Este protocolo apresenta uma instrução passo a passo para criar uma lesão neonatal do plexo braquial em ratos, a ser usada como modelo na pesquisa de lesões congénitas do plexo braquial.
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Artigo de método
Desenvolvimento de um modelo neonatal de rato para lesão de nascimento no plexo braquial
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudar lesões congénitas do plexo braquial (IBP) tem sido desafiador devido às apresentações clínicas heterogêneas e à limitada confiabilidade de modelos animais. Para isso, desenvolvemos um protocolo cirúrgico que induz de forma reprodutiva uma lesão do plexo braquial neonatal panplexal em filhotes de rato Sprague-Dawley de 5 dias. Neste artigo, instruções passo a passo são fornecidas para abordar o plexo braquial em um filhote de rato. A técnica foi realizada em 15 filhotes de rato Sprague Dawley. Utilizando uma abordagem dorsal sob microscopia cirúrgica, foi feita uma incisão dorsal de 5 mm começando na base do crânio em direção ao nível da transição vertebral C7-T1. A dissecação contundente é levada até o músculo trapézio, seguida pela dissecação através dos músculos romboide e elevador da escápula subjacente. Após identificar marcos anatômicos como a coluna e a escápula, o ângulo superior da escápula foi suavemente retraído para visualizar o plexo braquial. O plexo braquial estava localizado e cauterizado, evidenciado por espasmos observáveis no membro superior. Para evitar a regeneração nervosa, um pequeno bloco de esponja de gelatina absorvível era colocado entre as extremidades proximal e distal dos nervos lesionados. Esse procedimento foi realizado com sucesso em todos os 15 filhotes de rato, com 87% de sobrevivência. Pós-operatório e no sacrifício, todos os ratos sobreviventes demonstraram lesões panplexais completas, validando esse modelo como eficaz e reprodutível para pesquisas em lesões congénitas do plexo braquial.
Introdução
A lesão de nascimento do plexo braquial (IBP) é uma lesão de nervo traumático que ocorre durante o parto. Forças de tração durante um parto complicado, frequentemente devido a distocia de ombro, trabalho de parto prolongado ou macrossomia fetal, resultam em fraqueza ou paralisia no braçoafetado 1. A incidência varia de 1 a 2 por 1.000 nascimentosvivos (2,3,4). Enquanto a maioria dos bebês recupera a função completa, 30% apresentam sintomas residuais à medida que crescem até a idade adulta, como limitações funcionais, desigualdades no comprimento dos membros, deformidades e contraturas articulares 5,6,7,8.
O modelo BPBI demonstra diferentes padrões de lesão, com implicações para o tratamento e prognóstico. Lesões do plexo superior (C5-C6, paralisia de Erb) são as mais comuns e envolvem predominantemente ruptura em vez deavulsões. Em contraste, lesões pan-plexais (C5-T1) frequentemente apresentam um padrão misto de rupturas da raiz craniana e avulsõescaudais 10. Avulsões são lesões pré-ganglionares que interrompem o gânglio da raiz dorsal sem capacidade de recuperaçãoespontânea 11.
As estratégias clínicas atuais de manejo variam desde fisioterapia conservadora até reconstrução microcirúrgica precoce do nervo, dependendo da gravidade dalesão 12,13. Os pacientes frequentemente precisam de cirurgias secundárias, incluindo liberação de tecidos moles, transferências de tendões e osteotomias, para melhorar ainda mais a função motora, a qualidade de vida e as sequelas musculoesqueléticas secundárias. No entanto, a eficácia dessas intervenções precoces e tardiasvaria 14,15,16. Além disso, o desenvolvimento musculoesquelético alterado contribui para limitações funcionais, desigualdades no comprimento dos membros e outras deformidades atualmente não passíveis de tratamento, destacando a necessidade de pesquisasadicionais 17,18. Portanto, permanece uma necessidade crítica de um modelo animal confiável, viável e reprodutível para investigar essas lesões.
Modelos de roedores são comumente usados em modelos de lesão do plexo braquial, sendo os camundongos a escolha mais comum devido à sua relação custo-benefício e facilidade de manuseio. No entanto, criar uma lesão reprodutível no plexo braquial neonatal pode ser anatomicamente desafiador devido ao seu pequeno tamanho. Modelos de animais grandes, como coelhos, porcos e primatas, oferecem várias vantagens para a criação de modelos, mas a um custo significativamente maior19. Os ratos, por outro lado, são maiores e geneticamente mais semelhantes aos humanos do que os camundongos, mas permanecem substancialmente mais econômicos e acessíveis do que modelos animais maiores. Portanto, ainda existe a necessidade de um animal viável e reprodutível para investigar o BPBI. Este estudo descreve um modelo passo a passo de criação de BPBI panplexal em ratos neonatais que pode ser usado para estudar mecanismos de lesão, intervenções de tratamento e sequelas de curto e longo prazo.
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Protocolo
Todos os procedimentos com animais foram realizados com aprovação do Comitê Institucional de Cuidado e Uso dos Animais (IACUC A0007335). A técnica foi realizada em 15 filhotes de rato Sprague-Dawley para avaliar a viabilidade e os resultados funcionais a longo prazo.
1. Pecuária
- Abrigar um rato Sprague Dawley grávida multipárano (idade gestacional: 14 dias) em uma caixa de reprodução (1354cm 2) contendo cama à base de papel de celulose, enriquecida com material de nidificação e enriquecimento da gaiola; manter a temperatura ambiente em 21 °C com umidade relativa em 28% e um ciclo claro/escuro de 12:12h. Ofereça comida para ratos e água imediatamente.
- Limpar as gaiolas semanalmente; Deixe a gaiola intocada por 48 horas após o nascimento dos filhotes. Para promover a habituação e reduzir o estresse, forneça segurança auditiva por meio de manuseio suave e fala. Durante a gestação tardia, certifique-se de que a mãe esteja habituada ao investigador por meio de manuseio diário e condicionamento olfativo, colocando bolas de algodão com aroma de etanol e betadina na gaiola da mãe.
- Após o parto dos filhotes, coloque petiscos na gaiola sem perturbar a mãe por 48 horas ou abrir a gaiola.
2. Preparação de materiais
- Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos necessários estejam preparados antes da cirurgia (veja a Tabela de Materiais). Esterilize todos os suprimentos cirúrgicos usando um autoclave a vapor a 121 °C por 1 hora.
- Crie uma cama cirúrgica de poliestireno expandido. (Figura 1)
3. Preparação cirúrgica
- Realize cirurgias em filhotes de rato com 5 dias de idade [faixa entre 3 e 9 dias].
- Induzir anestesia colocando o rato em uma câmara de indução com 2% de isoflurano em 2 L/min de oxigênio até que o estágio de anestesia média a profunda seja alcançado. Confirme anestesia adequada com uma leve pinçada no dedo usando pinça. Coloque o filhote de rato em um almofada térmica pré-aquecida. Mantenha a anestesia com 1,5-2% de isoflurano em oxigênio e monitore a frequência respiratória continuamente.
- Determine a dosagem adequada de analgesia com base no peso do filhote. Administrar buprenorfina de liberação prolongada (1 mg/kg de s.c.) para controlar a dor.
- Prepare um local cirúrgico asséptico aplicando três esfoliações alternadas de betadine e etanol.
- Posicione o filhote anestesiado em posição prona sobre a cama cirúrgica pré-preparada, com o nariz e a boca firmemente colocados no cone nadal do vaporizador de isoflurano (Figura 1B).
- Para minimizar o movimento durante o procedimento, cole a cabeça do filhote de rato no vaporizador de isoflurano e cubra a parte inferior do corpo, logo abaixo das extremidades superiores, com o floil.
4. Abordagem cirúrgica do plexo braquial
- Crie uma incisão cutânea de 5 mm usando uma lâmina nº 11, começando na base do crânio e estendendo-se caudal até a transição vertebral C7-T1 (Figura 1C).
- Cauterize cuidadosamente as artérias superficiais evitando as bordas da pele.
- Realize uma dissecação contundente até alcançar o músculo trapézio.
- Dissecar o trapézio e os músculos romboide e elevador da escápula subjacente usando cauterização. Coloque as pinças cauterizadas perpendiculares ao tecido para evitar danos térmicos nas bordas da pele.
- Retrair suavemente o ângulo superior da escápula para expor o plexo braquial. Identifique e isole o plexo braquial por dissecação contusa (Figura 1D e Figura 2A).
- Cauterize os nervos identificados do plexo braquial usando uma eletrocauterização bipolar ajustada a 15, e confirme a lesão bem-sucedida observando os espasmos musculares dos membros superiores.
- Coloque um pequeno pedaço de uma esponja de gelatina absorvível (aproximadamente 2 mm por 2 mm) entre os segmentos proximal e distal do plexo braquial para evitar a regeneração nervosa (Figura 2B).
- Feche a pele usando um ponto absorvível 7-0 em padrão contínuo e aplique um adesivo de tecido veterinário para evitar a deiscência da ferida (Figura 3).
5. Manejo pós-operatório
- Coloque o filhote de rato em uma almofada térmica com material de ninho da gaiola da dama de ratos (Figura 4). Monitore a frequência respiratória e os movimentos do filhote de rato até que ele volte aos padrões respiratórios normais.
- Para evitar rejeição materna, esfregue o filhote de rato suavemente com o material de nidificação da gaiola antes de colocá-lo de volta junto com a mãe.
- Inspecionar o filhote de rato 3 vezes ao dia nas primeiras 48 horas após a cirurgia. Se houver sinais de dor ou ausência de uma mancha de leite, administre analgesia suplementar (buprenorfina 0,05 mg/kg de s.c.).
- Monitore de perto complicações pós-operatórias, incluindo deiscência da ferida, infecção da ferida, redução da sensibilidade nos membros com potencial automutilação e canibalismo materno.
- Pese o filhote de rato diariamente. Se o filhote de rato apresentar perda de peso ou nenhum ganho de peso por 2 dias consecutivos, considere isso uma falha no crescimento e prossiga com a eutanásia por meio de uma injeção de pentobarbital (390 mg/mL) intraperitoneal.
- Avalie a função motora 1 dia após a cirurgia e a função motora de acompanhamento semanalmente usando uma escala de movimento dos membros: 0 = função ausente, 1 = função parcial, 2 = função simétrica normal.
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Resultados
A eficácia da técnica cirúrgica pode ser avaliada pela ausência de movimento no membro afetado, presença de contraturas, redução da amplitude de movimento e, após sacrifício, pelo grau de atrofia muscular, encurtamento do membro e diferenças morfológicas óssea e muscular em comparação ao membro não afetado. Um total de 15 filhotes de rato foram incluídos neste estudo. Durante o período de sobrevivência, dois dos filhotes de rato não conseguiram prosperar no pós-operatório devido ao baixo...
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Discussão
Este protocolo detalha o desenvolvimento de uma lesão do plexo braquial em um rato neonatal para realizar pesquisas sobre os resultados de curto e longo prazo da IBP, explorar opções de tratamento e compreender as sequelas.
O uso de um modelo não invasivo de roedores para estudar lesão do plexo braquial já foi descrito anteriormente; No entanto, esses modelos não foram especificamente adaptados para replicar um tipo específico de lesãonervosa...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos com gratidão à Dra. Felicia Boynton, DVM, e ao Dr. Chris Gow, DVM, por suas orientações especializadas sobre o manuseio de filhotes de ratos e mães de ratos, cuidados perioperatórios e pós-operatórios dos filhotes, que contribuíram substancialmente para a otimização deste protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 mL de Seringa Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Vicryl Revestido 7-0 (Polyglactin 910) | Ethicon | J576G | |
| 70% de isopropilálcool | Vet-One | 13985-598-01 | |
| Esponja de gelatina absorvível | Surgifoam | ETH1972 | |
| Solução de Betadina 5% Microbicida Antisséptico de Povidona-Iodo | PBS Saúde Animal | 11205 | |
| Material de nidificação | Bed 'r Nest | BRN8SR | |
| Cordas Bipolares | ASSI | ASSI. ATK26426 | |
| Buprenorfina (Base 0,5 mg/mL) de liberação prolongada | Conexão Wedgewood | 49426-0517-1 | |
| Enriquecimento de gaiolas | Twist 'n Rich | 10003949 | |
| Cama à base de celulose | Alpha Dri | NC2193839 | |
| Poliestireno expandido (isopor) | Fisher | 22-130-407 | |
| Gancho de pele FREER | Mais livre | MI2152 | |
| Gancho de Pele de Gillies Semi-afiado | DTR | GHB2001 | |
| Máquina de Anestesia Auto-Fluxo de Isoflurano | E-Z Systems | EZ-190F | |
| Isoflurano, USP | Veterinária Patterson & nbsp; | 1403-704-06 | |
| Pinça Bipolar Antiaderente da Jewelers, 11 cm, ponta reta, 0,25 mm, diâmetro da ponta | ASSI | ASSI. BPNS11223 | |
| Micro Tesoura no Estilo Baioneta | ASSI | ASSI. SNS21 | |
| Microscópio (cirúrgico) | Leica | M525 F40 | |
| Pinças microcirúrgicas Dumont #4 Dumont Swiss produzidas 1708-4TM-PO | Ambler Cirurgical | 31-906 | |
| Suporte de agulha microcirúrgico & nbsp; | ASSI | B-14-8 | |
| Cone do nariz, 9mm, Mouse, comprimento 2cm | VetEquip | 921609 | |
| Frasco de pentobarbital-eutanásia (390 mg/mL) 250 mL | Fatal plus | 9373 | |
| Papel alumínio plástico para comida | Press 'n Seal | Press'n-70-1-no3 | |
| Agulhas descartáveis, 30 G | BD | 14-821-13A | |
| Mesa de Cirurgia Aquecida para Pequenos Animais (ajustável) | Peco Services Ltd | 69023 | |
| Lâmina de Aço Inoxidável nº 11 | Bard Parker | 371211 | |
| Cobertura de toalha estéril | Dynarex Corporation & nbsp; | 4410 | |
| Cola de tecido | Vetbond 3M | NC9259532 | |
| Cotonadeiras e aplicadores com cabo de madeira | Fisher | 22-363-157 |
Referências
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Reimpressões e permissões
