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Artigo de método

Isolamento Primário, Cultura e Verificação Fenotípica de Condrócitos Articulares do Joelho de Rato

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DOI:

10.3791/69509

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7 de novembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento e a cultura de condrócitos articulares primários de joelho de rato usando digestão enzimática sequencial. O método produz condrócitos com características fenotípicas validadas, fornecendo aos pesquisadores uma abordagem confiável para aplicações de pesquisa de cartilagem.

Resumo

O dano à cartilagem resultante de trauma, envelhecimento ou condições inflamatórias continua sendo um desafio clínico significativo devido à capacidade regenerativa inerentemente limitada do tecido. Os condrócitos, sendo o único componente celular da cartilagem, são responsáveis por manter a estrutura e função da matriz extracelular, tornando-os essenciais para a compreensão da fisiologia, patologia e regeneração da cartilagem. O presente estudo apresenta um protocolo abrangente e padronizado para o isolamento, cultura e verificação fenotípica de condrócitos articulares primários de ratos da articulação do joelho. O procedimento utiliza ratos jovens e lactentes para garantir a máxima viabilidade celular e emprega digestão enzimática sequencial com tripsina e colagenase tipo II para extração celular eficiente. O fenótipo de condrócitos é verificado por meio de imunofluorescência de colágeno tipo II, análise de citometria de fluxo e ensaios de estimulação com interleucina (IL)-1β para confirmar a identidade celular e a responsividade inflamatória. Esse fluxo de trabalho otimizado e reprodutível permite a geração de culturas de condrócitos de alta pureza adequadas para triagem de drogas, investigações mecanicistas e aplicações de engenharia de tecidos, avançando na pesquisa de biologia da cartilagem.

Introdução

A cartilagem é um tipo especializado de tecido conjuntivo que desempenha várias funções cruciais, incluindo fornecer suporte, amortecimento e absorção de choque1. Desempenha um papel vital na manutenção da estabilidade estrutural e na garantia da mobilidade dentro do sistema esquelético 2,3. Lesão mecânica, alterações degenerativas, inflamação ou anormalidades metabólicas podem causar danos à cartilagem 4,5,6. Devido à sua inerente falta de vasos sanguíneos e nervos, combinada com a capacidade proliferativa limitada dos condrócitos, o reparo da cartilagem apresenta desafios significativos. Doenças como osteoartrite (impulsionada por alterações degenerativas e lesão mecânica) e artrite reumatoide (causada por respostas inflamatórias autoimunes) podem causar danos irreversíveis à cartilagem, diminuindo muito a qualidade de vida dos pacientes 7,8,9. Como o tipo celular exclusivo dentro do tecido cartilaginoso, os condrócitos são responsáveis por funções-chave, como secreção e manutenção da matriz extracelular, suporte ao desenvolvimento esquelético, participação no amortecimento e reparo articular e regulação central do crescimento e metabolismo da cartilagem 10,11,12.

Os condrócitos estão confinados dentro de lacunas da matriz avascular, resultando em capacidade severamente limitada para sua própria proliferação e reparo tecidual13,14. O estado funcional dos condrócitos determina diretamente a saúde do tecido cartilaginoso15. A disfunção condrócita, causada por envelhecimento, inflamação, trauma ou fatores genéticos, resulta em diminuição da síntese de matriz e aumento da degradação16,17. Esse processo patológico leva à degeneração da cartilagem (como na osteoartrite), levando ao comprometimento de suas funções essenciais de suporte, amortecimento e lubrificação. A capacidade regenerativa limitada da cartilagem é a principal razão para o desafio significativo em seu reparo e constitui uma área de pesquisa chave em ortopedia moderna e medicina regenerativa. A pesquisa atual sobre cartilagem tornou-se um foco importante no campo, com intervenções baseadas em medicamentos, engenharia de tecidos e terapia genética, todas exigindo o isolamento de condrócitos para estudos in vitro 18,19,20,21,22,23,24,25. Consequentemente, isolar e identificar condrócitos constitui uma etapa crítica em muitas abordagens experimentais. Embora linhagens celulares semelhantes a condrócitos imortalizadas, como SW1353, sejam usadas como substitutos convenientes em alguns estudos, elas carecem da expressão de marcadores fenotípicos críticos, principalmente o colágeno tipo II, que é essencial para a função autêntica dos condrócitos e a formação da matriz26. Portanto, os condrócitos primários continuam sendo o padrão-ouro para pesquisas que requerem relevância fisiológica. Em comparação com protocolos publicados anteriormente que exigem múltiplas combinações de enzimas ou manipulação mecânica extensiva, a abordagem de digestão enzimática simplificada reduz a complexidade e o tempo de processamento em comparação com métodos que requerem várias combinações de enzimas ou manipulação mecânica extensiva. Além disso, a incorporação de etapas de validação abrangentes garante a identificação consistente de condrócitos funcionais e aumenta a reprodutibilidade entre experimentos e laboratórios.

Os condrócitos são caracterizados por sua secreção de colágeno tipo II, enquanto sob estimulação por fatores inflamatórios, eles sintetizam e liberam extensivamente metaloproteinases da matriz (MMPs)27. Portanto, após o isolamento dos condrócitos, as células foram identificadas por imunofluorescência de colágeno tipo II e a pureza dos condrócitos foi avaliada por citometria de fluxo. E estimulado com Interleucina (IL)-1β para confirmar sua síntese característica e secreção de metaloproteinases da matriz. Este estudo descreve o processo de extração e caracterização de condrócitos de camundongos neonatais, estabelecendo uma base para experimentos subsequentes relacionados a condrócitos.

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Protocolo

O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo comitê de ética de cuidados e bem-estar de animais experimentais do Hospital da Amizade China-Japão (No. zryhyy21-21-05-16). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Animais de experimentação e trabalhos preparatórios

NOTA: A cartilagem das articulações de ratos, coelhos e humanos após artroplastia total do joelho pode ser usada para isolamento de condrócitos. No entanto, devido à sua maior viabilidade, ratos lactentes foram utilizados para extração de condrócitos neste estudo.

  1. Transporte de ratos lactentes da instalação de produção animal experimental para o laboratório usando recipientes de transferência especializados.
  2. Eutanasiar ratos lactentes por asfixia por CO2 (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) e enxaguar suas superfícies corporais com solução estéril.
  3. Mergulhe os ratos lactentes eutanasiados em etanol a 75% por 10 min para desinfetar os contaminantes da superfície.
  4. Transfira os ratos lactentes desinfetados para um armário de biossegurança e coloque-os em placas de Petri estéreis.
    NOTA: A limpeza completa da superfície e a imersão em etanol de ratos lactentes são etapas críticas para evitar a contaminação bacteriana ou fúngica, que pode afetar adversamente os experimentos subsequentes.

2. Isolamento do tecido da cartilagem articular

NOTA: A cartilagem neonatal aparece como uma camada translúcida, branco-azulada, cobrindo a epífise óssea. Técnicas assépticas rigorosas devem ser seguidas durante esta etapa para evitar contaminações que possam comprometer experimentos subsequentes.

  1. Isole a articulação do joelho do rato em lactação com bisturi e tesoura oftálmica e, em seguida, remova o tecido cutâneo sobrejacente.
  2. Transfira a articulação do joelho dissecada para uma nova placa de Petri estéril e substitua o bisturi e a tesoura oftálmica.
  3. Colha a cartilagem articular da articulação do joelho usando um bisturi e, em seguida, corte completamente o tecido conjuntivo circundante com uma tesoura oftálmica.

3. Digestão do tecido cartilaginoso

NOTA: Use tripsina para digerir os tecidos conjuntivos ao redor da cartilagem, seguida de colagenase II a 0,2% para digestão da matriz cartilaginosa.

  1. Adicione a cartilagem colhida a 3 volumes de tripsina a 0,25% e incube em um agitador termostático a 37 ° C com agitação por 30 min.
  2. Termine a digestão adicionando PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Remova os tecidos aderentes da cartilagem usando uma tesoura oftálmica. Centrifugar (4 °C, 500 × g, 5 min) e rejeitar o sobrenadante.
  3. Ressuspenda o tecido cartilaginoso em PBS, centrifugue (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem 3 vezes.
  4. Adicionar colagenase II a 0,2% ao tecido cartilaginoso processado e digerir num agitador termostático a 37 °C com agitação durante 4 h.

4. Isolamento e cultura de condrócitos

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis em um gabinete de biossegurança. Luvas estéreis devem ser usadas durante a dissociação mecânica do tecido cartilaginoso usando um êmbolo de seringa no filtro de células para evitar contaminação experimental. Em condições de cultura padrão, os condrócitos primários normalmente requerem aproximadamente 2-3 dias para atingir 80%-90% de confluência para a primeira passagem.

  1. Colocar um filtro de células de 200 μm sobre uma placa de cultura estéril e filtrar a suspensão de cartilagem digerida através da tela.
  2. Triture os fragmentos de cartilagem residual no filtro usando um êmbolo de seringa estéril e, em seguida, enxágue o filtro com meio DMEM completo.
  3. Recolher todos os filtrados, centrifugar (4 °C, 500 × g, 5 min) e rejeitar o sobrenadante.
  4. Ressuspenda o pellet em PBS, centrifugue (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
  5. Ressuspender as células em meio DMEM completo e transferir para um balão de cultura T25.
  6. Incubar o balão numa incubadora humidificada (37 °C, 5% CO2).
  7. Células de passagem nesta confluência usando tripsina-EDTA e subcultura na proporção de 1:2.

5. Coloração de imunofluorescência de colágeno tipo II para identificação de condrócitos

NOTA: Os condrócitos aderidos são caracterizados por uma morfologia fusiforme e poligonal. Todas as análises de biomarcadores apresentadas neste estudo foram realizadas usando células na Passagem 2. Os condrócitos na passagem 3 começam a exibir uma desdiferenciação mais pronunciada, caracterizada por uma mudança em direção a uma morfologia fusiforme, semelhante a fibroblastos, e uma desaceleração na taxa de proliferação. Essa mudança fenotípica torna-se mais evidente após a passagem 4. Na passagem 6, a grande maioria das células adota uma forma alongada, semelhante a fibroblastos. As diluições de anticorpos foram determinadas com base na recomendação do fabricante e validadas por nossos experimentos preliminares para garantir a especificidade e a intensidade do sinal ideais.

  1. Semeie os condrócitos em uma placa de 24 poços e cultive por 24 h para permitir a adesão celular.
  2. Descarte o meio de cultura e lave as células 3 vezes com PBS (adicione PBS a cada poço, incube por 5 min e depois aspire).
  3. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 10 min e lave 3 vezes com PBS.
  4. Permeabilize as células com 0,3% de Triton X-100 (preparado em PBS) por 10 min.
  5. Lave as células 3 vezes com PBS e, em seguida, bloqueie com solução de bloqueio sem animais (150 μL / poço, diluído 5× em PBS) à temperatura ambiente por 1 h.
  6. Remover a solução de bloqueio e incubar com anticorpo primário (anti-Col II, diluição 1:200) durante a noite a 4 °C.
  7. Recupere o anticorpo primário e lave as células 3 vezes com PBS.
  8. Adicione o anticorpo secundário IgG de coelho conjugado com Alexa Fluor 488 (diluição 1:50) e incube a 37 °C por 1,5 h no escuro.
  9. Remova o anticorpo secundário e lave as células 3 vezes com PBS.
  10. Monte com meio antidesbotamento contendo DAPI e seque no escuro por 10 min.
  11. Observe e capture imagens usando um microscópio de fluorescência invertida.

6. Análise por citometria de fluxo da pureza dos condrócitos

NOTA: Os condrócitos são caracterizados por sua capacidade de sintetizar e secretar colágeno tipo II, que serve como um marcador definitivo para identificação. A linhagem celular de condrossarcoma SW1353, embora exiba algumas características condrocíticas, carece de capacidade de secreção de colágeno tipo II e, portanto, serve como controle negativo neste experimento.

  1. Digerir os condrócitos e as células SW1353 usando tripsina livre de EDTA.
  2. Neutralize a digestão com meio DMEM completo e ressuspenda as células em PBS.
  3. Incube as células com solução de fixação/permeabilização por 15 min e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de lavagem.
  4. Centrifugue (500 × g, 5 min), descarte o sobrenadante e incube com 100 μL de anticorpo anti-colágeno tipo II (diluição 1:100) por 15 min protegido da luz, seguido pela adição de 1 mL de tampão de lavagem.
  5. Centrifugue (500 × g, 5 min), descarte o sobrenadante e incube com anticorpo secundário IgG de coelho conjugado com Alexa Fluor 488 por 30 min protegido da luz e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de lavagem.
  6. Centrifugar (500 × g, 5 min), descartar o sobrenadante, ressuspender cada amostra em tampão de lavagem de 200 μL e analisar por citometria de fluxo.

7. Estimulação de condrócitos por IL-1β

NOTA: A produção de metaloproteinases da matriz (MMPs) em resposta à estimulação da IL-1β é uma característica marcante dos condrócitos. Portanto, este estudo emprega a estimulação de IL-1β para validar essa característica fenotípica em condrócitos isolados.

  1. Digerir os condrócitos dos frascos de cultura e ressuspender em meio DMEM completo.
  2. Conte as células e ajuste a concentração para 5 × 105 células/mL usando DMEM completo.
  3. Semeie células em uma placa de 6 poços (24 poços no total), com 12 poços designados como grupo de controle em branco e 12 poços como grupo de estimulação de IL-1β.
  4. Incubar a placa numa incubadora de cultura de células durante 12 h.
  5. Adicione 10 ng/mL de IL-1β ao grupo de estimulação após a adesão celular completa.
  6. Colete sobrenadantes de cultura de células após 24 h para análise do ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).
  7. Lave as células duas vezes com PBS.
  8. Lyse 6 poços de controle e 6 poços estimulados por IL-1β com tampão RIPA para análise subsequente de Western blot.
  9. Extraia RNA de 6 poços de controle e 6 poços estimulados por IL-1β usando TRIzol para análise de qPCR.

8. Análise quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR)

NOTA: Todos os experimentos relacionados ao RNA foram realizados usando consumíveis tratados com DEPC. Resumidamente, os tubos e pontas foram embebidos em DEPC a 0,1% por 12h, autoclavados (121 °C, 20 min) para inativar as RNases e o DEPC residual e secos em estufa antes do uso.

  1. Adicione 1 mL de Trizol ao pellet celular e homogeneize usando um homogeneizador. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
  2. Adicione 0,2 mL de clorofórmio e vórtice vigorosamente por 30 s. Incube em temperatura ambiente por 3 min.
  3. Centrifugar a 4 °C, 12.000 × g durante 15 min. Transferir a fase aquosa incolor para um novo tubo de microcentrífuga e adicionar um volume igual de isopropanol.
  4. Misture bem e incube em temperatura ambiente por 10 min. Centrifugar a 4 °C, 12.000 × g durante 10 min. Descarte o sobrenadante e retenha o pellet de RNA.
  5. Adicione 1 mL de etanol 75% pré-resfriado ao pellet de RNA. Agitar completamente e centrifugar a 4 °C, 12.000 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e retenha o pellet de RNA.
  6. Seque ao ar o pellet de RNA em um gabinete de biossegurança. Dissolva o RNA em 20 μL de água livre de RNase.
  7. Meça a concentração e a qualidade do RNA usando um espectrofotômetro Nanodrop.
  8. Transcreva reversamente o RNA total em cDNA usando um kit de transcrição reversa.
  9. Prepare a mistura de reação contendo 1 μg de RNA total, 4 μL de solução de cloreto de magnésio, 2 μL de mistura de dNTP, 0,5 μL de inibidor de RNase, 0,6 μL de transcriptase reversa de AMV, 1 μL de primers aleatórios e água livre de RNase para ajustar o volume final para 20 μL.
  10. Incubar a reação a 42 °C durante 15 min, seguida de 95 °C durante 5 min. Arrefecer a 4 °C durante 5 min e, em seguida, diluir o ADNc com água isenta de RNase.
  11. Prepare a mistura de reação de PCR contendo 2 μL de cDNA, 10 μL de SYBR Green Real-time PCR Master Mix, primers diretos e reversos (Tabela 1) a uma concentração final de 0,2 μmol/L cada e água livre de RNase até um volume final de 20 μL.
  12. Defina as condições de PCR da seguinte forma: pré-desnaturação a 95 °C por 1 min, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 60 °C por 15 s e 72 °C por 45 s. Colete dados de fluorescência durante a etapa de extensão de 72 °C.
  13. Após a reação, registre os valores de TC para cada amostra e a referência interna. Calcular os níveis de expressão relativa dos genes-alvo utilizando o método 2-ΔΔCT.

9. Ensaio ELISA

NOTA: Prepare a solução de trabalho de anticorpos biotinilados e a solução de trabalho do conjugado enzimático antes de usar.

  1. Retire o kit ELISA da geladeira com 30 minutos de antecedência e deixe-o equilibrar à temperatura ambiente.
  2. Prepare todas as soluções necessárias de acordo com as instruções do kit.
  3. Adicionar 100 μL de amostras ou soluções-padrão (com concentrações variáveis) aos alvéolos designados (os poços zero contêm apenas tampão de diluição padrão/amostra). Selar a placa com película adesiva e incubar a 37 °C durante 90 min (excluir os alvéolos de controlo em branco).
  4. Descarte o líquido e lave cada poço com tampão de lavagem de 350 μL. Incube por 30 s, descarte o líquido e seque em papel absorvente grosso. Repita a lavagem 4 vezes.
  5. Adicione 100 μL de solução de trabalho de anticorpos biotinilados a cada poço. Selar a placa e incubar a 37 °C durante 60 min (excluir os alvéolos de controlo em branco).
  6. Descarte o líquido e lave cada poço 4 vezes, conforme descrito na etapa 4.
  7. Adicione 100 μL de solução de trabalho de conjugado enzimático a cada poço. Selar a placa e incubar a 37 °C durante 30 min (excluir os alvéolos de controlo em branco).
  8. Descarte o líquido e lave cada poço 4 vezes, conforme descrito na etapa 4.
  9. Adicione 100 μL de solução de substrato a cada poço. Proteger da luz e incubar a 37 °C durante 15 min.
  10. Adicione 100 μL de solução de parada a cada poço, misture bem e meça a densidade óptica (OD) a 450 nm imediatamente.
  11. Gere uma curva padrão usando o software CurveExpert e calcule as concentrações da amostra.

10. Análise de Western blot

NOTA: Antes do experimento, prepare o tampão de eletroforese, o tampão de transferência, TBST, 5% de leite desnatado e corte a membrana de PVDF no tamanho apropriado com antecedência. Posteriormente, capture os sinais quimioluminescentes usando um sistema de imagem por quimioluminescência. Defina o instrumento para o modo automático ou manual para exposição de gradiente, que normalmente varia de 10 s a 5 min, para garantir que os sinais sejam capturados dentro da faixa dinâmica linear e para evitar a saturação de pixels. Após a captura do sinal, selecione a imagem de exposição onde as bandas alvo estão claras e o fundo é baixo para análise quantitativa subsequente.

  1. Prepare o tampão de lise RIPA (contendo 1% de PMSF e 1% de inibidor de fosfatase) e adicione o tampão de lise RIPA na proporção de 250 μL por alvéolo de uma placa de 6 poços.
  2. Lise as células usando um disruptor ultrassônico (3 ciclos, 7-10 s cada) e incube no gelo por 30 min.
  3. Centrifugar o lisado a 4 °C,12.000 × g durante 10 min e, em seguida, recolher o sobrenadante para quantificação das proteínas.
  4. Determine a concentração de proteína usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
  5. Ajuste as concentrações de proteína para o mesmo nível usando o tampão de lise RIPA.
  6. Adicione 5× Buffer de carregamento às amostras na proporção de 4:1 (amostra: buffer).
  7. Ferver as amostras durante 10 min, centrifugar a 4 °C, 12 000 × g durante 10 min e recolher o sobrenadante para electroforese.
  8. Monte o gel SDS-PAGE na câmara de eletroforese e encha com tampão de eletroforese até que o pente esteja submerso.
  9. Remova o favo, carregue amostras em poços e adicione uma escada de proteína às pistas de referência.
  10. Execute a eletroforese até que o corante azul de bromofenol atinja o fundo do gel, desmonte o aparelho e recupere o gel.
  11. Monte o "sanduíche" de transferência e execute a transferência úmida em tensão constantetage.
  12. Bloqueie a membrana de PVDF com 5% de leite desnatado em TBST por 1 h em temperatura ambiente.
  13. Incubar com anticorpo primário diluído durante a noite a 4 °C.
  14. Recupere o anticorpo primário e lave a membrana com TBST (5 × 5 min).
  15. Incubar com anticorpo secundário conjugado com HRP por 90 min em temperatura ambiente.
  16. Recupere o anticorpo secundário e lave a membrana com TBST (5 × 5 min).
  17. Prepare a solução de substrato ECL e armazene-a protegida da luz.
  18. Aplique o substrato ECL na membrana e capture sinais quimioluminescentes usando um sistema de imagem com exposição gradiente.
  19. Analise as intensidades das bandas usando o software ImageJ e calcule os níveis relativos de expressão de proteínas para análise posterior.

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Resultados

A coloração por imunofluorescência para colágeno tipo II demonstrou que os condrócitos isolados foram fortemente positivos (Figura 1A). A análise por citometria de fluxo demonstrou ainda que mais de 98% das células foram positivas para colágeno tipo II (Figura 1B), enquanto as células SW1353 de controle negativo foram negativas (Figura 1C). Após estimulação com 10 ng/ml de IL-1β por 24 h, o Western blotting demonstrou uma elevação a...

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Discussão

O protocolo descrito aqui oferece várias vantagens importantes para o isolamento e cultura de condrócitos articulares primários de ratos. O uso de ratos lactentes é fundamental para alcançar o rendimento e a viabilidade celular ideais, pois a cartilagem de animais jovens contém mais condrócitos proliferativos e menos matriz mineralizada em comparação com a cartilagem adulta. Essa seleção de idade melhora significativamente a eficiência da digestão enzimática e a subsequente recuperação c...

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Divulgações

Os autores relatam não haver conflitos de interesse neste trabalho.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Financiamento Nacional de Pesquisa Clínica Hospitalar de Alto Nível e pela Iniciativa de Profissionais Médicos de Elite do Hospital da Amizade China-Japão (NO. ZRJY2025-QM05).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% de paraformaldeídoSolarbioP1110
5 e vezes; Buffer de CarregamentoSolarbioP1040
Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbit IgGBiotecnologia Zhongshan JingqiaoZF-0511
Solução de Bloqueio Livre de AnimaisTecnologia de Sinalização Celular15019
Anticorpo anticolágeno IIAbcamab34712
Kit de Ensaio de Proteína do Ácido Bicinconínico (BCA)SolarbioPC0020
Colanase IIYeasen Biotechnology40508ES60
Meio de Montagem Fluorescente contendo DAPIBiotecnologia Zhongshan JingqiaoZLI-9556
Eagle Médio Modificado de DulbeccoSolarbio11995
Soro fetal bovino (FBS)SolarbioS9010
Peroxidase de raiz-forte (HRP) - IgG Anti-Coelho conjugado de cabraBiotecnologia Zhongshan JingqiaoZB-2301
IL-1 e beta;Peprotech400-01B
MMP13 Coelho mAbABclonalA11148
MMP3 Coelho mAbABclonalA11418
Leite desnatadoSolarbioD3840
Soro Tamponado com Fosfato (PBS)SolarbioP1020
Membrana PVDFThermo Fisher Scientific88518
Rat MMP-13 ELISA KitNouvsNBP3-06931
Rat MMP-3 ELISA KitNouvsNBP3-06894
Kit de Transcrição ReversaPromegaA3500
Buffer de Lise RIPASolarbioR0010
Água livre de RNaseSolarbioR1600
SDS-PAGE GelEpizimaPG112
SYBR Mistura Mestre PCR em tempo real verdeToyoboQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
TrizolSolarbio15596026
TripsinaSolarbioT1320
Kit de Substrato de Quimioluminescência ECL Ultra-SensívelNCM BiotechP10300
β-Coelho Actin mAbABclonalAC026

Referências

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