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Imagem de Superresolução de Célula Inteira via DNA-PAINT em um disco confocal giratório com reatribuição óptica de fótons

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DOI:

10.3791/69531

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6 de janeiro de 2026

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para realizar microscopia de localização profunda de molécula única (SMLM) em célula inteira usando um microscópio confocal de disco giratório com reatribuição óptica de fótons, permitindo assim a imagem DNA-PAINT sem a necessidade de óptica personalizada ou iluminação complexa.

Resumo

A microscopia de localização de molécula única (SMLM) permite imagens em nanoescala de estruturas celulares, mas é tipicamente restrita à imagem próxima ao coverslide devido às limitações da fluorescência por reflexão interna total (TIRF) e da iluminação altamente inclinada e em folhas ópticas (HILO). Aqui, é apresentado um protocolo que utiliza um microscópio confocal de disco giratório equipado com reatribuição óptica de fótons (SDC-OPR) para realizar SMLM em células inteiras. Esse método permite a imagem de molécula única de alta precisão em todo o volume celular usando acúmulo de pontos de DNA para imagem em topografia nanométrica (DNA-PAINT), sem a necessidade de óptica personalizada ou esquemas complexos de iluminação. O protocolo fornece um guia passo a passo para configurar um microscópio de disco giratório comercialmente disponível (por exemplo, CSU-W1 SoRA) para imagem SMLM, incluindo parâmetros de aquisição otimizados para imagem profunda. As etapas de preparação da amostra são delineadas para marcar alvos intracelulares com sondas conjugadas com DNA para realizar imagens DNA-PAINT, incluindo estratégias para imagem multicolorida de vários alvos. A aquisição de imagem é seguida pela localização e reconstrução de molécula única usando pacotes de software padrão. Considerações críticas para minimizar o fundo, otimizar a resolução lateral e garantir a qualidade da imagem em toda a profundidade celular também são discutidas. Esse protocolo acessível permite que pesquisadores realizem SMLM profundo e de célula inteira usando equipamentos confocais padrão, ampliando a gama de questões biológicas que podem ser abordadas por imagem de molécula única além das regiões próximas à membrana.

Introdução

A microscopia de localização de molécula única (SMLM)1 é uma família de técnicas de superresolução que alcançam resolução em escala nanométrica ao separar temporalmente a emissão de fluoróforos individuais e localizá-los com alta precisão. O sucesso do SMLM requer uma alta relação sinal-ruído (SNR) para detectar eventos de molécula única, o que tradicionalmente limitou seu uso a configurações ópticas que proporcionam excitação intensa e localizada. As configurações mais comuns são a microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)2 e a iluminação de folhas ópticas laminadas altamente inclinadas (HILO) 3. O TIRF reduz a fluorescência de fundo criando um campo evanescente que excita seletivamente os fluoróforos dentro de alguns nanômetros do cobertor, suprimindo assim a iluminação fora de foco. No entanto, essa restrição torna o TIRF inadequado para imagens de estruturas biológicas mais profundas, como organelos que se estendem para o domínio extracelular. A microscopia HILO proporciona maiores profundidades de penetração, permitindo a obtenção de imagens a várias centenas de nanômetros acima do substrato de vidro. Isso tem o custo de um campo de visão (FOV) reduzido e iluminação desigual com planos cada vez mais altos, limitando sua aplicabilidade para estruturas celulares maiores. Mais recentemente, técnicas de microscopia de folhas de luz (LSM), como a folha de luzem rede 5,6,7 e a microscopia de iluminação de plano único objetivo único (soSPIM)8, expandiram a SMLM para imagens volumétricas e em escala de tecido. Ao moldar o feixe de excitação em folhas de luz finas e estruturadas, o LSM alcança o corte óptico com redução de fundo e fototoxicidade. O SoSPIM captura planos focais ortogonais ao eixo de detecção em uma única exposição, permitindo imagens volumétricas rápidas com resolução quase isotrópica. A aplicação soSPIM demonstrou SMLM 3D em células inteiras e pequenos organelos (>20 μm de profundidade) com resolução isotrópica de até 40 nm, e com fundo desfocadomínimo 9. Apesar de suas forças, esses métodos normalmente exigem amostras transparentes, óptica especializada e alinhamento complexo, permanecendo sensíveis a aberrações ópticas e espalhamento em amostras mais espessas.

A microscopia confocal oferece uma alternativa ao rejeitar luz fora de foco por meio do uso de um orifício estenopeico à frente do detector, combinado com espelhos de varredurade feixe 10. Essa capacidade de seccionamento óptico permite imagens volumétricas profundas com alta resolução de reconhecimento (SNR). Em particular, a microscopia confocal de disco giratório (SDC) combina a velocidade e a detecção em campo amplo da imagem convencional com a capacidade de seccionamento dos sistemas de varredura pontual. Isso é alcançado no SDC convencional por meio da incorporação de um disco giratório com orifícios paralelos, frequentemente combinados com um arranjo de microlentes alinhado. As microlentes coletam uma parte substancial da fluorescência emitida e a focam pelos orifícios minúsculos, o que reduz o sinal de fundo. Essa configuração proporciona corte óptico rápido sem a necessidade de óptica especializada ou preparação adicional de montagem da amostra, tornando-a uma escolha robusta que pode ser facilmente implementada e otimizada para aquisição de imagem SMLMvolumetrica profunda 11.

Neste estudo, é empregada a unidade de scanner confocal de disco giratório CSU-W1, equipada com reatribuição óptica de fótons (SDC-OPR). Diferente do SDC padrão, o SDC-OPR introduz um segundo arranjo de microlentes que projeta os fótons emitidos em um padrão12 de orifícios complementares, para mitigar o espalhamento e recuperar fótons que, de outra forma, seriam descartados. Essa reatribuição de fótons efetivamente aguça a função de espalhamento pontual (PSF), aumentando a resolução lateral além da SDC convencional, enquanto ainda rejeita luz desfocada13. Especificamente, o array de microlentes SDC-OPR redireciona fótons fora do eixo para seus pontos de origem mais próximos, aumentando efetivamente o brilho de fluorescência detectado em comparação com a SDC padrão. Além disso, os benefícios de resolução do SDC-OPR podem ser amplificados por meio da deconvolução de imagem. Algoritmos iterativos de deconvolução refinam computacionalmente o PSF, reduzem o fundo e melhoram a relação sinal-fundo sem exigir alterações na configuração óptica. Essa abordagem combinada oferece uma vantagem significativa em termos de precisão de localização em relação ao SDC padrão para experimentos de localização de moléculaúnica 14.

Aqui, é apresentado um protocolo robusto e reproduzível para microscopia de localização de molécula única usando um microscópio confocal de disco giratório equipado com reatribuição óptica de fótons (SDC-OPR). Essa abordagem combina a precisão em nanoescala do DNA-PAINT com a velocidade, campo de visão e penetração em profundidade da imagem de disco giratório. DNA-PAINT, uma adaptação do acúmulo de pontos para imagem de topografia em escala nanométrica (PAINT)15, baseia-se na hibridização transitória de fias "imager" marcadas fluorescentemente com fitas complementares de "acoplamento" ancoradas a alvos moleculares. Esses eventos reversíveis de ligação geram sinais estocásticos de fluorescência que podem ser localizados com precisão, permitindo a reconstrução de alta resolução da ultraestrutura celular. DNA-PAINT permite o uso de fluoróforos altamente fotostáveis, fornece cinética de ligação ajustável para controle preciso das condições de imagem e mitiga o fotobranqueamento por meio do reabastecimento contínuo das fitas fluorescentesdo imager 16.

Para garantir reprodutibilidade e especificidade, a abordagem depende de conjugados personalizados de DNA-anticorpos que ligam as fitas de acoplamento a anticorpos secundários. Etapas detalhadas de preparação da amostra, incluindo conjugação anticorpo-DNA, são apresentadas para apoiar resultados experimentais robustos. O protocolo é validado em estruturas celulares bem caracterizadas, como complexos de poros nucleares (NPCs)17 e microtúbulos em amostras fixas, fornecendo um ponto de referência para estimar a precisão da reconstrução. Variações na resolução, quantificadas por precisão de localização como um proxy, são ainda avaliadas em função do FOV e da profundidade de imagem.

Além disso, a eficiência desse fluxo de trabalho para imagens multiplexadas é demonstrada usando o Exchange-PAINT18, uma estratégia que permite a visualização sequencial de múltiplos alvos com o mesmo corante e uma única fonte de laser baseada no DNA-PAINT. O fluxo de trabalho Exchange-PAINT é aplicado à imagem multicolorida de super-resolução de mitocôndrias, microtúbulos e NPCs dentro da mesma amostra.

Juntos, esse protocolo fornece orientações abrangentes e notas-chave de adaptabilidade sobre conjugação anticorpo-DNA, preparação da amostra, condições de imagem e análise de dados, permitindo que pesquisadores realizem imagens reprodutíveis de DNA-PAINT no SDC-OPR. Ao estender a imagem de alta resolução além das limitações de profundidade e campo de visão das abordagens baseadas em TIRF, esse método amplia a aplicabilidade do SMLM a uma ampla gama de contextos biológicos.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de tampões

  1. Preparação do tampão do citoesqueleto (CB):
    1. Prepare 10 mM de MES (pH 6,1) com 150 mM de NaCl, 5 mM de EGTA, 5 mM de D-glicose e 5 mMde MgCl 2 em 1x solução tampão de fosfato filtrada (PBS).
    2. Armazene a 4 °C e filtre antes do uso.
  2. Preparação do estoque do ácido protocatechuic (PCA) 40x:
    1. Dissolva 154 mg de PCA em 10 mL de água destilada e filtrada.
    2. Ajuste o pH para 9,0 com NaOH.
    3. Aliquota e armazene a -20°C por um máximo de 6 meses.
      NOTA: Se alguma alíquota aparecer marrom, descarte-a, pois isso indica oxidação.
  3. Preparação do estoque 100x de protocatechuto-3,4-dioxigenase (PCD):
    1. Prepare uma solução de glicerol a 50% com 50 mM de KCl, 1 mM de EDTA e 100 mM de tampão Tris.
    2. Dissolva 2,2 mg de PCD em 3,4 mL da solução de glicerol.
    3. Aliquot e armazene a -20 °C por um máximo de 6 meses.
  4. Preparação do estoque 100x Trolox:
    1. Dissolva 50 mg de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) em metanol de 215 μL até que a solução fique verde dentro de uma exaustão química, utilizando o equipamento de proteção individual (EPI) adequado.
    2. Adicione 1,6 mL de água destilada e filtrada. Deixe a solução ficar branca e começar a solidificar.
    3. Adicione 175 μL de 1M NaOH 1M. Deixe a solução voltar a ficar líquida.
    4. Em volumes de 10 μL, continue adicionando 1 M de NaOH até que a solução esteja totalmente clarificada (cerca de 40 μL).
    5. Aliquot e armazene a -20 °C por um máximo de 6 meses. A solução final parece amarelada.
      NOTA: A solução final 100x tem pH de 11, mas diluição a 1x resulta em pH de 7-8.
  5. Buffer C+
    1. Prepare 1 mM de EDTA, 500 mM de NaCl e 0,02% de solução Tween-20 em 1x PBS.
    2. Ajuste o pH para 7,4 com HCl e/ou NaOH conforme necessário.
    3. Suplemento opcional de Trolox: Adicione os volumes necessários de estoques de PCA (40x), PCD (100x) e Trolox (100x) para resultar em diluições 1x, deixe a solução equilibrada por 1h em temperatura ambiente (23 °C) antes de usar.
      NOTA: Prepare frescos semanalmente. Se estiver usando Trolox, use dentro de 4 horas após a mistura.
  6. Tampões de imunocoloração (paraformaldeído PFA, glicina e tríton):
    1. Para preparação de 4% de PFA a partir de uma ampola de 10 mL e 16% de PFA:
      1. Dentro de uma exaustão química, abra cuidadosamente a ampola.
      2. Decante 10 mL de PFA a 16% em um tubo centrífugo cônico de 50 mL.
      3. Realize uma diluição 1:4 em 1x PBS para obter 4% de PFA, adicionando cuidadosamente ~30 mL de PBS 1x filtrado ao PFA decantado de 16%, para que o volume final seja ~40 mL.
      4. Aliquota em tubos microcentrífugas de 1 mL e armazene a -20 °C até que seja necessário.
    2. Para 60 mM de glicina em preparação PBS:
      1. Pese 225 mg de glicina em um tubo centrífugo cônico de 50 mL.
      2. Adicione 50 mL de PBS 1x filtrado.
      3. Váctice até estar totalmente misturado e filtre.
      4. Armazene a 4 °C até ser necessário.
    3. Para 0,1% de preparação do Triton X-100:
      1. Primeiro, prepare um estoque de trabalho com 10% de Triton X-100 diluindo 1 mL de 100% de Triton X-100 em 9 mL de PBS 1x filtrado (volume final = 10 mL), pipete e misture lentamente para evitar excesso de bolhas. Armazene a 4 °C até ser necessário.
      2. Do estoque de trabalho de 10%, adicione 0,1 mL de Triton X-100 10% a 9,9 mL de PBS filtrado 1x para o estoque final de 0,1%, novamente misture lentamente. Armazene a 4 °C até ser necessário.

2. Conjugação anticorpo-DNA

  1. Concentre o anticorpo usando uma unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração de 100 kD:
    1. Lave a unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração de 100 kDa com 100 μL de PBS 1x filtrado por 30 min a 14.000 x g, 4 °C.
    2. Adicione 100 μL de anticorpo com 200 μL de PBS filtrado 1x à unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração de 100 kDa previamente lavada, centrifuge por 30 min a 14.000 x g, 4° C. Certifique-se de que a concentração de anticorpos seja maior que 1,5 mg/mL após a concentração com o filtro centrífugo de ultrafiltração. Com esse método, o filtro centrífugo de ultrafiltração geralmente concentra o anticorpo em ~3x.
    3. Inverta a unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração de 100 kDa em um tubo limpo, centrifuge por 6 minutos a 1000 x g, 4 °C. Este é o anticorpo concentrado no PBS.
    4. Meça o volume do anticorpo concentrado (1 ou 2 μL) para calcular a nova concentração e execute um espectro de absorção UV-Vis com um espectrofotômetro UV-Vis de microvolume. Defina o fundo para 1x PBS e salve os espectros.
  2. Reduzir a fita de acoplamento de DNA tiolado:
    1. Dissolva 7,7 mg de DTT pré-pesado em 100 μL de água filtrada e transfira para um tubo fresco.
    2. Adicione 100 μL de 3 mM de EDTA em 1x PBS ao tubo original de DTT, vórtice, e transfira para o mesmo tubo como passo 2.2.1, resultando em 200 μL de 250 mM DTT em 1,5 mM EDTA em 1x PBS.
    3. Dissolva a fita de acoplamento de DNA tiolado em PBS filtrado 1x para uma concentração final de 1 mM. Grave um espectro UV-Vis da solução da fita de acoplamento de DNA (diluído a 10 μM em 1x PBS) e salve-o usando o espectrofotômetro UV-Vis de microvolume.
    4. Misture 13 μL de DNA tiolado (1 mM) com 30 μL de DTT (250 mM), agite por 2 h em temperatura ambiente (23 °C).
      NOTA: Armazene quaisquer cadeias de acoplamento de DNA não utilizadas restantes em alíquotas de 13 μL a -20 °C para reações futuras.
  3. Conjugação de anticorpos com o reticulador:
    1. Dissolva o cruzador de éster de maleimida-PEG2-succinimidil em DMSO para 10 mg/mL (23,5 mM). Armazene alíquotas de 10 μL a -20 °C até que seja necessário.
    2. Misture o anticorpo concentrado do passo 2.1 com 20x molar de excesso do reticulador. Incube por 90 minutos, agitando, a 4 °C.
  4. Purificar a filtragem de anticorpos cruzados com uma coluna de dessalinização de spin de 7,0 KDa contendo resina de exclusão de tamanho (corte de peso molecular de 7 kA):
    1. Remova o fecho inferior da coluna de dessalinização de rotação de 7,0 kDa e afrouxe a tampa. Coloque-o em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação proteica. Centrifuge por 1 minuto a 1500 x g, 4 °C.
      NOTA: Marque a inclinação da resina após a primeira rodada. Para todos os usos subsequentes da coluna, coloque a inclinação voltada diretamente para fora sobre a centrífuga. Aplique amostras e lavagens no centro e evite contato com a cama de resina.
    2. Adicione 300 μL de PBS filtrado 1x ao filtro de dessalinização de spin de 7,0 kDa, afrouxe a tampa e centrifuge por 1 min a 1500 x g, 4 °C. Repita mais duas vezes.
      NOTA: Deixe a coluna de dessalinização de spin de 7,0 KDa com 300 μL de 1x PBS até que a reação anticorpo-crosslinker esteja pronta; Não deixe a coluna secar.
    3. Remova os últimos 300 μL da lavagem PBS centrifugando novamente por 1 minuto a 1500 x g, 4 °C.
    4. Aplique a solução de reticulação de anticorpos no centro da cama de resina, em gota em gota. Coloque a coluna de dessalinização de spin de 7,0 kDa em um tubo de microcentrífuga limpo, centrifuge por 2 minutos a 1500 x g, 4 °C. O produto de reticulação anticorpo agora está no tubo da microcentrífuga; Mantenha a 4 °C ou no gelo.
  5. Purifique a mistura DNA-DTT com colunas de spin dessalinizantes com Sephadex G-25 (resina de exclusão de tamanho para purificação de DNA):
    1. Faça vórtice nas colunas de spin de dessalgamento (purificação do DNA) para que a resina seja distribuída uniformemente. Remova o fecho inferior, afrouxe a tampa e coloque em um tubo limpo de microcentrífuga.
    2. Dessalinizando colunas de spin com centrífuga (purificação de DNA) a 735 x g por 1 minuto para remover o tampão de armazenamento.
    3. Coloque colunas de spin dessalinizantes (purificação de DNA) em um tubo novo de microcentrífuga e adicione lentamente a mistura de DNA/DTT ao centro da resina. Centrifuge a 735 x g por 2 minutos. O DNA purificado e reduzido agora estará no tubo da microcentrífuga.
  6. Combine DNA e produtos de reticulação de anticorpos:
    1. Adicione o DNA reduzido ao produto de reticulação de anticorpos com um excesso de 10 molares de DNA:anticorpo. Misture o DNA purificado com o produto de reticulação de anticorpos imediatamente após a purificação. Isso impede que o DNA se reaglutine.
    2. Incube durante a noite, tremendo, a 4 °C.
      NOTA: Misture o DNA e o anticorpo no final da tarde e purifique-os imediatamente na manhã seguinte. A incubação prolongada de DNA e anticorpos pode resultar em altas proporções DNA:anticorpos.
  7. Remova o excesso de DNA com uma unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração de 100 kDa na manhã seguinte:
    1. Lave a unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração de 100 kDa com 300 μL de PBS filtrado 1x por 30 min a 14.000 x g, 4 °C.
    2. Adicione a mistura de DNA e anticorpos com 300 μL de PBS filtrado 1x à unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração de 100 kDa e centrifuge por 30 min a 14.000 x g, 4 °C.
    3. Inverta a unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração em um tubo limpo, centrifuge por 6 minutos a 1000 x g, 4 °C. Este é o produto concentrado no PBS.
    4. Dilua o produto até 100 μL em PBS 1x filtrado.
    5. Grave um espectro UV-Vis do produto (1 ou 2 μL) usando o espectrofotômetro UV-Vis de microvolume, com um fundo de 1x PBS, e salve os espectros.
    6. Meça a concentração final e a razão DNA:anticorpos a partir dos espectros. Observe uma mudança no pico de absorção do anticorpo de 280 nm para 260 nm, devido à absorção extra do DNA. Use o passo 2.8 para determinar a concentração e a razão DNA:anticorpos.
    7. Armazene o produto nas condições originais de armazenamento do anticorpo utilizado. Se estiver congelando, evite ciclos de congelamento e descongelamento.
  8. Calcule a razão DNA:anticorpos a partir dos espectros UV-Vis:
    1. A partir dos espectros do DNA puro (10 μM em 1x PBS), meça os valores de absorção em 260 nm (Equação 1) e 280 nm (Equação 2). Divida-os pela concentração de DNA (10 μM) para encontrar os coeficientes de absorção molar do DNA (Equação 3 e Equação 4).
    2. Repita para o anticorpo encontrar Equação 5 e Equação 6, lembrando de dividir pela concentração de anticorpo usado para os espectros.
    3. A partir dos espectros do produto, a absorção em 260 nm e 280 nm depende tanto da absorção do DNA quanto do anticorpo:
      Equação 7
      Equação 8
      Onde cDNA e cAb são as concentrações de DNA e anticorpo, respectivamente, dentro do produto final. Resolva essas equações simultaneamente para encontrar a concentração molar tanto do DNA quanto do anticorpo dentro do produto. Calcule a razão DNA:anticorpo usando essas concentrações.
      NOTA: A concentração do anticorpo para os primeiros espectros pode ser calculada medindo o volume de anticorpo remanescente após a filtração com a unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração de 100 kDa e comparando isso com o volume original (com concentração conhecida) do anticorpo utilizado.

3. Cultura celular

  1. Células HeLa Kyoto mEGFP-Nup107.
    1. Prepare um estoque de meio de cultura celular, o Meio Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), e armazene a 4 °C. Pré-aqueça o meio 30 minutos antes do uso em um banho-maria a 37 °C. Dependendo das condições de trabalho, recomenda-se aliquotar e filtrar a quantidade necessária para evitar contaminação.
    2. Células semente em 2 x 105 células/mL em 7 mL de meio DMEM suplementado pré-aquecido em frascos T25. Coloque os frascos celulares em uma incubadora adequada em ambiente de 37 °C e 5% de CO2 .
    3. Garanta a passagem a cada 48-72 horas para evitar superlotação.
      1. Pegue o frasco T25 contendo a cultura confluente e aspire o meio do frasco.
      2. Pipett 1 mL de Tripsina EDTA (TE), garantindo cobertura total ao inclinar suavemente o frasco. Incube a 37 °C por 7 minutos para permitir o descolamento celular do frasco.
      3. Adicione 2 mL de mídia DMEM suplementada e triture.
      4. Transfira a suspensão da célula para um tubo centrífugo cônico de 15 mL com mais 7 mL de meio DMEM suplementado.
      5. Centrifuge a 400 x g por 5 minutos. Verifique cuidadosamente a formação de pellets na parte inferior do tubo sem perturbá-lo.
      6. Aspire o meio e resuspenda a célula em meio DMEM suplementado.
      7. Sementes 2 x 105 células/mL em um novo frasco T25 contendo 7 mL de meio pré-aquecido. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
        NOTA: Se não tiver certeza da densidade celular, pode-se usar um hemocitômetro para determinar a contagem celular. Recomenda-se começar com uma resuspensão de pellets de 1 mL antes da contagem.
  2. Células U2OS CRISPR mEGFP-Nup96
    1. Prepare um PBS de 10% e um P/S de 1% complementados com a mídia 5A da McCoy, conforme o passo 3.1.1.
    2. Células semente em 2 x 105 células/mL em 7 mL de meio McCoy's 5A suplementado em frascos T25. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
    3. Passagem a cada 48 horas para manter o crescimento da cultura abaixo de 80% da confluência:
      1. Aspire o meio do frasco e lave suavemente a cultura aderente com 2 mL de PBS filtrado pré-aquecido (37 °C).
      2. Aspire PBS e adicione 2 mL de Accutase, inclinando lentamente o frasco para garantir cobertura total, depois incube a 37 °C por 7 minutos.
      3. Adicione 2 mL de mídia McCoy's 5A suplementada e triture.
      4. Adicione 7 mL de meio à suspensão da célula e transfira-a para um tubo centrífugo cônico de 15 mL ou 50 mL para centrifugação. Centrifuge a 400 x g por 5 minutos e verifique a formação de pellets no fundo do tubo.
      5. Resuspenda o pellet celular em meio 5A de McCoy suplementado.
      6. Semeie a 2 x 105 células/mL em um novo frasco T25 com 7 mL de meio pré-aquecido. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
        NOTA: Aqueça todas as soluções adicionadas às células a 37 °C em um banho de água ou de estalas. Para Accutase, aqueça apenas 2 mL de alíquotas por no máximo 5 minutos para evitar degradação.

4. Imunocoloração de Nup96, mitocôndrias e microtúbulos

  1. Preparando células U2OS mEGFP-Nup96
    1. Seguindo os passos descritos no passo 3.2, aspire o meio do frasco T25 e lave suavemente as células aderidas com 2 mL de PBS filtrado 1x.
    2. Aspire PBS e adicione 2 mL de Accutase, incline lentamente o frasco para cima e para baixo, e incube a 37 °C por 7 minutos para promover o descolamento celular.
    3. Adicione 2 mL de mídia McCoy's 5A suplementada e triture.
    4. Suspensão de célula superior com 7 mL de meio McCoy's 5A suplementado e transfira para um tubo centrífugo cônico de 15 mL ou 50 mL antes de centrifugar a 400 x g por 5 minutos. Novamente, verifique a formação de pellets no fundo do tubo.
    5. Resuspenda o pellet celular em meio 5A de McCoy suplementado.
    6. As células semente em 1 x 10células de 5 células/mL em microslides de 8 poços e incubam na incubadora celular (37 °C, 5% CO2) durante a noite.
      NOTA: As células das sementes 24 horas antes dos procedimentos de fixação e imunocoloração, para permitir a aderência.
  2. Imunocoloração de células U2OS mEGFP-Nup96 para imagem Nup96
    1. Após incubação durante a noite, substitua o meio McCoy's 5A nos microslides de 8 poços por PBS 1x filtrado. Em rápida sucessão, aspire o PBS e adicione a solução de fixação de PFA pré-aquecida (37 °C) a 4% em uma exaustão química.
    2. Deixe as células fixarem por 30 minutos em temperatura ambiente (23 °C), preferencialmente dentro da exaustão química, antes que o PFA seja lavado e os resíduos descartados. Agora todas as etapas podem ser realizadas em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.
    3. Remova a solução de fixação de 4% de PFA e lave a lâmina 3x 3 vezes 3 minutos com 1x PBS.
      ATENÇÃO: Use PFA em uma exaustão química enquanto estiver usando EPI apropriado.
    4. Após a fixação, permeabilize a membrana celular adicionando 0,1% de Triton X-100 em 1x solução PBS. Deixe agir por 5 minutos, depois lave 3 x 3 minutos com 60 mM de glicina em 1x PBS, para apagar a autofluorescência do PFA residual.
      NOTA: A solução de permeabilização Triton é extremamente sensível ao tempo e pode alterar a integridade da estrutura celular se for deixada repousar por muito tempo.
    5. Adicione 5% de BSA em 1x PBS por 1 hora no escuro, para bloquear as células antes da imunocoloração.
    6. Prepare 20 nM do nanocorpo anti-GFP conjugado com DNA em solução bloqueante (5% de BSA em 1x PBS) para evitar bloqueio de ligação inespecífica. Incube a lâmina com a mistura de nanocorpos por 1 h em temperatura ambiente (23 °C), depois lave as fitas de DNA não ligadas por 3 x 3 minutos com PBS filtrado 1x.
      NOTA: Ponto de pausa: Após fixação, bloqueio e adição de anticorpos, as amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite. Esse ponto de pausa é incluído principalmente devido ao tempo necessário para a preparação da amostra, e não por ser uma necessidade estrita do protocolo. A imagem pode ser realizada imediatamente após essas etapas, se preferível.
  3. Imunocoloração de células U2OS mEGFP-Nup96 para imagem de mitocôndrias e microtúbulos
    1. Após a incubação durante a noite, substitua simultaneamente o meio DMEM nos microslides de 8 poços por 200 μL de glutaraldeído 0,3% e 0,25% de Triton X-100 no tampão do citoesqueleto (CB) e deixe por 2 minutos para pré-fixação.
    2. Substituir a solução de pré-fixação por tampão do citoesqueleto (CB) suplementado com glutaraldeído a 2%. Deixe agir por 10 minutos para fixar as células, depois lave a lâmina 3 x 3 minutos com 60 mM de glicina em PBS, como no passo 4.2.4.
      ATENÇÃO: Use glutaraldeído em uma exaustão química enquanto estiver usando EPI adequado.
    3. Adicione DNA de espermatozoide de salmão tosquiado em 3% de BSA em 1x PBS por 1 hora no escuro, para bloquear as células antes da imunocoloração.
    4. Adicione 5 μg/mL de antitubulina conjugada com DNA (conjugada como descrito acima), para imagem de microtúbulos, e/ou 1:200 de anticorpo TOM20, para imagem de mitocôndrias, em 2% de BSA por 2 horas em temperatura ambiente (23 °C). Lave 3 x 3 minutos com 1x PBS.
    5. Adicione 25 nM de IgG anti-Coelho conjugado com DNA e incube por 1 hora em temperatura ambiente (23 °C). Lave 3 x 3 minutos com 1x PBS.
      NOTA: Ponto de pausa: Após fixação, bloqueio e adição de anticorpos, as amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite. Esse ponto de pausa é incluído principalmente devido ao tempo necessário para a preparação da amostra, e não por ser uma necessidade estrita do protocolo. A imagem pode ser realizada imediatamente após essas etapas, se preferível.
  4. Preparando células HeLa Kyoto mEGFP-Nup107
    1. Aspire o meio do frasco T25 das células HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 e lave suavemente o frasco com 2 mL de PBS filtrado 1x.
    2. Aspire PBS e adicione 2 mL de Tripsina EDTA (TE) e incline lentamente o frasco para cima e para baixo, incubando a 37 °C por 7 minutos.
    3. Adicione 2 mL de mídia DMEM suplementada e triture.
    4. Adicione a solução de célula a um tubo centrífugo cônico de 15 mL com mais 7 mL de meio DMEM suplementado e centrifuge a 400 x g por 5 minutos. Verifique a formação de pellets no fundo do tubo.
    5. Resuspenda o pellet celular em meio DMEM suplementado.
    6. Células de semente em 1 x 105 células/mL em microslides de 8 poços.
      NOTA: Células de semente 24 horas antes da imagem.
  5. Imunocoloração de HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 para microtúbulos
    1. Após a incubação durante a noite, substitua simultaneamente o meio DMEM nos microslides de 8 poços por 200 μL de glutaraldeído 0,3% e 0,25% de Triton X-100 no tampão do citoesqueleto (CB) e deixe por 2 minutos para pré-fixação.
    2. Substitua a solução de pré-fixação por glutaraldeído a 2% em CB e deixe por 10 minutos para fixação celular. Lave 3 x 3 min com 60 mM de glicina em 1x PBS.
      ATENÇÃO: Use glutaraldeído em um exaustor químico enquanto estiver usando EPI adequado.
    3. Adicione 5% de BSA em 1x PBS por 1 hora no escuro, para bloquear as células antes da imunocoloração.
    4. Adicione 5 μg/mL de antitubulina conjugada com DNA (conjugada como descrito acima), para imagem de microtúbulos em 5% de BSA em 1x PBS por 2 horas em temperatura ambiente (23 °C). Lave 3 x 3 minutos com 1x PBS.
      NOTA: Ponto de pausa: Após fixação, bloqueio e adição de anticorpos, as amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite. Esse ponto de pausa é incluído principalmente devido ao tempo necessário para a preparação da amostra, e não por ser uma necessidade estrita do protocolo. A imagem pode ser realizada imediatamente após essas etapas, se preferível.
    5. NOTA: Ao trabalhar com anticorpos ou linhas celulares alternativas, ajuste os fatores de diluição para o anticorpo acoplado ao DNA ou nanocorpo conforme as recomendações do fabricante.
  6. Preparação de imagem
    NOTA: Esta etapa é comum a todos os protocolos de imunocoloração.
    1. Adicione nanopartículas de ouro de 90 nm diluídas 1:2 em água desionizada diretamente em cada poço, usando o volume total do poço. Incube por 5 minutos para possibilitar a correção futura de deriva durante a imagem. Lave poços 3 vezes com 1x PBS.
    2. Para a imagem Nup96, adicione a cadeia desejada do imager a 1 nM em buffer C+ complementado com 1x Trolox, 1x PCA e 1x PCD.
    3. Para Exchange-PAINT de mitocôndrias e/ou microtúbulos, adicione a primeira fita desejada do imager em 1 nM apenas no buffer C+. Após a primeira rodada de imagem, lave a amostra cuidadosamente, mas com cuidado, após a primeira rodada para remover todas as fibras residuais do imageador sem mover a amostra. Normalmente, com 5 lavagens e 30 segundos de espera entre elas, o tempo de espera é suficiente. Depois, adicione a segunda cadeia do imager a 1 nM no buffer C+ apenas para a segunda rodada de imagem.

5. Configuração e parâmetros de imagem: Microscopia de localização de molécula única

NOTA: As imagens mostradas neste protocolo foram adquiridas na instalação de microscopia de superresolução LMCB no University College London, Reino Unido, utilizando um microscópio confocal de disco giratório comercialmente disponível, equipado com uma câmera sCMOS e operado via software NIS-Elements.

  1. Use um sistema confocal de disco giratório com excitação multifocal e uma câmera sCMOS.
  2. Ligue o sistema 30 minutos antes da imagem: ligue o microscópio, a câmera e os lasers, depois ligue o computador. Espere o software NIS-Elements carregar completamente.
  3. Selecione o modo de imagem apropriado em NIS-Elements: disco giratório confocal padrão ou SDC-OPR SoRA super-resolução, antes de definir parâmetros de aquisição.
  4. Escolha o objetivo de imersão em óleo Apo NA 1.49 de 60× para imagens SDC ou SDC-OPR, para maximizar a detecção de eventos de molécula única e melhorar o pós-processamento.
  5. Selecione a ampliação apropriada (1×, 2,8× ou 4×) com base no objetivo, configurações da câmera e a amostra a ser estudada. Ajuste o binning da câmera de acordo: 1× binning para 1× ampliação, 2× binning para 2,8× e 4× binning para 4×. Para essa configuração, isso corresponde a tamanhos efetivos de pixels de 108 nm para 1× (sem binning) ou 4× (binning 4×), e 78 nm para binning de 2,8× (2× binning). O binning é necessário para obter tamanhos de pixels adequados para SMLM, aproximadamente igualando o desvio padrão PSF (tipicamente 100-150 nm)19,20.
    NOTA: Ampliações maiores (2,8× ou 4×) aumentam a densidade de potência do laser, melhorando a uniformidade da iluminação. Isso reduz o campo de visão, então o binning deve ser ajustado proporcionalmente (ou seja, binning de 2× para ampliação de 2,8×; 4× binning para ampliação de 4×) para manter o tamanho do pixel.
  6. Defina o tempo de exposição para aquisição de DNA-PAINT e sincronize com a velocidade de rotação do disco giratório (ajustável a partir do pad CSU-W1). Certifique-se de que a velocidade de rotação seja múltipla do tempo de exposição, ou pressione o botão Sync para corresponder automaticamente ao RPM compatível mais próximo. Verifique a tela para artefatos de striping, pois isso indica configurações não sincronizadas. Para os experimentos apresentados aqui, foi utilizado um tempo de exposição de 300 ms.
    NOTA: A velocidade de rotação dos discos SoRa aprimorados por microlentes SDC e a unidade SDC impacta o perfil de excitação do feixe, afetando a distribuição média da densidade de potência na área iluminada. Por essa razão, podem ser necessários tempos de exposição mais altos do que para configurações TIRF.
  7. Configure o comprimento de onda do laser, a potência e a roda de filtros (os elementos NIS sugerirão um filtro apropriado). O comprimento de onda do laser será determinado pelo espectro do corante do imager.
    NOTA: Neste trabalho, foi usado Cy3B, que é excitado de forma ideal com um laser de 561 nm. O Cy3B oferece a melhor relação sinal-fundo para DNA-PAINT, tornando-se a escolha preferida para essa aplicação.
  8. Ajuste a potência do laser via Laser pad (0%-100%). Para imagens DNA-PAINT, ajuste o laser para potência máxima (100%). Para este sistema, isso corresponde a 1,75 mW (≈ 65 W/cm 2) medido após o objetivo para a ampliação de 4×, 3 mW (≈ 50 W/cm 2) para 2× e 5 mW (≈ 15 W/cm 2) para 1×.
    1. Para registrar a potência após o objetivo, use um medidor de potência a laser calibrado e coloque o sensor no palco do microscópio o mais próximo possível de onde o plano da amostra deve estar. Tome cuidado para evitar contato com a lente objetiva. Registre a energia de cada configuração utilizada.
  9. Aplique uma gota de óleo de imersão no óleo limpo de 60× Apo NA 1.49.
  10. Fixe a amostra preparada (dos passos 4.2-4.5) no palco usando um adaptador de palco. Isso é importante para minimizar o desvio durante a aquisição da imagem e para evitar movimentos durante trocas de buffer, especialmente em experimentos multicoloridos.
  11. Mude para o modo campo claro dentro do método de imagem selecionado e foque no plano de vidro usando nanopartículas como referência. Ative o Sistema de Foco Perfeito (PFS). O PFS ou um sistema similar para manter o foco durante todo o tempo de aquisição é crucial porque a deriva na direção axial não pode ser corrigida por pós-processamento.
    NOTA: A Nikon PFS mantém a amostra em foco nítido monitorando e ajustando continuamente a distância entre um plano de referência fixo e o plano focal da amostra usando uma lente deslocada e um detector de linha CCD. Ao operar independentemente da aquisição de imagem, o sistema corrige o desvio de foco em tempo real (~milissegundos).
  12. Com o PFS ativo, selecione o plano de imagem de interesse. Para células U2OS mEGFP-Nup96 ou células HeLa Kyoto mEGFP-Nup107, use o sinal 488 GFP de NPCs rotulados com GFP para identificar a célula mais plana e determinar o plano focal ideal. Use baixa potência do laser (~10% da potência máxima do laser) durante essa etapa para evitar o fotobranqueamento.
  13. Defina o nome e o caminho de salvamento do experimento. Marque a caixa Tempo para definir o intervalo, duração e número de loops. Para aquisição contínua, defina o intervalo para Sem Atraso e insira apenas o número de loops, que corresponde ao número total de quadros.
    NOTA: Certifique-se de que a caixa PFS na parte inferior está selecionada e depois pressione Executar. O software fornecerá automaticamente uma duração estimada do experimento e salvará os dados após a conclusão. Para parar o experimento antes que ele termine, pressione Terminar para salvar o progresso atual, ou Abortar para encerrar o experimento sem salvar.
  14. Para a primeira proteína, adquira entre 17.000 e 20.000 quadros com um tempo de integração de 300 ms.
    NOTA: A concentração da cadeia do imager precisa ser otimizada nesta etapa para garantir que sinais de molécula única não se sobreponham, ao mesmo tempo em que forneça localizações suficientes para a reconstrução. Esse processo é semelhante à aquisição típica de SMLM, onde a concentração do imager é ajustada para alcançar um número suficiente de eventos para reconstrução, minimizando a sobreposição. A concentração ideal depende da estrutura que está sendo visualizada. Por exemplo, estruturas altamente marcadas, como microtúbulos, normalmente exigem concentrações menores no imager (menos de 1 nM).
  15. Remova suavemente o tampão de imagem para a próxima proteína usando uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar a amostra. Ao monitorar a amostra pela câmera do microscópio, adicione cuidadosamente 200 μL de tampão C+ sem o imager para lavar o primeiro corante.
  16. Repita essa etapa até que nenhum sinal de fluorescência da primeira solução do DNA imager seja detectável (tipicamente 5 lavagens).
  17. Adicione uma segunda solução de imager e verifique se eventos de molécula única são detectados novamente.
  18. Adquira 17.000-20.000 quadros com tempo de integração de 300 ms para a segunda proteína.
  19. Repita os passos 5.14-5.18 para cada proteína adicional a ser registrada.
  20. Para imagens 3D, adquira pilhas z com espaçamento de 0,5-1 μm ao longo da altura total da célula. Isso foi feito com um protocoloJOB específico 21 projetado para o software de aquisição (elementos NIS) que grava um vídeo de um número pré-definido de quadros em posições z específicas, mantendo o PSF durante todo o tempo de aquisição.
    NOTA: O pacote de software, juntamente com instruções detalhadas para o usuário, é fornecido dentro do protocoloJOB 21. Uma descrição completa do CARGO também está incluída. O software, chamado "MultiZ_DNAPaint.bin", pode ser baixado na aba Materiais da publicação. Para executar o JOB, baixe este Arquivo e importe-o para o NIS-Elements JOBS Explorer, seguindo as instruções passo a passo fornecidas.

6. Processamento e análise de imagens

NOTA: As imagens foram processadas inicialmente por deconvolução usando um software compatível, seguidas por análise de localização de molécula única usando o software Picasso desenvolvido pelo laboratórioJungmann 16.

  1. Abra as pilhas de imagens ND2 no software NIS-Elements AR.
  2. Para imagens 2D, selecione Deconvolução 2D. Para imagens 3D, repita esse procedimento para cada z-stack individual.
  3. Escolha deconvolução cega, um orifício efetivo de 0,01, e defina o nível de ruído para Barulhento. Depois, insira a excitação e a taxa de emissão do laser, aqui 560 nm e 571 nm, respectivamente. Outros parâmetros são obtidos automaticamente a partir dos metadados ND2 para fornecer uma estimativa aproximada da função de espalhamento de pontos (PSF) da imagem de origem.
  4. Especifique o número de iterações (aqui, 12), selecione Criar Novo Documento e pressione Desenvolver. Salve o arquivo resultante após o processamento.
    NOTA: O algoritmo melhora iterativamente a qualidade da imagem ao realizar operações de convolução que refinam o PSF até que a convergência ou o número especificado de iterações seja alcançado. Recomenda-se a inspeção visual da imagem desconvoluta. Ajustar o número de iterações é necessário dependendo das restrições computacionais e da qualidade da imagem.
  5. Carregue a pilha de imagens desconvolutas no módulo Picasso Localize.
  6. Na barra de menu, selecione Analisar → Parâmetros e insira os parâmetros específicos da câmera de acordo com as especificações do fabricante. Para a câmera sCMOS usada neste estudo (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): ganho EM: 1, Linha de base: 100, Sensibilidade: 0,23 (fator de conversão, elétrons/contagem), Eficiência quântica: 0,95 (dependendo do comprimento de onda de excitação utilizado).
    NOTA: A Eficiência Quântica não é usada desde a versão 0.6.0 do Picasso e é mantida apenas para compatibilidade retroativa.
  7. Ajuste o comprimento do lado da caixa para 7. O comprimento da caixa é determinado usando a fórmula [6 × σPSF + 1], onde σPSF é o desvio padrão do PSF. Essa otimização melhora a precisão de localização, aprimorando a resolução da imagem reconstruída.
  8. Selecione o tamanho de pixel apropriado para a configuração de imagem, conforme o passo de seção 5.5.
  9. Em seguida, escolha um Gradiente Mínimo Líquido adequado (por exemplo, ~1000, dependendo da amostra) e ative o Preview para visualizar as localizações detectadas. Inspecione os resultados e ajuste o limiar de gradiente conforme necessário para minimizar detecções de fundo e garantir localização precisa.
  10. Na barra de menu, selecione Analisar → Localizar (Identificar & ajustar) para iniciar a identificação de pontos e o ajuste de todos os quadros do filme. Após a competição, esse processo salva automaticamente um arquivo .hdf5 e .yaml.
    NOTA: .hdf5 armazena a posição de localização de cada ajuste gaussiano e mais parâmetros. .yaml salva informações sobre o vídeo e o procedimento de análise e pode ser inspecionado usando um editor de texto.
  11. Carregue o arquivo .hdf5 no módulo Picasso Render para visualizar o mapa de localização reconstruído e realizar a correção de deriva.
  12. No Picasso Render, selecione Pós-processamento → Desenrolar por RCC. Insira um valor de segmentação, começando em 1000. Ao concluir, o gráfico de deriva xy calculado aparecerá em seguida. Repita o processo sequencialmente com valores de segmentação mais baixos (por exemplo, 500, depois 250), observando melhorias graduais na deriva temporal.
    NOTA: A correção de deriva também pode ser realizada usando nanopartículas como marcadores fiduciais; no entanto, ao imaginar planos elevados, o sinal de nanopartículas pode não ser visível. Nesses casos, apenas a correção de desvio por correlação cruzada redundante (RCC) é aplicada.
  13. Certifique-se de salvar o Arquivo corrigido por deriva, selecionando Arquivo → Salvar Localizações antes de fechar a janela de Renderização Picasso.
  14. Carregue o arquivo corrigido por deriva do passo 6.13 no módulo Picasso Filter para etapas adicionais de pós-processamento, impondo limiares nas métricas de qualidade da localização de molécula única, tais como: (i) Precisão de localização (lpx, lpy); (ii) larguras PSF (sx, sy); (iii) Contagens de fótons; e (iv) quaisquer critérios adicionais para remover ruído, exceções ou manchas mal resolvidas.
    NOTA: lpx e lpy (precisão de localização em x e y) estimam a incerteza na posição localizada ao longo dos eixos x e y e são calculados com base no limite inferior de Cramér-Rao (CRLB).
  15. Para filtrar uma propriedade, selecione a respectiva coluna no cabeçalho da tabela e escolha Plotar → Histograma no menu.
    NOTA: Selecionar duas colunas representa um histograma 2D.
  16. Para filtrar por um intervalo específico de propriedades, clique e arraste pela região desejada dentro de um histograma 1D ou 2D. A região selecionada aparecerá sombreada em verde, e quaisquer eventos de localização com valores fora desse intervalo serão instantaneamente excluídos da lista de localização.
  17. Filtre os dados por fótons, sx, sy, lpx e lpy, mantendo apenas a faixa central da distribuição de cada parâmetro para garantir a retenção das localizações mais confiáveis.
    NOTA: A porção central da distribuição de largura do PSF normalmente está entre 0,4 e 1,2 × tamanho de pixel. Exclua distribuições secundárias frequentemente causadas por sinais sobrepostos ou pontos mal resolvidos.
  18. Salve os dados filtrados selecionando Arquivo → Salvar no menu.
  19. Repita o processo do passo 6.1 ao 6.18 para todos os vídeos gravados para cada solução de imager.
  20. Abra o Arquivo filtrado no módulo Picasso Render. A intensidade nessa imagem super-resolvida representa o número de localizações. O contraste pode ser alterado selecionando Visualizar → Configurações de Exibição e alterando o valor da densidade máxima.
  21. Para salvar a imagem super-resolução de um único canal, selecione "Precisão de Localização Individual" na seção Desfoque. Uma barra de balança também pode ser adicionada a partir da seção de barra de escala.
  22. Para salvar a imagem super-resolução de todos os canais, abra todos os arquivos .hdf5 processados. A cor de cada canal pode ser alterada selecionando Visualizar → Arquivos no menu.
  23. Alinhe todos os canais selecionando os canais de pós-processamento → Alinhar.
  24. Selecione Arquivo → Exportar Imagem Completa para salvar uma imagem .png ou Arquivo → Exportar a Visualização Atual para um zoom específico da imagem.
    NOTA: Use práticas consistentes de nomeação e documentação de arquivos para reprodutibilidade. O software Picasso adiciona automaticamente um sufixo a cada arquivo salvo. As métricas Cramer Rao baseada em limite inferior e análise baseada em vizinhos mais próximos (NeNA)22 podem ser extraídas selecionando Visualizar → Mostrar informações no menu. O NeNA quantifica a distribuição espacial dos fluoróforos localizados ao avaliar a distância euclidiana entre localizações vizinhas. Enquanto o CRLB fornece um limite inferior teórico para a precisão de localização baseado em estatísticas de fótons e ruído de fundo, o NeNA oferece uma estimativa experimental da precisão de localização derivada diretamente do próprio conjunto de dados. Por essa razão, o NeNA é amplamente utilizado no SMLM como uma medida complementar ao CRLB, pois captura não apenas limites teóricos, mas também influências práticas como correção de deriva, erros de ajuste e variabilidade experimental. A métrica NeNA é extraída do módulo Picasso Render. O CRLB do ajuste de molécula única é usado para determinar os valores de precisão de localização informados (σSMLM). O valor reportado é a média entre σx e σy, para todas as localizações, que são o valor de modo da distribuição da precisão de localização em x e y, respectivamente.

Resultados

Para demonstrar as capacidades de imagem de super-resolução do sistema SDC-OPR (Figura 1A), sua resolução no plano foi avaliada por meio da realização de experimentos de imagem DNA-PAINT (Figura 1B) em complexos de poros nucleares (NPCs), que são uma estrutura de referênciabiológica 17. A Figura 1C mostra uma imagem representativa DNA-PAINT SDC-OPR da nucleoporina 96 (Nup96), marcada com proteína fluorescente verde aprimorada por monomérica (mEGFPs) e marcada com nanocorpos anti-GFP conjugados com DNA, em células U2OS. Os painéis ampliados revelam a subestrutura NUP, e a Figura 1D mostra proteínas Nup96 pareadas (indicadas por setas) consistentes com a simetria esperada de 8 vezes dos poros nucleares. Na Figura 1E, a distância euclidiana entre pares Nup96 foi medida alinhando-os e plotando o histograma da seção transversal da imagem somada (n = 16 pares). A análise revelou uma separação pico a pico de (13 ± 2) nm (Figura 1E), em concordância com os resultados dos modelos EM, bem como das imagens HILO eTIR 23. Cada ajuste de pico apresentou um desvio padrão de 4 nm, confirmando a alta precisão de localização (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) alcançada usando DNA-PAINT no SDC-OPR. Notavelmente, essa precisão foi mantida em todo o campo de visão de 53 × 53 μm², o que é excepcional para sistemas baseados em confocais.

Para demonstrar a capacidade de imagem multicolorida, o Nup96, as mitocôndrias e os microtúbulos em células U2OS foram marcados com DNA para aquisição usandoExchange-PAINT 18. Essa técnica utiliza fitas ortogonais de imager de DNA conjugadas a um único fluoróforo, permitindo que todos os alvos sejam excitados com a mesma fonte de laser (Figura 2A). Em vez de adquirir sinais simultaneamente, ele os separa em rodadas sequenciais de imagem, facilitando a integração direta em qualquer sistema comercial SDC-OPR. A Figura 2B mostra Nup96 em azul marcado com um nanocorpo anti-GFP, mitocôndrias em vermelho com um anticorpo anti-TOM20 secundário, e microtúbulos em verde com um anticorpo primário anti-α-tubulina. Notavelmente, a excepcional precisão de localização de molécula única obtida para a imagem Nup96 de cor única foi preservada em todos os alvos do experimento multi-alvo, resultando em valores de precisão de localização de 3,9 nm para o NPC, 4,0 nm para α-tubulina e 3,3 nm para mitocôndrias (Figuras 2B painéis 1, 2 e 3).

Para imagens de grande campo de visão, microtúbulos em células HeLa foram fotografados usando várias ampliações disponíveis no sistema SDC-OPR, combinadas com diferentes configurações de binning da câmera para manter tamanhos de pixels entre 78 nm e 108 nm (Figura 3). A Figura 3A mostra o citoesqueleto microtubular de 10 células HeLa, com cores representando precisão de localização. Com 1× de ampliação, a precisão média de localização é visivelmente pior em comparação com ampliações maiores (Figura 3B-D), com maior variabilidade observada. Isso se deve à redução da densidade de potência do laser em relação ao campo de visão maior, onde o perfil de iluminação gaussiano se torna aparente, levando a uma precisão menor em direção às bordas do campo de visão. No entanto, alcançar uma precisão média de localização de 9,5 nm no amplo campo de visão de 211 × 211 μm² é impressionante para sistemas baseados em confocais e permite uma investigação de alta resolução da heterogeneidade biológica.

Por fim, a possibilidade de imagens de células inteiras é demonstrada pela obtenção de imagens DNA-PAINT da rede de microtúbulos em células fixas HeLa com volume confocal de ~500 nm de espessura e 1 μm de passo z, usando a maior ampliação do sistema (4×, 53 × 53 μm² FOV). A Figura 4A apresenta as imagens de reconstrução de molécula única para cada plano z, juntamente com a precisão de localização correspondente e os valores de NeNA. Além disso, uma visualização 3D renderizada em cor da rede de microtúbulos na célula HeLa é fornecida na Figura 4C. À medida que a profundidade aumenta, o número de fótons detectados diminui devido ao espalhamento e às aberrações ópticas, resultando em redução da precisão de localização tanto para as precisões de localização derivadas do Cramér-Rao Lower Bound (CRLB) (Figura 4A, à direita) quanto para aquelas calculadas usando a métrica NeNA. Ainda assim, o alto nível de coleta de fótons possível pelo sistema SDC-OPR permite σSMLM ≤ 10 nm para até 9 μm de profundidade de imagem com distribuições estreitas. De fato, estruturas de microtúbulos filamentosos de dupla parede foram claramente resolvidas em várias profundidades: próximo à interface coverslip-célula, em posições axiais intermediárias e no topo da célula, com distância pico a pico entre 30 nm e 40 nm (Figura 4C), consistente com os valoresrelatados 24. Esses resultados destacam a capacidade do SDC-OPR de fornecer imagens de alta resolução em grandes FOVs e em toda a altura das células.

Figura 1
Figura 1: Microscopia de localização de molécula única no plano de diferentes amostras celulares e imagem multicolorida em super-resolução. (A) Esquema do sistema Confocal de Disco Giratório com Reatribuição de Fótons Ópticos (SDC-OPR), apresentando um arranjo de microlentes projetado para maximizar a coleta de fótons. (B) Esquema do DNA-PAINT: Fitas de DNA marcadas fluorescentemente, conhecidas como fitas de imager, hibridizam transitoriamente com sequências complementares de DNA (fitas de acoplamento) que são ancoradas ao anticorpo/nanocorpo que tem como alvo da proteína de interesse. Esses eventos de ligação de curta duração geram sinais de fluorescência que aparecem como piscar estocástico. (C) Imagem representativa DNA-PAINT no sistema SDC-OPR usando ampliação de 4× do NPC das células U2OS. A capacidade de alta resolução é demonstrada no inset, onde NPCs individuais são claramente resolvidos. (D) DNA-PAINT aprimorado com SDC-OPR permite a visualização de NPCs individuais, onde setas brancas destacam pares característicos de proteínas Nup96 dentro da arquitetura do poro. (E) Distribuição das medições de distância entre dímeros Nup96 (n=16 pares) dentro de unidades de simetria NPC simples. Esse valor foi modificado a partir de Zaza et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. 

Figura 2
Figura 2: Exchange-PAINT para imagem multicolorida usando um microscópio SDC-OPR. (A) Esquema do Exchange-PAINT de três alvos capturados sequencialmente. Três alvos proteicos foram marcados com anticorpos funcionalizados pelo DNA, fragmentos de Fab ou nanocorpos. As fitas do imager Cy3B foram imagens sequencialmente por tipo de fio, com etapas de lavagem entre as rodadas de imagem. (B) Imagem Exchange-PAINT em três cores de células U2OS usando microscopia SDC-OPR usando ampliação 4×, mostrando microtúbulos (vermelho; rotulados com anti-α-tubulina conjugada com DNA), mitocôndrias (verde; DNA-nanocorpos com alvo TOM20), e NPC (azul; Nup96 marcado com mEGFP e nanocorpos de DNA anti-GFP). Barra de escala: 5 μm. A região ampliada enfatiza a resolução aprimorada obtida no sistema SDC-OPR, focando em (1) mitocôndrias, (2) microtúbulos e (3) NUP. Barras de escala = 1 μm. Esse valor foi modificado a partir de Zaza et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3
Figura 3: Imagem DNA-PAINT dentro de grandes FOVs em um microscópio SDC-OPR. Imagens de DNA-PAINT de microtúbulos (marcação anti-α-tubulina) adquiridas em múltiplas ampliações: (A) ampliação de 1× e 1 binning (FOV de 211 × 211 μm²), (B) binning de 2,8× e 2 (FOV de 76 × 76 μm²), (C) ampliação de 4× e 4 binning (FOV de 53 × 53 μm²). A cor representa a precisão de localização de 0 a 16 nm no caso de ampliação de 1x e de 0 a 4 nm nas demais. (D) Precisão de localização medida a diferentes distâncias (em μm) do centro do campo de visão para ampliações de 1× (vermelho), 2,8× (amarelo) e 4× (verde). Esse valor foi modificado a partir de Zaza et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4
Figura 4: Imagem de DNA de célula inteira - PAINT. (A) Esquerda. Imagem volumétrica de microtúbulos em células HeLa via DNA-PAINT adquirida usando SDC-OPR a 4× de ampliação, mostrando seções axiais de z = 0 a 9 μm (passos de 1 μm). Cada plano exibe posição z , precisão de localização e métrica NeNA. Barras de escala: 5 μm (xy). Certo. Precisão de localização versus profundidade de penetração para todos os aviões. (B) Renderização 3D da rede de microtúbulos na mesma célula HeLa que em (A). A cor representa profundidade de penetração de 0 a 9 μm. (C) Imagens ampliadas de pequenas regiões destacadas de cada profundidade de penetração indicadas em (A). Esse valor foi modificado a partir de Zaza et al.14. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

A microscopia de fluorescência super-resolução rompeu a barreira de difração, aumentando dramaticamente a resolução espacial. No entanto, sua ampla adoção na pesquisa biológica enfrenta desafios contínuos. Notavelmente, as compensações entre campo de visão, resolução e profundidade de penetração dificultam otimizar os três fatores simultaneamente. Esses desafios foram enfrentados utilizando as capacidades combinadas do SMLM e da microscopia confocal de disco giratório, aprimoradas pela reatribuição óptica de fótons (SDC-OPR). Ao integrar matrizes de microlentes em uma configuração padrão de SDC, como possibilitado pelo sistema comercial SDC-OPR, a coleta de fótons foi aumentada enquanto o tamanho efetivo dos orifícios foi reduzido, levando a uma melhora significativa na resolução. Em comparação com a SDC padrão, o sistema SDC-OPR demonstrou uma melhora significativa na potência de resolução, distinguindo com sucesso características separadas por 10nm 14 no plano focal, enquanto a SDC padrão só conseguia resolver distâncias maiores que 20nm 11. Essa capacidade de resolução aprimorada ressalta o benefício da reatribuição de fótons para alcançar separações em escala molecular. Especificamente, a precisão de localização lateral abaixo de 2 nm foi alcançada no plano focal (z = 0 μm), com a precisão lateral permanecendo abaixo de 10 nm em profundidades de até 9 μm, combinada com um campo de visão altamente adaptável de 53 × 53 μm² ou 76 × 76 μm². Mesmo com um grande FOV de 211 × 211 μm², o sistema entregava uma impressionante precisão média de localização em plano de 9,5 nm. Esses resultados destacam a capacidade do sistema para imagens de alta resolução em células inteiras.

Quanto às reações de acoplamento para os diferentes anticorpos utilizados, o protocolo deve ser seguido cuidadosamente para garantir uma proporção ideal entre anticorpos e DNA. Exceder essa razão pode reduzir a precisão de localização e pode afetar negativamente medições quantitativas, como as realizadas noqPAINT 25. Portanto, é fundamental verificar a razão usando um espectrofotômetro UV-Vis de microvolume, garantindo uma proporção final de 1:1 entre DNA e anticorpo.

Um passo crítico para obter imagens de alta qualidade e super-resolução dos microtúbulos é a fixação adequada. Métodos convencionais de fixação que dependem exclusivamente de altas concentrações de PFA frequentemente desregulam as estruturas dos microtúbulos. Em vez disso, usar glutaraldeído (GA) isolado ou em combinação com PFA melhora significativamente a preservaçãoestrutural 26,27.

Para uma imagem ideal, um objetivo de alta abertura numérica (NA) é essencial para maximizar a coleta de fótons por evento de molécula única. No sistema comercial SDC-OPR, a potência do laser é intencionalmente menor do que nos microscópios convencionais TIRF usados para SMLM, minimizando o fotobranqueamento da amostra. Embora o DNA-PAINT elimine preocupações com o fotobranqueamento e teoricamente possa empregar maior potência de laser, os sistemas comerciais atuais impõem limitações, exigindo tempos de exposição mais longos em comparação com a iluminação TIRF. Além disso, como a iluminação no SDC-OPR é confocal, as moléculas não são continuamente excitadas durante a exposição. Como resultado, tempos de exposição mais longos são necessários em relação à iluminação contínua do TIRF; Neste estudo, foi utilizado um tempo de exposição de 300 ms. No entanto, dependendo dos requisitos de resolução de um experimento específico, tempos de integração mais curtos (por exemplo, 150-200 ms) podem ser empregados com perda mínima deresolução 28.

Otimizar a concentração da cadeia do imageador é um passo crítico para garantir que os sinais de molécula única permaneçam bem separados, ao mesmo tempo em que geram localizações suficientes para uma reconstrução precisa. Esse ajuste é análogo às aquisições padrão de SMLM, onde o equilíbrio entre densidade de eventos e sobreposição de sinais é cuidadosamente controlado. A concentração ideal do imager deve ser ajustada para cada alvo diferente. Por exemplo, para microtúbulos, recomenda-se uma concentração inicial do fio do imager inferior a 1 nM, com ajustes feitos conforme necessário.

Manter o foco estável durante aquisições prolongadas é fundamental, pois a deriva axial (z) não pode ser corrigida após o processamento. Deriva lateral (xy) pode ser compensada por meio de RCC ou marcadores fiduciais. Nesse sistema, o Sistema de Foco Perfeito (PFS) do microscópio garante a estabilidade do foco ao longo de horas de imagem.

Em resumo, a integração do SMLM com o SDC-OPR oferece uma plataforma poderosa para imagens de alta resolução profundas dentro de células inteiras, superando os tradicionais trade-offs entre resolução, profundidade e campo de visão. No entanto, para realizar plenamente as capacidades do sistema, uma atenção meticulosa às condições experimentais é essencial, desde a conjugação e fixação de anticorpos até configurações de aquisição e processamento de dados. Cada etapa, desde a preparação da amostra até a correção de deriva, desempenha um papel fundamental para alcançar dados confiáveis e de alta precisão. Com otimização cuidadosa do protocolo, essa abordagem oferece uma solução robusta e versátil para imagens quantitativas em escala nanométrica em amostras biológicas complexas. Espera-se que esse protocolo auxilie a comunidade na adoção da microscopia de localização de molécula única e na obtenção de imagens super-resolvidas de planos de amostragem que são difíceis de acessar usando iluminação convencional TIRF ou HILO. Ambos os objetivos são facilitados usando microscópios comercialmente disponíveis, que normalmente são encontrados em instalações de microscopia ao redor do mundo.

Em termos de outras aplicações futuras, o método é aplicável a amostras de células inteiras, bem como a amostras de tecido mais complexas em maiores profundidades de imagem, como demonstrado em estudosanteriores 14. Ao contrário de abordagens que exigem secção física, essa técnica permite a imagem volumétrica de tecidos intactos, preservando a arquitetura nativa e minimizando artefatos introduzidos pela secção física. O uso de sondas de afinidade menores, como nanocorpos, aprimora ainda mais a penetração tecidual em comparação com anticorpos de comprimento total, permitindo uma marcação mais uniforme em amostras espessas. Essa abordagem abre a porta para o estudo da organização celular e das distribuições moleculares in situ com maior fidelidade. Além dessas aplicações, a estratégia também se presta à triagem de alta produtividade de nanoestruturas e assemblagens biomoleculares, permitindo investigações sistemáticas de heterogeneidade estrutural e função. Além disso, desenvolvimentos recentes no DNA-PAINT resultaram em sondas de imager auto-tênticas, baseadas em interações de corante oucorante-corante 29,30,31, que efetivamente reduzem os sinais de fundo, aumentam a intensidade de fluorescência e melhoram a resolução espacial, permitindo taxas de aquisição mais rápidas. A integração dessas sondas fluorogênicas na estrutura SDC-OPR tem o potencial de aumentar ainda mais tanto a velocidade quanto a resolução de imagem. Combinar esses avanços com as forças do sistema SDC-OPR poderia expandir sua aplicabilidade a espécimes biológicos mais complexos, estabelecendo a plataforma como uma ferramenta flexível para mapeamento detalhado de estruturas celulares e moleculares em uma grande variedade de tecidos.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Essa pesquisa foi financiada pela Human Frontier Science Program Organization (HFSP) por meio de uma bolsa de pós-doutorado interdisciplinar para a CZ (LT0025/2023-C) e pelo Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas para apoiar M.T. (EP/R513143/1 e EP/W524335/1) e O.P.L.D (EP/R513143/1 e EP/T517793/1). S.S também reconhece a Royal Society por meio de uma bolsa Dorothy Hodgkin (DHF\R1\191019 e DHF\R\251006). Esse trabalho também foi apoiado por subsídios da The Chan Zuckerberg Initiative (2023-321188) e do BBSCR (BB/Y513064/1) para a S.S.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(±)-6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílicoMerck 238813-5GTrolox
3,4-ácido di-hidroxibenzóico  Merck 37580-25G-FPCA
60 e vezes; Lente objetiva Apo NA 1.49Nikon
7.0 KDA coluna de dessalinização de spin contendo resina de exclusão de tamanho  Fisher Scientific Ltd89882Colunas de Dessalinização Zeba Spin para o passo 2.4
Accutase - Meio de Descolamento de Células EnzimáticasCélula PromocionalC-41310
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP acoplado a DNA personalizado (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')Fotônica MassivaProduto personalizadoNanocorpo anti-GFP para Drosophila
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP acoplado a DNAFotônica MassivaMASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3Nanocorpo anti-GFP para NUP
Anti-alfa tubulina (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
Anti-coelho IgGFotônica MassivaMassive-sdAB-FAST 2-Plex, Secundário sdAB F2
Anti-TCRζ (6B10.2)BioLegend644102
Albumina sérica bovinaMerck A4503-10GBSA
Tubo centrífugo cônico 15 mLFisher Scientific Ltd17705004
Tubo centrífugo cônico 50 mLVWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonMicroscópio SDC-OPR
Dessalinização de colunas de spin com Sephadex G-25 (resina de exclusão de tamanho para purificação de DNA) e nbsp;Fisher Scientific Ltd11743309Marca: Cytiva. Colunas G-25 para o passo 2.5
D-glicoseMerck G8270-1KG
Mídia DMEMThermo Fisher Scientific11965092
DMSO, AnidroThermo Fisher ScientificD12345
DTT  (Dithiothreitol)Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
Soro Fetal BovinoThermo Fisher ScientificA5256701
GlutaraldeídoServa2311402
GlicerolMerck G5516-500ML 
GlicinaMP Biomédicos219482580
Maleimida-PEG2-succinimidil Merck 746223-50MG
Mídia 5A da McCoyFisher Scientific Ltd16600082
MES (ácido 2-(N-morfolino)etanolsulfônico)MerckM3671-50G
MetanolFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Tubos microcentrífugas 0,5 mLFisher Scientific Ltd11508232
Tubos de microcentrífuga 1,5 mLEppendorf10509691 
Espectrofotômetro UV-Vis de MicrovolumeThermo Fisher ScientificND-UM-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L 
Nanopartículas 90 nm - OuroCitodiagnósticoG-90-100
Câmera CMOS Orca Fusion-BTHamamatsu
Penicilina-EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15070063P/S
Solução salina tamponada com fosfato (solução 1x)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16% formaldeído (w/v), livre de metanolFisher Scientific Ltd11586711PFA
Cloreto de potássio Merck   P9541-500G
Protocatechuto 3,4-Dioxigenase  Merck P8279-25UN PCD
Sódio  HidróxidoFisher Scientific Ltd12963614
Anticorpo TOM20AbcamAb186735
Tampão TrisVWR InternationalA4577.1000
Tritão  X-100   VWR International1086031000
Pré-adolescente-20Merck P9416-50ML
Unidade de filtro centrífugo de ultrafiltração, MWCO de 100 kDaMerck UFC510024Fabricante: Amicon Ultra
μ-Slide 8 Poços Fundo de Vidro AltoIbidiIB-80807
μ-Slide VI 0.5 Vidro InferiorIbidiIB-80607

Referências

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