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Artigo de método
* These authors contributed equally
Este protocolo descreve o isolamento e a cultura de condrócitos articulares primários de joelho de rato usando digestão enzimática sequencial. O método produz condrócitos com características fenotípicas validadas, fornecendo aos pesquisadores uma abordagem confiável para aplicações de pesquisa de cartilagem.
O dano à cartilagem resultante de trauma, envelhecimento ou condições inflamatórias continua sendo um desafio clínico significativo devido à capacidade regenerativa inerentemente limitada do tecido. Os condrócitos, sendo o único componente celular da cartilagem, são responsáveis por manter a estrutura e função da matriz extracelular, tornando-os essenciais para a compreensão da fisiologia, patologia e regeneração da cartilagem. O presente estudo apresenta um protocolo abrangente e padronizado para o isolamento, cultura e verificação fenotípica de condrócitos articulares primários de ratos da articulação do joelho. O procedimento utiliza ratos jovens e lactentes para garantir a máxima viabilidade celular e emprega digestão enzimática sequencial com tripsina e colagenase tipo II para extração celular eficiente. O fenótipo de condrócitos é verificado por meio de imunofluorescência de colágeno tipo II, análise de citometria de fluxo e ensaios de estimulação com interleucina (IL)-1β para confirmar a identidade celular e a responsividade inflamatória. Esse fluxo de trabalho otimizado e reprodutível permite a geração de culturas de condrócitos de alta pureza adequadas para triagem de drogas, investigações mecanicistas e aplicações de engenharia de tecidos, avançando na pesquisa de biologia da cartilagem.
A cartilagem é um tipo especializado de tecido conjuntivo que desempenha várias funções cruciais, incluindo fornecer suporte, amortecimento e absorção de choque1. Desempenha um papel vital na manutenção da estabilidade estrutural e na garantia da mobilidade dentro do sistema esquelético 2,3. Lesão mecânica, alterações degenerativas, inflamação ou anormalidades metabólicas podem causar danos à cartilagem 4,5,6. Devido à sua inerente falta de vasos sanguíneos e n....
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O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo comitê de ética de cuidados e bem-estar de animais experimentais do Hospital da Amizade China-Japão (No. zryhyy21-21-05-16). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Animais de experimentação e trabalhos preparatórios
NOTA: A cartilagem das articulações de ratos, coelhos e humanos após artroplastia total do joelho pode ser usada para isolamento de condrócitos. No entanto, devido à sua maior viabilidade, ratos lactentes foram utilizados para extração de condró....
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A coloração por imunofluorescência para colágeno tipo II demonstrou que os condrócitos isolados foram fortemente positivos (Figura 1A). A análise por citometria de fluxo demonstrou ainda que mais de 98% das células foram positivas para colágeno tipo II (Figura 1B), enquanto as células SW1353 de controle negativo foram negativas (Figura 1C). Após estimulação com 10 ng/ml de IL-1β por 24 h, o Western blotting demonstrou uma elevação a.......
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O protocolo descrito aqui oferece várias vantagens importantes para o isolamento e cultura de condrócitos articulares primários de ratos. O uso de ratos lactentes é fundamental para alcançar o rendimento e a viabilidade celular ideais, pois a cartilagem de animais jovens contém mais condrócitos proliferativos e menos matriz mineralizada em comparação com a cartilagem adulta. Essa seleção de idade melhora significativamente a eficiência da digestão enzimática e a subsequente recuperação c.......
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Os autores relatam não haver conflitos de interesse neste trabalho.
Este estudo foi apoiado pelo Financiamento Nacional de Pesquisa Clínica Hospitalar de Alto Nível e pela Iniciativa de Profissionais Médicos de Elite do Hospital da Amizade China-Japão (NO. ZRJY2025-QM05).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% de paraformaldeído | Solarbio | P1110 | |
| 5 e vezes; Buffer de Carregamento | Solarbio | P1040 | |
| Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbit IgG | Biotecnologia Zhongshan Jingqiao | ZF-0511 | |
| Solução de Bloqueio Livre de Animais | Tecnologia de Sinalização Celular | 15019 | |
| Anticorpo anticolágeno II | Abcam | ab34712 | |
| Kit de Ensaio de Proteína do Ácido Bicinconínico (BCA) | Solarbio | PC0020 | |
| Colanase II | Yeasen Biotechnology | 40508ES60 | |
| Meio de Montagem Fluorescente contendo DAPI | Biotecnologia Zhongshan Jingqiao | ZLI-9556 | |
| Eagle Médio Modificado de Dulbecco | Solarbio | 11995 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Solarbio | S9010 | |
| Peroxidase de raiz-forte (HRP) - IgG Anti-Coelho conjugado de cabra | Biotecnologia Zhongshan Jingqiao | ZB-2301 | |
| IL-1 e beta; | Peprotech | 400-01B | |
| MMP13 Coelho mAb | ABclonal | A11148 | |
| MMP3 Coelho mAb | ABclonal | A11418 | |
| Leite desnatado | Solarbio | D3840 | |
| Soro Tamponado com Fosfato (PBS) | Solarbio | P1020 | |
| Membrana PVDF | Thermo Fisher Scientific | 88518 | |
| Rat MMP-13 ELISA Kit | Nouvs | NBP3-06931 | |
| Rat MMP-3 ELISA Kit | Nouvs | NBP3-06894 | |
| Kit de Transcrição Reversa | Promega | A3500 | |
| Buffer de Lise RIPA | Solarbio | R0010 | |
| Água livre de RNase | Solarbio | R1600 | |
| SDS-PAGE Gel | Epizima | PG112 | |
| SYBR Mistura Mestre PCR em tempo real verde | Toyobo | QPK-201 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| Trizol | Solarbio | 15596026 | |
| Tripsina | Solarbio | T1320 | |
| Kit de Substrato de Quimioluminescência ECL Ultra-Sensível | NCM Biotech | P10300 | |
| β-Coelho Actin mAb | ABclonal | AC026 |
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