Um Fluxo de Trabalho Modular para Análise Quantitativa, Estrutural e Funcional de Biofilmes de Leptospira

Summary

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho modular BSL-2 que combina ensaios de biomassa cristal-violeta, cinética de contraste de fase em time-lapse, mapeamento confocal 3D/matricial, ultraestrutura SEM e um módulo in vivo de infecção por hamster para cultivar, quantificar, caracterizar e investigar o papel funcional do biofilme de Leptospira , possibilitando avaliação padronizada de mutantes e intervenções anti-biofilme em laboratórios.

Abstract

Aqui, apresentamos um conjunto integrado de protocolos para o cultivo, monitoramento quantitativo, caracterização estrutural e funcional de biofilmes de Leptospira spp. ao longo do tempo. Esse fluxo de trabalho combina ensaios de microtitulação de violeta cristalino para medir biomassa de biofilme em múltiplos pontos temporais, com uma abordagem de fracionamento resolvido no tempo que distingue populações bacterianas acopladas (biofilme) e não ligadas (fase líquida), imagens de contraste de fase em intervalo de tempo para observação cinética não destrutiva, microscopia confocal de varredura a laser para gerar reconstruções 3D completas com leituras de sonda matricial, e microscopia eletrônica de varredura suportada por membrana para análise ultraestrutural. Paralelamente, detalhamos um procedimento padronizado para a colheita de agregados de biofilme intactos e prepará-los para injeção intraperitoneal no modelo suscetível de hamster sírio dourado, permitindo a avaliação direta da virulência associada ao biofilme in vivo junto com controles planctônicos correspondentes.

Otimizado para a cepa patogênica Leptospira interrogans Manilae L495, cada módulo é facilmente transferível para outras espécies de Leptospira e bibliotecas mutantes para comparar a capacidade de formação de biofilmes. Juntos, esses módulos coordenados fornecem uma base sólida para a triagem de estratégias anti-biofilmes, investigação de determinantes genéticos e esclarecimento da contribuição dos biofilmes para a persistência e patogênese dos Leptospira .

Introduction

Biofilmes são comunidades microbianas estruturadas nas quais células estão embutidas em uma matriz de substância polimérica extracelular (EPS) autosecretada composta por polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos e^{lipídios 1}. Essa matriz proporciona estabilidade mecânica, media a adesão às superfícies e aumenta a sobrevivência microbiana ao conferir tolerância a estresses ambientais como dessecação, estresse oxidativo e^{antimicrobianos 2,3}. Em bactérias patogênicas, os biofilmes facilitam persistência, evasão imune e infecção^{crônica 4,5}.

Comparadas às células planctônicas, que são livres e metabolicamente mais homogêneas, as células associadas a biofilmes apresentam alteração na expressão gênica, taxas de crescimento e atividade^{metabólica 6}. Essas diferenças conferem maior tolerância a desafios ambientais, antibióticos e defesas do hospedeiro, ao mesmo tempo em que permitem comportamentos coordenados como a detecção de quórum, retenção de nutrientes e organização^{espacial 7,8}.

A formação de biofilmes tem sido amplamente caracterizada em organismos modelo como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Vibrio cholerae, que coletivamente moldaram nossa compreensão das bases genéticas, estruturais e fisiológicas do estilo de vida do biofilme. Estudos sobre Pseudomonas revelaram que exopolissacarídeos e a detecção de quórum trabalham juntos para moldar arquiteturas complexas de biofilmes^{tridimensionais 9,10}. Pesquisas sobre Staphylococcus enfatizaram os papéis das proteínas de superfície e do DNA extracelular no aumento da coesão do biofilme e da tolerância a^{antibióticos 11,12}. As investigações sobre espécies de Vibrio destacaram ainda mais a notável diversidade das morfologias de biofilmes e sua importância ecológica em ambientes aquáticos¹³. Coletivamente, esses sistemas forneceram uma estrutura conceitual e metodológica robusta para a pesquisa em biofilmes, reforçada pelos protocolos^{padronizados 14} e avaliações críticas das técnicas^{existentes 15,16}, que juntas destacam a necessidade de abordagens harmonizadas ao investigar a formação de biofilmes em bactérias menos estudadas, como Leptospira.

Membros do gênero de espiroquetas Leptospira, agentes causadores da leptospirose, foram há muito presumidos predominantemente planctônicos. Estudos recentes demonstraram experimentalmente a formação robusta de biofilmes em múltiplas^{espécies 17}. Enquanto alguns estudos sugerem formação de biofilmes em contextos^{ambientais 18} e¹⁹ associados ao hospedeiro, outros demonstraram experimentalmente a capacidade das leptospiras de formar biofilme nos túbulos renais de Rattus^{norvegicus 20} e no humor vítreo de cavalos²¹, além de detectar espécies leptospirais dentro de biofilmes^{ambientais 22,23}. Decifrar as condições e mecanismos que regem os biofilmes de Leptospira é, portanto, fundamental para entender a transmissão ambiental, a persistência de reservatórios e a patogênese da^{doença 24,25}.

Os ensaios existentes de biofilme de Leptospira são fragmentados, variando desde observações microscópicas^{qualitativas 17,26} até colorações colorimétricas ou violetas cristalinas^{finais 27,28}. Embora esses estudos tenham fornecido insights valiosos sobre a formação de biofilmes, frequentemente carecem tanto da resolução cinética necessária para monitorar a maturação e dispersão do biofilme em tempo real quanto do contexto ultraestrutural fornecido pela microscopia confocal ou eletrônica. O monitoramento contínuo e a análise estrutural 3D são considerados essenciais para capturar a natureza dinâmica da formação e dispersão do^{biofilme 14,15}. Essas limitações dificultam a comparabilidade entre estudos e limitam a avaliação sistemática de fatores ou intervenções que afetam a formação e dispersão de biofilmes, destacando a necessidade de um fluxo de trabalho padronizado e multi-leitura que capture tanto a dinâmica estrutural quanto a funcional de Leptospira biofilmes de maneira reprodutível e abrangente.

Para preencher essas lacunas, desenvolvemos um fluxo de trabalho integrado e modular que unifica seis leituras complementares extraídas da mesma série cultural. Primeiro, um ensaio de microtitulação CV de alto rendimento quantifica a biomassa acoplada em múltiplos pontos temporais. Segundo, um ensaio de fracionamento resolvido no tempo em placas de 96 poços divide populações totais, em fase líquida (não ligadas ou parcialmente desligadas) e em fase (biofilme) por OD₄₀₅ para acompanhar sua evolução durante a formação e dispersão. O termo fase líquida é usado aqui para abranger tanto células planctônicas quanto células desconectadas, reconhecendo o contínuo dinâmico entre fenótipos de vida livre e associados à^{superfície 29,30}. Terceiro, a imagem de contraste de fase em time-lapse fornece cinética não destrutiva de adesão, motilidade agregada e coalescência. Quarto, a microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) produz reconstruções 3D completas com leituras vivas/mortas e matricial, permitindo viabilidade dependente da profundidade e mapeamento matricial. Quinto, a microscopia eletrônica de varredura suportada por membrana ou coverslip (SEM) resolve a arquitetura extracelular e a polaridade basal-apical em alta resolução. Além disso, foi incorporado um módulo in vivo para avaliar a virulência usando injeção intraperitoneal de agregados de biofilme no modelo suscetível do hamster dourado sírio, um modelo sensível e bem estabelecido para leptospirose 31,32,33. Essa abordagem vincula fenótipos de biofilme ao potencial patogênico, fornecendo contexto funcional que complementa as análises in vitro.

Comparada às abordagens monomodales, essa plataforma oferece várias vantagens: (i) leituras quantitativas sincronizadas (CV e OD fracionado) e estruturais (CLSM/SEM); (ii) monitoramento cinético não destrutivo da adesão precoce, crescimento, maturação e dispersão; (iii) viabilidade 3D e caracterização matricial usando sondas direcionadas; (iv) visualização ultraestrutural da arquitetura da matriz extracelular; e (v) avaliação funcional direta da virulência associada a biofilmes versus planctônica em um modelo de hamster suscetível, cada uma possível com infraestrutura padrão BSL-2. Ao aproveitar formatos multipoço e substratos removíveis de vidro ou policarbonato, o fluxo de trabalho suporta a replicação de telas de variáveis ambientais, compostos antimicrobianos ou bibliotecas mutantes, mantendo esterilidade, throughput e validação cruzada entre módulos.

Laboratórios focados em ecologia, persistência, interações hospedeiro-patógeno ou descoberta de anti-biofilmes podem adotar módulos individuais ou todo o pipeline. Os recursos necessários são limitados a um leitor de placas, um microscópio invertido com controle ambiental para time-lapse, acesso a um microscópio confocal e instalação de SEM, e instalações padrão para animais para o modelo de hamster, permitindo ampla adoção e comparações reprodutíveis entre estudos.

Protocol

Declaração de ética:
Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal do Institut Pasteur da Nova Caledônia e conduzida de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal do Institut Pasteur de Paris, e pela Recomendação Europeia 2007/526/CE. Número de Registro do Experimento de Pesquisa Animal: IPNC-2018-ARE-001

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo culturas vivas de Leptospira devem ser realizados em um laboratório de biossegurança nível 2 (BSL-2), em conformidade com as diretrizes institucionais de biossegurança. Todas as manipulações de cultura devem ser realizadas em um gabinete de segurança biológica para garantir a segurança do operador e prevenir contaminação ambiental.

A cepa Leptospira interrogans serovar Manilae L495 usada neste estudo foi originalmente obtida da coleção do Institut Pasteur (Paris, França) e é mantida no Institut Pasteur da Nova Caledônia. Para preservar a virulência, a cepa é periodicamente reisolada de hamsters infectados. Em todos os experimentos in vitro , as culturas não foram mantidas além de seis subculturas após a recuperação do hospedeiro animal.

Todos os procedimentos com animais devem ser realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovados pelos Comitês de Cuidado e Uso dos Animais apropriados. Os experimentos devem aderir às regulamentações europeias sobre bem-estar animal (Diretiva da UE 2010/63) e às recomendações do Serviço de Saúde Pública, garantindo que o uso dos animais seja tanto justificado quanto eticamente regulamentado.

1. Preparação do inóculo bacteriano

1. Cultive células de Leptospira spp. a 30 °C em meios^{EMJH 34} sob condições aeróbias e sem agitação em tubos de vidro de fundo plano e tampa roscada até que a cultura atinja a fase logarítima média. Nessas condições, a cepa L495 de L. interrogans serovar Manilae, uma cepa de baixa passagem regularmente mantida in vivo por hamsters, normalmente atinge a densidade celular adequada em 3 a 5 dias. Certifique-se de que as culturas atinjam uma OD de 0,2-0,4 a 405 nm (2 a 5 x 10⁸ células/mL) antes da diluição em meios frescos EMJH e verifique a motilidade e a ausência de aglomeração por microscopia de campo escuro a ampliação de 20x.
   NOTA: EMJH possui absorção intrínseca. Apague o espectrofotômetro com EMJH estéril e subtraia esse valor de todas as leituras. O inóculo pode ser padronizado tanto medindo a densidade óptica quanto por contagem direta de células usando uma câmara de Petroff-Hausser. Uma diluição 1:100 de uma cultura verificada de logaritarithum médio normalmente resulta em OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ células/mL). Misture suavemente por inversão; Não faça vórtice.
2. Examine uma alíquota de 10 μL sob microscopia de campo escuro com ampliação 20x. Certifique-se de que ≥ 90% das células sejam altamente móveis e que não haja aglomerados visíveis. Dilua a cultura verificada de meio logaritarimo 1:100 em EMJH fresco para obter OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ células/mL). Misture suavemente por inversão; Não faça vórtice.
   NOTA: Um inóculo funcional suporta todos os ensaios posteriores detalhados neste protocolo (Figura 1). Prepare 36 mL para semear uma placa de 24 poços (1 mL/poço) ou 20 mL para semear uma placa de 96 poços (200 μL/poço). Ajuste os volumes para corresponder ao número de placas necessárias.

Figura 1. Fluxo de trabalho global para análise de biofilme de Leptospira . Culturas de Leptospira que crescem exponencialmente são primeiro avaliadas quanto ao crescimento e padronizadas pela densidade óptica. As culturas são então distribuídas em placas contendo vidro ou membrana, micropratos de microscopia ou placas de 96 poços. O fluxo de trabalho inclui sete módulos: (1) preparação do inoculo; (2) coloração com violeta cristalino para quantificação de biomassa; (3) imagem ultraestrutural por MEB; (4) monitoramento dinâmico de biofilme por microscopia de contraste de fase em time-lapse; (5) visualização 3D por CLSM com coloração viva/morta; (6) quantificação resolvida no tempo de frações ligadas e não ligadas durante a formação de biofilme via densidade óptica; e (7) investigação do papel funcional do biofilme durante a infecção em hamsters sírios. Essa abordagem integrada permite a análise multimodal do desenvolvimento, estrutura e patogenicidade do biofilme. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Quantificação baseada em violeta cristalino de biofilmes em coberturas ou membranas

1. Dentro de um capuz de biossegurança BSL2, utilize uma pinça estéril para colocar uma cobertura de vidro estéril de 12 mm ou uma membrana hidrofílica policarbonato estéril de 0,1 μm plana no fundo de cada poço, em uma placa estéril de 24 poços com tampa. Pré-molhe a membrana/vidro por 2 horas a 30 °C com 1 mL de EMJH estéril.
   NOTA: Embora não seja essencial, pré-imersão do substrato em EMJH melhora a molhada e melhora levemente a adesão bacteriana.
2. Remova a solução de imersão e adicione 1,5 mL da suspensão bacteriana diluída (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL) em cada poço. Certifique-se de que o revestimento ou membrana permaneça firmemente posicionado na parte inferior.
3. Incubar a placa a 30 °C em condições estáticas em atmosfera úmida, mantida colocando uma bandeja cheia de água dentro da incubadora para evitar a evaporação do meio de cultura. Para cepas de crescimento lento, recomenda-se uma incubação de 3 semanas para permitir a formação de um biofilme maduro e aderente.
4. No momento desejado, remova cuidadosamente o máximo possível de meio de cultivo de cada poço sem perturbar o biofilme. Enxágue suavemente cada poço com 1 mL de soro fisiológico estéril tamponado com fosfato (PBS) para remover células residuais não aderentes, mantendo o revestimento plano contra o fundo do poço para evitar o destacamento de células frágeis de biofilme. Nessas condições, o crescimento de biofilme ocorre predominantemente na superfície superior do cobertor, com crescimento mínimo na parte inferior, portanto, enxaguar sem levantar é suficiente para enriquecer células fixadas à superfície para análises a jusante.
   NOTA: Os biofilmes são extremamente frágeis neste estágio e podem ser facilmente aspirados por engano. A pipetagem deve ser realizada lenta e precisamente ao longo da parede do poço para evitar perturbar o biofilme.
5. Fixe as amostras de biofilme adicionando 1 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS a 37 °C por 30 minutos. Remova o fixador e enxágue cuidadosamente duas vezes com 1 mL de PBS.
   NOTA: Para fixação, uma solução de formaldeído a 4% foi preparada recém-preparada (estoque 16% sem metanol diluído 1:4 em PBS) e descartada após o uso, já que a polimerização em paraformaldeído reduz a atividade de reticulação.
6. Adicione 1 mL de solução de Violeta Cristalina (CV) a 0,1% (p/v) em cada poço e incube em temperatura ambiente por 15 minutos, garantindo que a membrana ou cobertura esteja totalmente coberta.
7. Descarte o corante e enxágue duas vezes com 1 mL de PBS.
   NOTA: Violeta cristalina e paraformaldeído (PFA) são tóxicos e podem irritar a pele e os olhos. Sempre use luvas e manuseie ambos os produtos químicos com cuidado, de preferência em uma exaustora exaustiva. Descarte resíduos em recipientes designados para corantes perigosos ou resíduos químicos conforme as diretrizes institucionais de segurança.
8. Incline a placa e drene o líquido residual. Seque os poços ao ar livre em temperatura ambiente até que o substrato pareça completamente seco (≥ 4 horas, preferencialmente durante a noite).
   NOTA: Neste estágio, estruturas em forma de pontos ou reticuladas podem ser visíveis na superfície do revestimento ou membrana (Figura 2A).
9. Adicione um tampão de elução de 500 μL (50% etanol, 50% ácido acético glacial (vol/vol)) em cada poço. Incube o prato por 15 minutos. Pipete para cima e para baixo para dissolver completamente o violeta cristalino ligado ao biofilme.
10. Transfira 200 μL de cada amostra para uma microplaca opticamente clara de 96 poços e meça a absorção a 570 nm. Subtraia um bloco apenas de substrato preparado processando um coverslip ou membrana não inoculada por meio de fixação, coloração CV, lavagens e elução para remover a ligação intrínseca/fundo. Registre a média ± o desvio padrão para pelo menos três réplicas técnicas. Dilua as amostras com buffer de elução se a absorção exceder a faixa linear do espectrofotômetro.

3. Visualização de biofilme usando microscopia eletrônica de varredura (SEM)

1. Dentro de um capuz de biossegurança BSL2, utilize uma pinça estéril para colocar uma cobertura de vidro estéril de 12 mm ou uma membrana hidrofílica policarbonato estéril de 0,1 μm plana no fundo de cada poço, em uma placa estéril de 24 poços com tampa. Pré-molhe a membrana/vidro por 2 horas a 30 °C com 1 mL de EMJH estéril.
2. Remova a solução de imersão e adicione 1,5 mL da suspensão bacteriana diluída (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL) em cada poço. Certifique-se de que o revestimento ou membrana permaneça firmemente posicionado na parte inferior.
3. Incube a placa a 30 °C sob condições estáticas em uma incubadora de controle de umidade para evitar a evaporação do meio de cultura. Para cepas de crescimento lento, recomenda-se uma incubação de 3 semanas para permitir a formação de um biofilme maduro e aderente
4. No momento desejado, remova cuidadosamente o máximo possível de meio de cultivo de cada poço sem perturbar o biofilme.
5. Em seguida, enxágue suavemente cada poço com 1 mL de PBS estéril para remover células residuais não aderentes, mantendo o revestimento plano contra o fundo do poço para evitar o destacamento de células frágeis de biofilme. Nessas condições, o crescimento de biofilme ocorre predominantemente na superfície superior do cobertor, com crescimento mínimo na parte inferior, portanto, enxaguar sem levantar é suficiente para enriquecer células fixadas à superfície para análises a jusante.
   NOTA: Os biofilmes são extremamente frágeis neste estágio e podem ser facilmente aspirados por engano. A pipetagem deve ser realizada lenta e precisamente ao longo da parede do poço para evitar perturbar o biofilme.
6. Adicione uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% e glutaraldeído a 1% em tampão cacodilato de sódio (0,2 M, pH 7,4) diretamente no poço para fixar o biofilme.
7. Incube por 30 minutos a 37 °C, depois remova o fixador e enxágue a capa ou membrana duas vezes com PBS. Essa abordagem preserva o biofilme fixado à superfície enquanto minimiza o descolamento, já que a maior parte do crescimento do biofilme ocorre na superfície superior do cobertor sob nossas condições.
   NOTA: Para fixação, uma solução de formaldeído a 4% e 1% de glutaraldeído foi preparada recentemente (estoque livre de metanol 16% diluído 1:4 em tampão de cacodilato de sódio) e descartada após o uso, já que a polimerização em paraformaldeído reduz a atividade de reticulação.
8. Imerga o substrato em tetróxido de ósmio (OsO₄) a 1% diluído em PBS por 1 hora para aumentar o contraste do SEM. Enxágue duas vezes com PBS.
9. Desidrate as amostras mergulhando-as sequencialmente em séries graduadas de etanol com concentração crescente: 25%, 50%, 70%, 90% e 100% (v/v), cada uma por 10 minutos.
10. Adicione 500 μL de hexametildisilazano e incube por 5 minutos, depois substitua por HMDS fresco e incube mais 5 minutos. Remova o excesso de HMDS e deixe a amostra secar completamente ao ar sob a exaustão de fumaça.
    NOTA: Glutaraldeído, PFA, cacodilato de sódio, tetróxido de ósmio e hexametildisilazano são tóxicos e devem ser manuseados sob uma exaustão química com equipamentos de proteção individual apropriados.
11. Monte as amostras secas em pedaços de SEM usando fita de carbono condutiva dupla face. Aplicar uma camada fina (~10 nm) de ouro ou platina nas amostras com sputter, fornecendo contraste eletrônico suficiente para a imagem de SEM. Isso permite visualização em alta resolução da arquitetura do biofilme, incluindo contatos célula-célula, morfologia, densidade e heterogeneidade da matriz extracelular, sem a necessidade de corantes ou colorações adicionais.
12. Carregue os stubs no SEM usando o suporte apropriado para amostras. Evacue a câmara durante a noite, sempre que possível, para melhorar a qualidade da imagem, depois adquira imagens secundárias de elétrons a 5 - 15 kV e ampliações adequadas para revelar a ultraestrutura do biofilme (Figura 2).

4. Imagem de contraste de fase em time-lapse de biofilme em crescimento

1. Pipete 500 μL do inoculo de trabalho (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL; ver Seção 1) em um prato Hi-Q4 de vidro estéril de 35 mm, equipado com tampa plana paralela para eliminar distorção do menisco. Evite criar bolhas e feche a travessa imediatamente.
   NOTA: O prato Hi-Q4 com fundo de vidro de 35 mm contém 4 áreas de cultura distintas que podem ser usadas para capturar simultaneamente 4 condições diferentes. Aloque um compartimento para meio EMJH estéril como controle negativo e os outros 3 para réplicas técnicas ou diferentes cepas/mutantes.
2. Coloque a antena no palco ambiental de um microscópio invertido equipado com óptica de contraste de fase, um acionamento de foco motorizado (Biostation IMQ) e um gabinete umidificado ajustado para 30 °C e 95% de umidade relativa. Essas condições ajudam a minimizar a evaporação durante exames de imagem prolongados (até 8 dias).
3. Inicie o aplicativo BioStation IMQ e, na interface principal, abra a janela de Novas Configurações de Time-lapse para acessar o painel de configuração. Antes de iniciar o experimento, verifique os parâmetros ambientais no Display de Status, garantindo que tanto o indicador da Câmara quanto o da temperatura da água mostrem Estável para evitar desvio do quadro durante a aquisição.
4. Na tela de Novas Configurações de Time-lapse, selecione a aba Vivo e configure os parâmetros de imagem no painel de Condição de Observação escolhendo Contraste de Fase (Ph) como filtro e ajustando a Ampliação para 20 X.
5. No modo Manual, ajuste a intensidade da luz e o tempo de exposição para otimizar o contraste evitando a saturação. Verifique isso usando o botão de Verificação de Saturação . Defina quatro pontos de aquisição correspondentes aos centros dos quatro compartimentos.
6. Posicione o palco sequencialmente sobre cada compartimento usando o Jog Dial ou clicando diretamente na Exibição de Imagens de Observação ao Vivo .
7. Refinar o foco com os Botões de Foco e registrar cada posição clicando no botão Time-lapse Experiment Point Register . Os pontos registrados aparecem como quadros azuis numerados no Display de Verificação do Ponto de Observação e são confirmados na aba de Pontos.
8. Programe o cronograma de aquisição abrindo a aba de Tempo e clicando em Novo para acessar a Caixa de Diálogo Timelapse , onde o Ciclo de Aquisição é definido para 30 minutos e o Tempo Total para 7 dias.
9. Após clicar em Aplicar, o software calcula automaticamente o número de rodadas de aquisição. Ative o Autofoco clicando com o botão direito na barra de título, selecionando Preferências e ativando o Modo AF para garantir o refoco em cada posição de cenário. Verifique a consistência das Configurações de Exposição, Ganho e Intensidade de Luz em todos os pontos, e salve toda a configuração usando o botão Salvar .
10. Inicie a aquisição clicando em Iniciar Time-lapse. O software muda automaticamente para as Imagens Time-lapse, permitindo monitoramento contínuo do progresso da aquisição e da estabilidade da câmara durante os 7 dias do experimento. Todas as imagens são automaticamente salvas no formato TIFF dentro da pasta do experimento criada pelo software.
11. Processe e quantifique a série de imagens importando as pilhas de imagens para o FIJI (Figura 3A, B, C).
12. Abra as pilhas de imagens correspondentes a cada posição via Importação > Sequência de Imagens > Arquivo, garantindo que os quadros sejam carregados em ordem cronológica.
13. Converta as pilhas alinhadas para escala de cinza de 8 bits usando o Tipo > Imagem > 8 bits para padronizar a intensidade dos pixels.
14. Aplique limiar usando a Imagem > Ajuste > Limiar para isolar as regiões de biofilme bacteriano. Aplique configurações de limiar consistentes em todos os quadros selecionando Aplicar, depois salve o resultado como uma máscara binária usando Process > Binary > Make Binary.
15. Realize a quantificação com Analisar > Analisar Partículas, registrando parâmetros como Área, Porcentagem de Área e Intensidade Média.
16. Exporte automaticamente os resultados de cada quadro para uma planilha via a janela de Resultados (Arquivo > Salvar Como > .csv) para análise cinética. Expresse todas as medições como a proporção da área de campo coberta pelo biofilme (cobertura superficial).

5. Visualização de biofilme usando microscopia a laser de varredura confocal (CLSM)

1. Inocular 1,5 mL do inóculo de trabalho (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL; ver Seção 1) em um prato estéril de fundo de vidro de 35 mm. Incube estaticamente em uma caixa umidificada contendo um reservatório de água em uma incubadora a 30 °C até que o estágio de desenvolvimento desejado seja atingido (até 21 dias).
2. No momento escolhido, aspire cuidadosamente o meio lentamente ao longo da parede de antenas sem perturbar o biofilme. Enxágue uma vez com 2 mL de PBS estéril para remover as células planctônicas, tomando extremo cuidado para não descolar ou perturbar o biofilme.
3. Prepare soluções de coloração que exijam incubação com biofilmes não fixados (vivos) (faça isso antes da fixação).
   1. Para coloração viva/morta, adicione 3 μL de coloração fluorescente verde de ácido nucleico SYTO9 (1,67 mM) e 3 μL iodeto de propidium (18,3 mM) a 10 mL de PBS para criar solução de coloração. Adicione 200 μL da solução de coloração diretamente sobre as bactérias formadoras de biofilme, depois incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro, e enxágue uma vez em PBS.
   2. O rastreador de células vivas também pode ser usado para colorir as células antes da fixação. Incube células vivas com um traçador CFDA/SE de 10 μM por 30 minutos. Alternativamente, pode ser usado marcar as membranas com FM4-64 a uma concentração de 5 μg/mL. Enxágue uma vez no PBS.
4. Fixe o biofilme adicionando 2 mL de uma solução de paraformaldeído a 4% em PBS e incube por 30 minutos a 37 °C. Remova o fixador e enxágue duas vezes com PBS.
5. Adicione uma gota de meio antidescolorante para cobrir o biofilme e evite bolhas.
6. Adquira Z-stacks em um microscópio confocal invertido equipado com um laser de luz branca sintonizável (WLL) e um objetivo de imersão em óleo HC PL APO CS2 63×/1.4 NA. Para CFDA/SE, ajuste a excitação para 488 nm e colete a emissão entre 500-550 nm, usando um orifício de 1 unidade de Airy (UA). Para FM4-64, ajuste a excitação para 561 nm e detecte emissão entre 630-700 nm, também com um orifício de 1 UA.
7. Adquira pilhas Z em intervalos de 0,5-1,0 μm ao longo de toda a espessura do biofilme. Ajuste a potência do laser e o ganho do detector para maximizar a faixa dinâmica, evitando a saturação (<1% de pixels saturados).
8. Use a média de linha (2-4×) para melhorar a relação sinal-ruído e manter todos os parâmetros de imagem (potência do laser, largura de banda do detector, tamanho do orifício, velocidade de varredura) constantes entre as amostras.
9. Salve pilhas de imagens como arquivos de 12 bits e exporte-as em formato .lif para análise quantitativa no FIJI (ImageJ).
   NOTA: Antes da imagem, certifique-se de que as configurações do microscópio (por exemplo, potência do laser, ganho do detector, tamanho do furo estenopeico) estejam padronizadas usando amostras controle tingidas com os mesmos corantes. Essa etapa de calibração é essencial para minimizar a variabilidade entre aquisições e permitir uma comparação confiável entre experimentos.
10. Processe e quantifique pilhas de imagens confocais usando FIJI equipado com o plugin COMSTAT (ou software equivalente de análise 3D⁾¹⁰. Meça biovolume, espessura média e máxima, cobertura superficial e razões vivas/mortas (ou outras métricas pré-definidas). Exporte vistas ortogonais representativas e projeções de intensidade máxima para fins ilustrativos (Figura 3D, E).

6. Quantificação por tempo resolvida de frações ligadas e não ligadas durante a formação de biofilmes em ensaios microtitulados de 96 poços

1. Inocular 200 μL do inoculo de trabalho (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL; ver Seção 1) nos poços de uma placa de 96 poços. Incube estaticamente a 30 °C até o momento desejado (dias 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 ou 21).
   NOTA: Efeitos de borda e evaporação são comuns ao usar placas de 96 poços, especialmente se a incubadora não tiver controle de umidade. Para minimizar esses efeitos, adicione 200 μL de água destilada estéril a todos os poços periféricos. Além disso, placas foram colocadas dentro de uma caixa umidificada contendo um reservatório de água, que é então posicionado dentro da incubadora para reduzir ainda mais a evaporação e manter a umidade constante entre os poços.
2. Em cada ponto temporal, prepare três tipos de amostras:
   1. Suspensão total - Homogeneize todo o conteúdo de um poço contendo o biofilme, pipeteando suavemente para cima e para baixo várias vezes, evitando a formação de bolhas. Essa fração representa a população bacteriana total, incluindo tanto leptospias não anexadas quanto aquelas dentro do biofilme semiaderente. Essa etapa de homogeneização ajuda a dispersar agregados celulares que podem interferir em medições subsequentes de absorvida.
   2. Fase líquida - De um segundo poço, remova cuidadosamente 180 μL do sobrenadante sem perturbar a camada de biofilme. Transfira para um poço vazio e adicione 20 μL de meio EMJH fresco. Pipete suavemente várias vezes para dispersar os agregados celulares. Essa fração representa as células não ligadas presentes na fase líquida, que podem incluir tanto leptospias suspensas livremente quanto agregados de biofilme desprendidos.
   3. Biofilme - No mesmo poço usado para a etapa 2.2, resuspenda o biofilme restante adicionando 180 μL de meio EMJH fresco e pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Essa fração corresponde a leptospiras dentro do biofilme.
3. Meça a absorvância de cada suspensão a 405 nm usando um espectrofotômetro, após garantir que cada poço foi completamente homogeneizado, e plote os valores para gerar um gráfico representativo (Figura 4A).

7. Investigação do papel funcional do biofilme durante a infecção do hospedeiro

1. Inocular 200 μL do inoculo de trabalho (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL; ver Seção 1) nos poços de uma placa de 96 poços. Incubar estaticamente a 30 °C até atingir o estágio de desenvolvimento desejado (até 21 dias).
2. Para determinar a concentração do inóculo, dedique poços específicos de "controle de biofilme" que serão usados apenas para monitoramento do crescimento e não para injeção animal. Uma vez que o biofilme esteja visível macroscopicamente, remova suavemente 180 μL de sobrenadante de um poço de controle sem perturbar o biofilme. Substitua por 180 μL de meio novo EMJH, ressuspenda cuidadosamente os agregados de biofilme sem gerar bolhas e meça o OD₄₀₅ para estimar a concentração bacteriana.
   NOTA: Em princípio, lavar os poços antes da quantificação pode ajudar a remover células não aderentes. No entanto, como os biofilmes de Leptospira apresentam adesão fraca em placas de 96 poços, a lavagem levaria à perda descontrolada de material biofilme. Por essa razão, a etapa de ressuspensão foi realizada sem lavagem prévia para garantir a reprodutibilidade entre poços e concentrações bacterianas consistentes.
   Poços de controle de biofilme normalmente contêm ~2 x 10⁸ leptospires, que foi escolhido como o inóculo padrão para experimentos de infecção de hamster. Essa concentração também define o número-alvo de leptospias planctônicas usadas como controles. Quando incluídos, os controles planctônicos são preparados subcultivando Leptospira recém-cultivada em meio EMJH sob condições de agitação a 30 °C por até 5 dias, correspondendo à fase de crescimento exponencial médio a tardio que gera densidade celular semelhante.
3. Para inoculação animal, use poços de biofilme separados (não os poços de controle). Remova cuidadosamente 180 μL de sobrenadante dos poços para eliminar a maioria das leptospiras em fase líquida.
4. Colete os agregados restantes de 20 μL contendo biofilme usando uma ponta de pipeta de 200 μL para evitar perturbar a estrutura.
   NOTA: O biofilme é frágil. Certifique-se de que os agregados estejam visíveis antes e depois da coleta. Prepare poços extras caso seja necessário repetir.
5. Transfira os agregados para uma seringa pré-preenchida com 300 μL de meio EMJH fresco. Deixe os agregados se assentarem pela gravidade.
6. Anexe uma agulha de 21 G e expelia suavemente o excesso de EMJH até atingir um volume final de 200 μL. Certifique-se de que não restem bolhas de ar e que os agregados de biofilme permaneçam visíveis.
   NOTA: Esperar os agregados se estabilizarem minimiza a perda durante o ajuste de volume. Antes do uso in vivo , verifique se os agregados permanecem intactos após a passagem por uma agulha de 21 G (Figura 4C, D).
7. Realize injeção intraperitoneal de 2 leptospias de 10⁸ em meio EMJH de 200 μL.
   NOTA: Use hamsters dourados sírios de 7-8 semanas (ambos os sexos), mantidos sob condições padrão de moradia. Para controles negativos, injete apenas 200 μL de meio EMJH (um animal por replicação).
8. Monitore os animais duas vezes ao dia por até 21 dias para sinais clínicos de leptospirose (pelo despenteado, prostração e resposta reduzida à estimulação). Eutanásia imediata por inalação de dióxido de carbono se houver sofrimento e registre o momento da eutanásia como o momento da morte.
9. No dia 21, eutanasie todos os animais sobreviventes.
   NOTA: Realize três réplicas biológicas independentes com culturas preparadas em datas diferentes. Cada réplica inclui dois animais por condição e um animal de controle negativo.

Results

Quando o inóculo é preparado corretamente, as culturas entram na fase média logarítmica em 3-5 dias e apresentam valores de OD₄₀₅ de ~ 0,2-0,4, com campos brilhantes e altamente móveis sob microscopia de campo escuro (≥ 90% das células móveis) e sem aglomerados visíveis. Preparações subótimas apresentam-se como bactérias lentas e motilidade heterogênea em todo o campo; tais culturas frequentemente produzem biofilmes fracos e devem ser descartadas. Na prática, confirmar motilidade e OD lado a lado imediatamente antes da semeadura minimiza as tentativas falhadas. Estabelecer essas portas de controle de qualidade no estágio do inoculo é o melhor preditor de sucesso em aplicações posteriores. Embora a metodologia tenha sido otimizada para L. interrogans serovar Manilae L495, os mesmos procedimentos também foram aplicados à cepa Leptospira biflexa Patoc para demonstrar aplicabilidade entre espécies. L. biflexa geralmente forma biofilmes menos coesos e mais finos em comparação com L. interrogans, mas a sequência de desenvolvimento característica e as características estruturais permanecem detectáveis com ajustes apropriados dos parâmetros. Incluir ambas as espécies ressalta a adaptabilidade do fluxo de trabalho tanto para Leptospira patogênicos quanto saprófitos.

Após 21 dias de incubação estática a 30 °C em uma câmara umidificada (ou o tempo apropriado para as espécies de Leptospira usadas), os biofilmes tornam-se visíveis a olho nu tanto em cortinas de vidro quanto em membranas de policarbonato hidrofílico. Crescimento bem-sucedido produz padrões característicos de CV após 2-3 semanas, como pegadas pontuais, ramificadas ou reticuladas fixadas à superfície (Figura 2A).

Em uma execução típica, L . interrogans do tipo selvagem Manilae L495 atinge ~ 50% de cobertura superficial até a terceira semana, enquanto mutantes com baixo biofilme se estabilizam perto de ~ 20% e fenótipos de biofilme alto se aproximam de ~ 70-80%, estabelecendo uma faixa dinâmica prática para a triagem. A extensão da formação de biofilmes também pode variar dependendo da espécie e da cepa de Leptospira ; por exemplo, a cepa L. biflexa Patoc desenvolve biofilmes visíveis mais rapidamente, com estudos anteriores considerando estruturas já 120 horas após a inoculação como biofilmes^{maduros 35}.

A coloração de violeta cristalino fornece um método confiável e reprodutível para quantificar biomassa de biofilmes. Em biofilmes bem desenvolvidos, a coloração resulta em coloração roxa escura localizada na área do coverslide ou membrana, indicando altos níveis de biomassa aderida (Figura 2A). Pistas visuais durante as etapas de coloração e solubilização também fornecem indicadores úteis do sucesso do protocolo. Por exemplo, distribuição desigual do CV ou manchas pálidas podem ser causadas por subsemeadura, evaporação ou lavagem agressiva que desprenda biofilmes iniciais.

Leituras de absorção a 570 nm refletem a quantidade de corante retida e, portanto, a densidade relativa do biofilme (Figura 2B). Em experimentos representativos, culturas de L. interrogans cultivadas sob condições ideais apresentam leituras consistentes e reprodutíveis de OD₅₇₀ entre réplicas, refletindo a formação estável de biofilmes. Em contraste, grandes variações entre réplicas são frequentemente observadas quando amostras passam por pipeteamento excessivo durante mudanças de meio, indicando má adesão ou descolamento parcial de biofilme. Tal variabilidade deve ser considerada um sinal de problemas técnicos, e as amostras afetadas devem ser excluídas ou o protocolo cuidadosamente revisado. Notavelmente, L. biflexa Patoc forma biofilmes mais extensos tanto em coberturas de vidro quanto em membranas de policarbonato sob condições semelhantes, o que se reflete em valores de absorção CV mais altos, demonstrando que o protocolo é adaptável e eficaz entre espécies de Leptospira .

A preparação bem-sucedida do MEV consegue revelar depósitos de matriz extracelular já no terceiro dia, seguidos por uma arquitetura marcadamente polarizada em biofilmes maduros: uma face basal áspera e canalizada (frequentemente com > canais de 5 μm) que ancora uma estrutura interna porosa, e uma face apical mais lisa onde as espiroquetas ficam entrelaçadas em uma matriz densa (Figura 2C, D, E, F). Campos de alta ampliação frequentemente capturam filamentos extracelulares ramificados e ocasionais protuberâncias semelhantes a cogumelos; características que correspondem à dinâmica de coalescência observada pelo time-lapse (Vídeo suplementar 1). Em preparações subótimas, matrizes colapsadas, carregamento e contornos indistintos das células podem ser observados, geralmente refletindo pós-fixação inadequada, revestimento condutor insuficiente ou secagem ruim. Quando a polaridade basal-apical e os canais pervasivos são evidentes, as leituras do MEV alinham-se de perto com as estimativas confocais de espessura e porosidade, confirmando a execução bem-sucedida tanto da preparação quanto da imagem.

Em séries efetivas de time-lapse, pontos isolados aparecem entre 24 e 72 horas e se agrupam progressivamente em agregados maiores que varrem a superfície antes que as limitações de espaço desacelerem seu movimento (Figura 3A, B, C). A segmentação quantitativa resulta em um aumento monótono na área total coberta, enquanto as contagens agregadas aumentam, atingem pico e depois diminuem à medida que colisões e fusões dominam entre ~12 e 216 horas. Essas cinéticas (área para cima, agregados para baixo) indicam acreção ativa em vez de simples sedimentação. Corridas fracassadas ou borderline carecem de pontos precoces, apresentam curvas de área planas ao longo do tempo ou sofrem desvio de foco ligado a temperatura/umidade instáveis. Manter um ambiente estabilizado de 30 °C com 95% de umidade e usar o autofoco em cada ponto de tempo normalmente restaura trajetórias claras adequadas para comparar mutantes ou tratamentos.

Os Z-stacks representativos de biofilmes maduros mostram arquitetura em forma de espuma, multicamadas, tipicamente superior a 50 μm de espessura, com a maioria das células colorindo vivas (SYTO 9-positivo) e ocasionais vazios centrais indicativos de rearranjos coletivos durante o crescimento (Figura 3D). Sondas matricial podem ser usadas para investigar a composição da matriz: a WGA destaca epítopos polissacarídeos, marcas BOBO-3 abundante DNA extracelular, e colorações seletivas para proteínas contribuem com pouco sinal externo ao sinal celular (Figura 3E). Resultados subótimos incluem empilhamentos finos ou descontínuos dominados por iodeto de propidium, fotobranqueamento forte ou configurações de ganho inconsistentes, cada uma das quais mina a comparabilidade quantitativa. Interpretar espessura, biovolume e razões viva/morto juntas (mantendo potência do laser, ganho do detector e orificio constante em todas as condições) confirma o status de maturação e apoia comparações diretas com ultraestrutura SEM e biomassa CV.

O processo de formação do biofilme de Leptospira normalmente segue fases distintas, embora os tempos e valores exatos possam variar dependendo da espécie ou cepa. Usando a cepa L. interrogans Manilae L495 como referência, a progressão esperada ao longo de 21 dias inclui uma fase inicial (dias 0-3) em que as bactérias permanecem majoritariamente plânctônicas com biofilme mínimo (Figura 4A). Isso é seguido por uma fase de crescimento exponencial (dias 3-7), durante a qual tanto as bactérias planctônicas quanto as associadas a biofilmes aumentam, atingindo cerca de 9 x 10⁸ células/mL, acompanhadas pela formação e expansão de agregados de biofilme. Entre os dias 7 e 12, as bactérias planctônicas diminuem significativamente, enquanto as células associadas a biofilmes atingem o pico, representando cerca de 80% da população. Finalmente, durante a fase de maturação (dias 12-21), o número de bactérias do biofilme diminui sem aumento das células planctônicas, mas o tamanho e a complexidade do biofilme continuam a crescer. Observar essa sequência de mudanças indica que o protocolo captura efetivamente o desenvolvimento dinâmico e a maturação dos biofilmes de Leptospira .

Quando realizado corretamente, o protocolo de infecção utiliza unóculos contendo ~2 x 10⁸ leptospias em 200 μL de EMJH, preparadas a partir de culturas planctônicas (5 dias) ou biofilmes bem definidas (21 dias). Embora esses dois tipos de cultura representem estados fisiológicos distintos, essa diferença é intencional, pois o experimento busca determinar se os biofilmes de Leptospira — caracterizados por atividade metabólica reduzida e diferenciação estrutural — mantêm a capacidade de iniciar infecção. Esse contraste é apoiado por estudos transcriptômicos que mostram grandes mudanças na expressão gênica entre o planctônico e o biofilme Leptospira ^35,36. Agregados de biofilme são cuidadosamente colhidos para preservar sua estrutura e permanecem intactos após a passagem por uma agulha de 21 G, conforme confirmado antes da injeção (Figura 4C, D). Após a injeção intraperitoneal, hamsters dourados sírios normalmente apresentam sinais clínicos de leptospirose em 3 a 5 dias (por exemplo, letargia, pelo despenteado, prostração). Controles negativos injetados apenas com meio EMJH não apresentam sinais de doença. A progressão e a gravidade dos sinais clínicos, assim como o tempo até a eutanásia, variam de acordo com o inóculo: bactérias planctônicas frequentemente induzem sintomas mais precoces e agudos, enquanto agregados derivados de biofilme podem causar uma infecção retardada, porém persistente (Figura 4B). Monitorar duas vezes ao dia por até 21 dias permite registrar o curso completo da doença.

Figura 2. Coloração de violeta cristalino, quantificação e imagem ultraestrutural de biofilmes de Leptospira. (A) Coloração de biofilmes cultivados em diferentes substratos com violeta cristalino (CV). A coloração CV permite a visualização da arquitetura do biofilme e dos padrões iniciais de fixação para diferentes espécies e substratos. i. L. interrogadores sobre filtro de policarbonato; ii. L. biflexa no filtro de policarbonato; iii. L. interrogadores em cobertura de vidro; iv. L. biflexa em cobertura de vidro. (B) Exemplo de formação quantitativa de biofilme avaliada pela absorvância CV (OD570 nm) ao longo do tempo para L. interrogans e L. biflexa. Essa leitura cinética captura tanto a adesão inicial quanto a dinâmica do acúmulo de biomassa, destacando diferenças no crescimento do biofilme entre espécies patogênicas e saprófitas. Esse número foi modificado em^{relação a 27}. (C-E) Microscopia eletrônica de varredura (SEM) dos biofilmes de L. interrogans: (c) biofilme de 3 dias mostrando formação inicial de microcolônias e deposição inicial da matriz extracelular; (d) biofilme de 14 dias exibindo arquitetura madura com organização matricial e tridimensional extensa; (e-f) Biofilme de 3 semanas ilustrando consolidação estrutural e maturação da matriz ao longo de cultivos prolongados. Essa combinação de coloração CV, medições quantitativas de OD e imagem SEM oferece uma visão abrangente do desenvolvimento do biofilme, desde a fixação precoce até a organização ultraestrutural madura, permitindo a comparação direta entre espécies e durações de cultura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Visualização da formação de biofilmes de Leptospira . Imagens de contraste de fase adquiridas com uma BioStation mostram o desenvolvimento do biofilme em (A) 48 horas, (B) 96 horas e (C) 144 horas. (D) reconstrução CLSM de um biofilme de Leptospira exibindo biovolume total com fatias ortogonais para visualização 3D. (E) Coloração confocal de um biofilme maduro com DAPI (verde) e WGA (vermelho), destacando células bacterianas e componentes da matriz extracelular. Esse número foi modificado em^{relação a 37}. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4. Quantificação Resolvida no Tempo de Frações Planctônicas e Biofilmes e avaliação funcional de biofilmes de Leptospira . (A) Cinética da formação de biofilme medida pela absorvância a 405 nm. Para cada ponto de tempo, leituras foram feitas do poço total, da fração de biofilme e do sobrenadante contendo leptospias planctônicas, permitindo distinção entre bactérias aderidas e nadadoras livres. (B) Exemplos de curvas de sobrevivência de hamsters injetados com agregados de biofilme, leptospiros planctônicos ou controle EMJH. Animais injetados com biofilme apresentam virulência reduzida, com alguns sobrevivendo 21 dias, enquanto leptospias planctônicas causam mortalidade rápida. (C-D) Validação preliminar da integridade do biofilme: agregados são visíveis na seringa antes da injeção (C) e permanecem intactos após a passagem por uma agulha de 21 G (D, setas brancas), confirmando que a estrutura do biofilme é preservada durante o manuseio. Esse número foi modificado em^{relação a 36}. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho modular e integrativo para estudar biofilmes de Leptospira, integrando biomassa quantitativa (violeta cristal)^9,27, dinâmica (contraste de fase time-lapse), composição tridimensional (microscopia confocal de varredura a laser com sondas direcionadas⁾³⁸, ultraestrutura (microscopia eletrônica de varredura) e avaliação funcional (infecção de hamster). Ao usar a mesma série de cultura entre módulos, os efeitos batch são minimizados e a validação cruzada dentro do experimento é habilitada, o que é especialmente importante para espiroquetas frágeis e de crescimento lento. Cada módulo complementa os outros: o CV quantifica "quanto", o time-lapse mostra "quão rápido", o CLSM revela "o que está dentro", o SEM resolve "como é construído" e os testes in vivo fornecem "prova de funcionamento". A inclusão de L. biflexa demonstra adaptabilidade entre espécies, destacando formação de biofilmes mais rápida e densa e enfatizando a flexibilidade^{metodológica 35}.

O sucesso de cada módulo depende da qualidade do inoculo e do estado fisiológico. Culturas planctônicas de diaritmo médio (3-5 dias), altamente móveis e livres de agregados, produzem adesão reprodutível e desenvolvimento de biofilmes. Apenas isolados de passagem baixa devem ser usados para garantir formação robusta de biofilmes e reprodutibilidade.

O ensaio CV ancora o fluxo de trabalho por meio de sua velocidade, escalabilidade e throughput ^9,27. Ele permite uma triagem rápida de mutantes, meios ou compostos antibiofilmes. No entanto, como os biofilmes de Leptospira são frágeis e heterogêneos, a manipulação suave e a validação da replicação são essenciais. O CV não consegue distinguir arquiteturas compactas de porosas nem detectar composição matricial — daí seu papel como portão de triagem para análises estruturais mais profundas.

A imagem em time-lapse preenche essa lacuna ao revelar a cinética do biofilme em tempo real. Ele captura a emergência, coalescência e imobilização de agregados móveis, expondo fenômenos transitórios que os ensaios finais não percebem. A estabilidade ambiental (temperatura, umidade, foco automático) é fundamental. Essas gravações mostraram que, mesmo quando a biomassa CV parece estável, a dinâmica pode divergir — indicando rearranjos estruturais ou perda de viabilidade em camadas mais profundas.

O CLSM fornece insights volumétricos e químicos sem artefatos de^{desidratação 39}. Coloração viva/morta revela gradientes de viabilidade celular dentro do biofilme, consistentes com relatos de difusão limitada de oxigênio e estratificação^{metabólica 6,40}. Lectinas e corantes de ácidos nucleicos expõem abundância de DNA extracelular e motivos específicos de glicano, permitindo quantificar e caracterizar os componentes da matriz^41,42. Os dados do CLSM frequentemente revelam lacunas internas, ecoando os rearranjos coletivos observados no^{time-lapse 38}. Ainda assim, as limitações incluem especificidade da sonda, fotobranqueamento e resolução axial limitada por difração; Portanto, as configurações do microscópio e o desempenho do corante devem ser padronizados e testados previamente para garantir resultados confiáveis e comparáveis entre os experimentos.

O SEM oferece resolução ultraestrutural^{complementar 43}. Nos estágios iniciais, resolve agregados nascentes; Na maturidade (≈ 15-21 dias), revela uma arquitetura polarizada: uma camada basal rugosa e canalizada para ancoragem e troca, e uma superfície mais lisa rica em matriz^{apical, 37}. Fixação cuidadosa, secagem do HMDS e correlação com dados confocais mitigam artefatos devido à desidratação ou colapso⁴⁴.

Juntos, esses quatro módulos possibilitam validação cruzada interna: quando CV, CLSM e SEM convergem, as conclusões são robustas; Quando divergem, as próprias discrepâncias são informativas — revelando, por exemplo, aumento da biomassa com viabilidade reduzida ou biomassa inalterada com composição matricial alterada.

Várias limitações intrínsecas permanecem. Os biofilmes de Leptospira são heterogêneos e delicados, tornando-os sensíveis ao manuseio e à desidratação. O CV integra biomassa total, mas não^{viabilidade 16}; O CLSM não pode exceder os limites^{ópticos 38}; O SEM corre riscos de artefatos de preparação. A mortalidade em camadas mais profundas é esperada devido aos gradientes de^{oxigênio 6}, mas esse viés é sistemático e comparável entre as condições. A maturação do biofilme atinge um platô por volta de 15-21 dias, associado a assinaturas transcricionais de limitação de^{nutrientes 36}. Os estágios posteriores permanecem pouco caracterizados.

Ensaios in vivo fornecem contexto funcional. A injeção de agregados testa intraperitonealmente se as células derivadas de biofilme diferem em virulência ou persistência das contrapartes planctônicas. Embora a inoculação intraperitoneal não seja uma via natural, ela oferece um modelo comparativo^{controlado 36}. A heterogeneidade agregada introduz alguma variância, mas o manuseio consistente e o tamanho do inoculo correspondente mitigam isso. Importante destacar que características de persistência de biofilme (por exemplo, tolerância ao estresse mediada por ECM) não necessariamente se traduzem em virulência aguda aprimorada, destacando o papel ecológico, e não patogênico, da formação^{do biofilme 24}.

O design modular permite uso escalável. Para triagem rápida, CV e time-lapse são suficientes. Para insight mecanicista, CLSM e SEM adicionam resolução composicional e arquitetônica. Os módulos podem integrar perturbações enzimáticas ou químicas (DNase, glicosidase), sondas alternativas para glicanos ou ácidos nucleicos, ou sistemas microfluídicos para testar respostas de fluxo. O mesmo inóculo pode alimentar análises transcriptômicas ou proteômicas, ligando diretamente o fenótipo do biofilme à regulação (por exemplo, sinalização c-di-GMP, resposta à fome). Esse arcabouço também acomoda triagem de mutantes, testes de perturbação ambiental e avaliação de compostos antibiofilmes ou antivirulência.

Esse fluxo de trabalho integrado transforma observações isoladas em uma compreensão multidimensional coerente dos biofilmes de Leptospira. Ao combinar throughput (CV), dinâmica (time-lapse), química e profundidade (CLSM) e ultraestrutura (SEM), a abordagem captura com fidelidade a natureza móvel, porosa e polarizada das comunidades Leptospira. Estendendo estudos anteriores 17,35,36, demonstra que experimentação coordenada e modular revela fenômenos invisíveis a estudos de método único — como o aumento da biomassa apesar da queda na viabilidade, ou cinética divergente entre espécies. Em última análise, essa abordagem apoia análises comparativas, reproduzíveis e funcionalmente relevantes entre espécies, mutantes e condições, fornecendo uma base para microbiologia mecanicista, resiliência ecológica e design de estratégias anti-biofilme.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 & micro; Membrana hidrofílica policarbonata estéril m	it4ip	1000M25/861N101/13
Cobertura de vidro estéril de 12 mm	SPL	330164
16% de paraformaldeído (PFA)	Termo Científica	28908
Agulha 21G	BD Medicina	304432
Microplaca de 24 poços	NUNC	143982
Prato de fundo de vidro de 35 mm	Ibidi	81218-200
Antena Hi-Q4 com fundo de vidro de 35 mm	Ibidi	81156
Microplaca de 96 poços	NEST	701001
Meio de montagem antifade	Biorad	29410
Revestimentador de carbono	Leica Microsystem	Em ACE600
Rastreador CFDA/SE	Biolenda	423801
Adesivo condutor de carbono	Ciência da Microscopia Eletrônica	77816
Violeta cristalino (CV)	Sigma	C3886
Microscópio de campo escuro	Leica Microsystem	11888846	Leica DM4000 B equipada com condensador fiel escuro (cat n° 11505142)
Etanol	VWR Chemicals	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
Ácido acético glacial	Supelco	1.00063
Solução de glutaraldeído	Sigma-Aldrich	G5882
Hexametildisilazano	Acros Organics	120581000
Incubadora	Memmert	IN30
Microscópio confocal invertido	Leica Microsystem	Leica DMI6000 TCS SP8 X	Microscópio confocal SP8
Microscópio invertido equipado com óptica de contraste de fase	Nikon	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Base Média EMJH	Becton Dickinson	BD  279410	Médio EMJH para Leptospira
Tetróxido de ósmio (OsO4)	Sigma	BCCG9181
Propídio iodeto	Biotium	40017
Microscópio eletrônico de varredura	JEOL	JSM-IT300
Buffer de cacodilato de sódio	Termo-Química Científica	15453149
Espectrofotômetro Varioskan Lux	Termo Científica	VLBL00GD0
Soro salino tamponado com fosfato estéril	Biosolve	0016232301BS
Seringa (1 mL)	Chirana	CH03002L
SYTO9 coloração fluorescente verde de ácido nucleico	Invitrogen	S34854