXPHOS) quanto a glicólise fornece uma visão abrangente do metabolismo energético geral de uma célula e sua flexibilidade em alternar entre vias. Esse ensaio paralelo também reduz a variabilidade biológica. Diferenças na densidade de placagem celular, número de passagem ou condições ambientais são minimizadas, pois ambos os ensaios são realizados na mesma população de células, o que leva a uma melhora na reprodutibilidade. Realizar ambos os testes simultaneamente reduz a variabilidade de uma corrida para a outra causada pela calibração do cartucho do sensor, mudanças de temperatura ou preparação do reagente.

Os benefícios técnicos dessa técnica incluem aumento da eficiência ao combinar ensaios, que economizam tempo, reagentes e consumíveis de placa, tornando-a importante para estudos em grande escala ou de alta produtividade. Isso permite requisitos de amostra menores. Apenas uma placa de células é necessária, o que é vantajoso ao trabalhar com células primárias limitadas ou raras (por exemplo, linfócitos, células derivadas do cérebro). Uma normalização melhor entre ensaios ocorre porque ambos os testes usam a mesma placa, normalização (por exemplo, para o conteúdo de proteína ou número de células), e é mais consistente e confiável. Com essa consistência, a correlação com dados é aprimorada. O emparelhamento direto dos parâmetros mitocondriais e glicolíticos da mesma amostra facilita o perfilamento metabólico e análises estatísticas.

A única limitação conhecida dessa técnica é que combinar dois protocolos em uma única placa reduz o número de replicações disponíveis no poço. Recomenda-se limitar o número de condições por placa para garantir pelo menos 8 poços replicados por condição.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Saúde e Disparidades em Saúde das Minorias (NIMHD), subsídio número 5U54MD007586-37, projeto piloto de A. Ivanova; O projeto de UG3HG013248 pesquisa 2, PI-Ivanova, também recebeu algum apoio da Genprex Inc. do Centro de Diversidade para Pesquisa do Genoma, projeto de pesquisa 2, da PI-Ivanova.  Além disso, essa pesquisa foi realizada nas Instalações Centrais do Meharry Medical College, que recebem apoio das bolsas do NIH MD007586, CA163069 e S10RR025497.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos centrífugas de 15 mL, embalados com tampa de rosca, estéreis, 500 tubos/unidadeGenesee Scientific21-408B
Ponteiras da Pipeta Biologix-200 & mu; l Estendido (Mochila, Estéril)Biologix USASKU 21-0200
BioTek Sinergia H1BIOSPX
Microscópio de fluorescência BZ-X700Keyence
Corning  Reservatórios Estéreis de Reagentes Descartáveis CostarFisher4873
Solução de D-(+)-glicose 45% em H2OSigmaG9769
DAPI, cloridrato  Thermofisher ScientificD1306
Centrífuga Eppendorf 5810 REppendorf
GenClone Soro Bovino Fetal Inativado por CalorGenesee Scientific25-514H
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081
Olympus Plastics 22-284, Olympus 1,7ml microtubos, transparente, polipropileno estéril, à prova de fervura, ster, 50/saco, 250 tubos/unidadeGenesee Scientific22-284
Olympus Plastics 28-108, tubos centrífugos cônicos de 50ml, polipropileno a granel, estéreis, 20 sacos de 25 tubos, 500/unidadeGenesee Scientific28-108
Paraformaldeído 16% solução de grau EMCiência da Microscopia Eletrônica15710
Hidrobrometo de poli-D-lisina liofilizadoSigmaP6407
Banho-maria Precision 180Ciência de Precisão51221060
Incubadora Precision Scientific GCA Modelo 26Thelco51221091
QBI 120-095-671 Mistura de Penicilina/Estreptomicina, 100x Mistura de Pen/Estreptococo, 10 x 10 mL/unidadeGenesee Scientific25-827
QBI PBS, 1x, sem Ca, Mg, Fenol Vermelho, 0,1 Estéril FiltradoGenesee Scientific25-507B
RPMI 1640, com L-GlutaminaGenesee Scientific25-506
Seahorse XF RPMI medium, pH 7,4, 500 mLAgilent103576-100
Analisador Seahorse XFe96Agilent
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakAgilent103792-100inclui 18 cartuchos sensores XFe96/XF Pro, 18 microplacas de cultura celular XFe96/XF Pro, 1 frasco de Seahorse XF Calibrant Solution 500mL e 3 pares de Guias de Carregamento XF
Bicarbonato de sódioSigmaS6014
Piruvato de Sódio (100mM) 100XGibco11360-070
Ensaio SRB (Kit de Ensaio de Sulfhodamina B)Abcamab235935
Pipettor Multicanal de Alto Desempenho Ergonomo VWR SignatureAvantor89079-956
Kit de Teste de Estresse Mito da Célula XFAgilent103015-100
Kit de Ensaio de Taxa Glicolítica XFAgilent103344-100

Referências

  1. Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
  2. Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
  3. Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
  4. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
  5. Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
  6. Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
  7. Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
  8. Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
  9. Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
  10. Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
  11. Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Teste de Estresse MitocondrialTeste de Estresse Glicol ticoAn lise Metab lica em Tempo RealMetabolismo Energ tico CelularMacr fagos da Medula sseaMetabolismo de Linf citosRespira o MitocondrialMedi o da Glic lise

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.