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Artigo de método

Desenvolvimento e Padronização de um Micrométodo Ex Vivo para Quantificação Intracelular da Vincristina em Células Primárias de ALL por LC-MS/MS

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DOI:

10.3791/69535

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23 de janeiro de 2026

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1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo teve como objetivo estabelecer e otimizar um método LC-MS/MS para a quantificação relativa do acúmulo de vincristina em células primárias pediátricas ALL.

Resumo

Quantificar a vincristina intracelular (VCR) em células primárias de leucemia linfoblástica aguda pediátrica (LLA) é essencial para entender diferenças específicas de amostra na absorção de medicamentos e para apoiar estudos experimentais com material escasso de pacientes. Aqui, apresentamos um micrométodo LC-MS/MS simplificado, especificamente otimizado para células primárias de ALL obtidas por meio de xenoenxertos derivados do paciente (PDX), abordando desafios importantes como disponibilidade limitada de células, tamanho celular pequeno e necessidade de recuperação reprodutível após múltiplas etapas de lavagem. Ensaios de longo prazo, variando de 1 a 5 horas, demonstraram que um período de incubação de 3 horas resulta nos níveis mais altos e consistentes de VCRs intracelulares, com menor variabilidade entre replicações. A otimização do método também estabeleceu que usar 2,5 × 106 células por condição melhora a robustez analítica em comparação com 1 × 106 células, que apresentaram maior dispersão em experimentos repetidos. Refinamentos críticos adicionais incluíram o uso de metanol frio para melhorar a eficiência da precipitação de proteínas e a incorporação de um padrão interno para monitorar e minimizar a variação procedural. O método permite quantificação sensível e precisa do videocassete intracelular em diferentes faixas de concentração, embora a menor dose testada (0,01 μM) não tenha sido quantificável após a incubação de 3 horas. No geral, esse micrométodo oferece uma abordagem prática, reproduzível e escalável para medir VCR intracelular em amostras primárias de ALL. Seu design apoia análises comparativas, validação de modelos ex vivo e futuras aplicações metodológicas voltadas para integrar a quantificação intracelular de medicamentos em avaliações farmacológicas mais amplas.

Introdução

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) representa aproximadamente 25% de todos os cânceres infantis e continua sendo a malignidadepediátrica mais comum 1,2. Embora avanços na terapia tenham melhorado significativamente as taxas de sobrevivência, agora ultrapassando 90%, a complexidade biológica da LLA continua impulsionando os esforços para desenvolver ferramentas que melhor caracterizem a doença no nívelcelular 3.

Alcaloides de Vinca, especialmente VCR, são componentes essenciais de TODOS os protocolosde tratamento 4. Como o VCR exerce seus efeitos citotóxicos intracelularmente, compreender sua absorção e acúmulo em células leucêmicas é fundamental para estudos envolvendo resposta a medicamentos, farmacodinâmica e comportamento celular em sistemas ex vivo. No entanto, a maioria das abordagens disponíveis para avaliar os níveis intracelulares de medicamentos depende de medições indiretas ou métodos semi-quantitativos, limitando a reprodutibilidade ea sensibilidade 5,6,7.

Paralelamente, muitas investigações ainda dependem fortemente das linhas celulares de leucemia, que carecem da heterogeneidade biológica e da relevância clínica das células primárias derivadas do paciente. Amostras primárias frequentemente apresentam desafios como número limitado de células, qualidade variável da amostra e a necessidade de técnicas analíticas altamente sensíveis capazes de detectar compostos intracelulares de baixaabundância 8.

Cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) fornece a especificidade e sensibilidade necessárias para a quantificação precisa dos agentes quimioterapêuticos, embora protocolos padronizados para medir VCR intracelular diretamente em células leucêmicas primárias continuam sendo escassos. Estabelecer micrométodos robustos compatíveis com material limitado do paciente pode facilitar uma ampla gama de aplicações, incluindo perfil farmacológico, avaliação de interações fármaco-célula e estudos comparativos entre subtipos de doenças ou condições terapêuticas.

Aqui, neste protocolo, descrevemos o desenvolvimento e otimização de um micrométodo para quantificação ex vivo de videocassetes intracelulares em células leucêmicas primárias usando LC-MS/MS. Para obter material suficiente para o desenvolvimento do método, amostras de pacientes foram transplantadas para camundongos NSG imunodeficientes para gerar os modelosPDX 9. Após a expansão in vivo , células leucêmicas humanas foram isoladas e criopreservadas10. Depois, foram descongelados, incubados com videocassete, lavados, lisados e analisados por LC-MS/MS para determinar os níveis intracelulares de medicamentos.

Esse método oferece várias vantagens: requer um pequeno número de células (2,5 milhões), é sensível e rápido, e é compatível com amostras primárias clinicamente relevantes. Por medir diretamente o conteúdo intracelular de medicamentos, oferece uma ferramenta quantitativa confiável para pesquisadores que investigam a absorção de medicamentos, respostas celulares a quimioterapias ou outras questões farmacológicas em malignidades hematológicas.

No geral, esse protocolo amplia o conjunto de ferramentas analíticas disponível para estudar LLA pediátrica e pode ser facilmente adaptado para outros medicamentos ou tipos de amostras, apoiando futuras investigações sobre biologia da leucemia, comportamento de medicamentos e farmacologia de precisão.

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Protocolo

As amostras de leucemia usadas neste estudo foram obtidas de frascos bio-bancados de pacientes tratados no Centro Infantil Boldrini, que permitiram o uso de suas células por meio de um formulário de consentimento informado. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (CAAE 34601120.7.0000.5376). Os protocolos para a geração de PDX em animais foram realizados de acordo com as normas e diretrizes éticas da Comissão de Ética Animal (Comissão de Ética no Uso de Animais) do Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0011-2020).

1. Preparação da amostra e incubação do medicamento (Dia 1)

  1. Preparação de material e soluções de trabalho
    1. Pese 2,5 mg de sulfato de Vincristina (peso molecular: 923 g/mol) e dissolva-o em 2,0 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) em um microtubo de 2,0 mL para preparar uma solução de estoque de 1,354 mM. Vórtice até estar totalmente dissolvido.
      ATENÇÃO: DMSO é um irritante; Use luvas e manuseie em uma capela química.
    2. Prepare a solução de trabalho de 100 μM misturando 147,71 μL da solução de VCR com 1.852,28 μL de DMSO em um microtubo de 2,0 mL. Vortex completamente.
    3. Distribua 500 μL da solução de trabalho em quatro microtubos de 0,6 mL e armazene a -20 °C por até vários meses. Evite descongelar as aliquotas mais de três vezes.
    4. Prepare uma solução de trabalho de vinblastina (VINB) de 100 μM misturando 181,81 μL de uma solução de estoque de 1,1 mM (sulfato de vinblastina 1 mg/mL, peso molecular: 909,07 g/mol) com 1.818,19 μL de água ultrapura estéril em um microtubo de 2,0 mL. Vórtice até ficar homogêneo.
    5. Aliquot a solução VINB funcionando da mesma forma que foi feita para videocassete.
    6. Prepare a solução de metanol + 0,1 μM de VINB misturando 49,95 mL de metanol com 50 μL da solução de trabalho VINB em um tubo de 50 mL. Vórtice até ficar homogêneo. Armazene a -20 °C até 3 meses.
      ATENÇÃO: Metanol é tóxico e inflamável; manuseio com EPI apropriado em uma exaustão de fumo.
    7. Prepare uma solução de água + 0,1% de ácido fórmico misturando 49,95 mL de água ultrapura com 50 μL de ácido fórmico em um tubo de 50 mL. Poço de vórtice. Armazene em temperatura ambiente (RT).
      ATENÇÃO: Ácido fórmico é corrosivo; Punho com luvas e proteção para os olhos.
  2. Descongelamento e lavagem das células primárias
    1. Descongelam as amostras de células crioppreservadas girando suavemente o frasco em um béquer contendo 15 mL de água destilada a 37 °C até que esteja totalmente descongelado.
      NOTA: Informações sobre os protocolos de coleta e congelamento de células podem ser encontradas em publicaçõesanteriores 9,10.
    2. Transfira o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 50 mL contendo 10-15 mL de PBS estéril 1x com uma pipeta Pasteur descartável estéril. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos em tempo de descanso.
    3. Descarte o sobrenadante invertendo o tubo.
    4. Resuspenda o pellet em 10 mL de meio AIM V com uma pipeta Pasteur descartável. Conte células viáveis e meça o tamanho médio das células usando um contador automático.
      NOTA: Recomenda-se o uso de células que exibam pelo menos 80% de viabilidade em relação ao número total de células coletadas.
    5. Calcule o volume necessário para coletar 2,5 × 106 células viáveis usando uma proporção simples baseada na concentração medida. Por exemplo, se a concentração for 5 × 106 células/mL, o volume necessário é 0,5 mL.
      NOTA: Realize cada tratamento em triplicado para reprodutibilidade dos dados. Salve o tamanho médio das células fornecidas no contador automático de células; Use para calcular o volume das células.
  3. Estrutura de tratamento de drogas
    1. Calcule o volume de solução de trabalho do VCR necessário para atingir uma concentração final de 1 μM em um volume total de 2,0 mL. Faça vórtice na solução original antes de pipetar.
    2. Adicione o meio AIM V, depois 2,5 × 106 células, e finalmente a solução do VCR em um microtubo de 2,0 mL. Faça um vórtice breve e gire levemente para baixo (5 s) para coletar qualquer líquido da tampa do tubo.
    3. Incube os tubos abertos a 37 °C, 5% de CO2 por 3 horas.
    4. Após a incubação, feche as tampas e centrifuge as amostras a 300 × g por 5 minutos em RT.
    5. Descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta, depois adicione 1 mL de PBS no RT ao tubo.
    6. Repita a centrifugação a 300 × g por 5 minutos em RT, remoção do sobrenadante e lavagem PBS mais duas vezes, totalizando três lavagens.
    7. Remova cuidadosamente todo o sobrenadante usando uma pipeta, ressuspenda o pellet em 100 μL de PBS e faça o vórtice até que o pellet esteja totalmente ressuspenso.
    8. Adicione 400 μL de metanol frio + 0,1 μM de vinblastina (-20 °C) diretamente à amostra, evitando contato com as paredes do tubo.
    9. Armazene as amostras durante a noite a -80 °C.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C por algumas semanas (parada segura).

2. Processamento de amostras para LC-MS/MS (Dia 2)

  1. Extração de amostras
    1. Pré-resfrie a centrífuga a 4 °C antes de retirar as amostras do freezer de -80 °C.
    2. Imediatamente após retirar as amostras do freezer, centrifuge-as a 13.000 × g por 20 minutos a 4 °C.
    3. Transfira 300 μL de sobrenadante para um microtubo de 1,5 mL.
    4. Seque completamente as amostras usando um concentrador a vácuo a 40-45 °C por 1 hora e 40 minutos.
      NOTA: Pellets secos podem ser armazenados a -20 °C por algumas semanas (parar seguro).
    5. Resuspenda cada pellet em 400 μL de água + 0,1% de ácido fórmico (previamente preparado). Faça vórtice suavemente até que o pellet esteja totalmente dissolvido.
    6. Centrifuge as amostras novamente a 13.000 × g por 20 minutos a 4 °C.
    7. Transfira 300 μL de sobrenadante para um frasco de 2,0 mL com tampa roscada para análise LC-MS/MS.

3. Configuração e aquisição de dados do LC-MS/MS

  1. Preparação de fase móvel e condicionamento da coluna
    1. Prepare o Solvente A misturando água ultrapura com ácido fórmico 0,1%.
    2. Prepare o Solvente B misturando acetonitrila com ácido fórmico a 0,1%.
      ATENÇÃO: O acetonitrilo é tóxico e inflamável; Cabo em uma exaustão química.
    3. Sonice cada solvente em um banho ultrassônico por 5 minutos. Conecte as garrafas ao módulo da bomba e purge o sistema em alto fluxo para remover contaminantes.
    4. Instale uma coluna BEH C18 de fase reversa (1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm).
      NOTA: Para realizar a análise, este estudo utilizou um sistema cromatográfico Acquity H-Class acoplado a um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo Xevo TQS-Micro.
    5. Use um gradiente binário composto pelos Solventes A e B, ambos previamente preparados.
    6. Execute o gradiente cromatográfico de 5% a 95% do Solvente B nos primeiros 2 minutos, seguido por 2 minutos de Solvente A para lavagem da coluna e reequilíbrio.
    7. Ajuste a vazão para 0,2 mL/min durante os 4 minutos de execução. Mantenha a temperatura da coluna em 40 °C e injete 10 μL de cada amostra.
  2. Configuração do método LC-MS/MS
    1. Abra o software LC-MS/MS. Clique em Arquivo > Novo > Método MS para iniciar um novo método.
    2. Vá na aba Função e defina o tipo de função para monitoramento de reações múltiplas (MRM). Insira as transições iônicas e os parâmetros listados na Tabela 1 para VCR e VINB (padrão interno).
    3. Defina o tempo de aquisição para 4 minutos. Clique em Aplicar para salvar.
      NOTA: Não exceda 4 minutos para garantir o reequilíbrio da coluna entre as injeções.
    4. Configure os parâmetros do UHPLC sob o Método de entrada > Edite o Método LC e salve como um arquivo .mth (Tabela 2).
    5. Defina os parâmetros de origem na aba Tune de acordo com a Tabela 3. Salve como arquivo .tun.
    6. Salve o método completo: Arquivo > Salve Como e Exporte como um arquivo .mth.
  3. Criar uma lista de exemplos e iniciar a execução
    1. Na tela inicial do software, abra a Lista de Amostras e crie uma lista com os nomes das amostras, volumes de injeção, posições dos frascos e o método a ser utilizado.
    2. Coloque um frasco com água ultrapura na bandeja do autoamostrador e designe como um branco. Faça o teste entre cada conjunto de injeções triplicadas para evitar retenções.
      NOTA: Antes de iniciar a corrida, certifique-se de que a pressão da coluna (ΔP) esteja estável e inferior a 10 psi.
    3. Selecione as linhas desejadas na Lista de Exemplos e clique em Executar > OK para iniciar a aquisição de dados.

4. Análise de dados

  1. Visualização e exportação de dados
    1. Após a execução, visualize os cromatogramas selecionando uma amostra e clicando em Cromatograma na barra superior do menu.
    2. Na tela inicial, clique em TargetLynx, selecione os arquivos que acabaram de rodar e clique em Processar > Selecionar o método vincristino > OK, para gerar tabelas de saída.
    3. Clique em Reportar > Tabela de Exportação e salve os dados processados como um arquivo .csv ou .xlsx.
      NOTA: Exporte áreas de pico brutas tanto para o analito quanto para o padrão interno.
  2. Organização dos dados e cálculo da razão
    1. Abra o arquivo exportado e crie as seguintes colunas:
      1. Amostra: Adicione o nome da amostra ou frasco.
      2. Executar: Indique a qual replica corresponde o valor.
      3. Área do VCR: Insira a área abaixo do pico para vincristina.
      4. Área VINB: Insira a área abaixo do pico para vinblastina.
      5. Relação VCR/VINB: Normalize cada valor de VCR dividindo-o pelo valor correspondente de VINN.
    2. Adicione colunas para valores de desvio padrão da área do VCR, área VINB e razão VCR/VINB para cada conjunto triplicado.
      NOTA: A normalização usando o padrão interno permite correção para variação no volume de extração ou injeção.
  3. Resultados de plotagem
    1. Abra o software de gráficos preferido e selecione o formato de Tabela Agrupada .
    2. Escolha Enter ou importar dados para uma nova tabela e, em Opções, selecione Inserir 3 valores replicados em subcolunas lado a lado.
    3. Plote apenas as razões normalizadas VCR/VINB para cada amostra, omitindo os valores da área bruta.

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Resultados

Resultados cromatográficos representativos obtidos após ensaios de acumulação intracelular usando células primárias ALL PDX incubadas com VCR e VINB são mostrados na Figura 1. As amostras foram preparadas usando 2,5 × 106 células por condição. Sob as condições cromatográficas descritas, o VCR foi consistentemente retido em 2,85 min com efeito matricial mínimo, e a forma máxima foi simétrica e bem resolvida. Esses perfis ilustram o comportamento cromatográfico esperado de VCR e VIN...

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Discussão

A avaliação precisa dos níveis intracelulares de fármacos em células leucêmicas primárias é essencial para entender o manuseio de medicamentos em nível celular e para apoiar o desenvolvimento de ensaios funcionais que complementem o perfilamento molecular. Abordagens analíticas existentes frequentemente exigem grandes quantidades de células, envolvem etapas longas de processamento ou dependem de leituras indiretas que não refletem a verdadeira disponibilidade intracelular de agentes quim...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos ao Centro Infantil Boldrini e a todos os pacientes que doaram suas amostras para o estudo. Adrielli C. Soares recebeu uma bolsa da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) e da Fundação de Pesquisa de São Paulo (FAPESP, 2023/18389-3). José A. Yunes recebeu uma bolsa de produtividade do National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq, 308399/2021-8). Esse trabalho foi apoiado por financiamento de pesquisa do Ministério da Saúde do Brasil pelo programa PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frasco de tampa roscada de 2,0 mLFornecimento de fluxo8-2400Usado com inserções de vidro com mola (5 x 29 mm) da mesma empresa (Cat. 5-29015)
Frasco de tampa roscada de 2,0 mLFornecimento de fluxo8-2400Usado com inserções de vidro com mola (5 x 29 mm) da mesma empresa (Cat. 5-29015)
AcetonitrilaMerck (Sigma-Aldrich)100030
AcetonitrilaMerck (Sigma-Aldrich)24010152
AIM VThermo Fisher Scientific12055091
Sistema cromatográfico Acquity UPLC Classe HWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
Condessa 3 FLThermo Fisher ScientificA49892
DMSOMerck (Sigma-Aldrich)D 8418
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
Ácido fórmicoMerck (Sigma-Aldrich)F0507
Garrafa de vidroMerck (Sigma-Aldrich)41121800
IncubadoraPHCBIMCO-50M-PE
MetanolMerck (Sigma-Aldrich)34860
Microtubo 1,5 mLEppendorf41121702
Microtubo 2,0 mLEppendorf30120094
PBSMerck (Sigma-Aldrich)PPB006
Speevac miVacFisher Scientific56340
O software para aquisição de dadosWaters Co.MassLynx
Espectrômetro de massa triplo quadrupolo Xevo TQ-S microWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
Sonicador UltrassônicoQuimisQ335D
Vinblastina 1 mg/mLLibbshttps://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/Vinblastina sulfato
VincristineCayman Chemicals11764

Referências

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  3. Gaudichon, J., et al. Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues. Blood Rev. 36, 40-56 (2019).
  4. Dhyani, P., et al. Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine. Cancer Cell Int. 22, 206(2022).
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  13. Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations. Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).

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