Geração e caracterização mediada por CRISPR/Cas9 de uma cepa Ent2*/CyO de Drosophila melanogaster

Resumo

O transportador equilibrativo de nucleósídeos 2 (ENT2) é uma proteína transmembranar conservada envolvida no transporte de nucleósídeos e metabolismo celular. Neste estudo, foi estabelecido um fluxo de trabalho de edição genômica baseado em CRISPR/Cas9 para gerar um alelo direcionado a Ent2 em Drosophila melanogaster. Uma linha estável de Ent2*/CyO heterozigótica foi construída e mantida usando uma estratégia de cromossomos balanceadores. Este trabalho descreve o projeto, geração e validação molecular da linha mutante, bem como sua caracterização fenotípica sob diferentes condições de temperatura. O fluxo de trabalho estabelecido e a cepa mutante fornecem uma estrutura prática para estudar genes com fenótipos letais homozigóticos e para investigar a variação fenotípica associada à temperatura em Drosophila.

Resumo

Neste estudo, uma abordagem de edição genômica baseada em CRISPR/Cas9 foi usada para introduzir mutações no gene do transportador de nucleósidos equilibrados 2 (Ent2) em Drosophila melanogaster. RNAs-guia direcionados à região codificante do Ent2 foram projetados e co-injetados com o mRNA Cas9 em embriões w¹¹¹⁸. Alelos mutantes foram identificados por sequenciamento Sanger e mantidos como uma linha heterozigota estável Ent2*/CyO usando um cromossomo balanceador. Posteriormente, avaliamos o peso corporal, a capacidade de escalada, a taxa de sobrevivência e as atividades da superóxida dismutase (SOD) e catalase (CAT) em moscas-das-frutas a 22 °C e 25 °C, respectivamente. Os resultados indicam que, tanto em 22 °C quanto em 25 °C, o comprimento corporal e o peso das moscas-das-frutas Ent2*/CyO foram significativamente reduzidos em comparação com o w¹¹¹⁸, e seu desenvolvimento foi atrasado. A 22 °C, a vida útil total das moscas Ent2*/CyO era um pouco maior que a da W¹¹¹⁸, enquanto a 25 °C, nenhuma diferença significativa foi observada. Quanto à capacidade locomotora, o desempenho de escalada das moscas heterozigotas foi significativamente menor do que o do w¹¹¹⁸ em ambas as temperaturas, com os machos sendo mais severamente afetados. Além disso, as atividades enzimáticas antioxidantes da CAT e SOD nas moscas-das-frutas Ent2*/CyO foram significativamente reduzidas, indicando uma clara deterioração da capacidade antioxidante. Esses resultados descrevem o perfil fenotípico de uma linhagem mutante Ent2 gerada por CRISPR e demonstram a viabilidade de combinar edição genômica com estratégias de cromossomos balanceadores em Drosophila. Este estudo fornece uma estrutura metodológica e um recurso genético para futuras investigações de genes associados ao metabolismo e respostas ambientais.

Introdução

Drosophila melanogaster continua sendo um dos organismos modelo mais amplamente utilizados para genética e biologia do^{desenvolvimento.} É caracterizado por um ciclo de vida curto, reprodução rápida, ferramentas de manipulação genética estabelecidas e um genoma totalmente^{anotado 2,3}. Essa espécie é amplamente aplicada em estudos sobre função gênica, regulação metabólica e adaptabilidade ambiental ^4,5. Nucleósídeos e seus derivados, como o ATP, são centrais para a geração de energia celular, síntese de ácidos nucleicos e transdução de sinais em Drosophila, refletindo a regulação metabólica conservada entre^{metazoários 6}. Vias de sinalização purinérgica em Drosophila, que dependem dos mecanismos extracelulares de transporte de adenosina e nucleosídeos, destacam o papel funcional do movimento dos nucleósidos através das membranas na coordenação das respostas de transdução de energia e^{sinal 7}. Entre esses processos, o transporte de nucleóssidos através da membrana citoplasmática é mediado principalmente pela família dos transportadores de nucleósidos equilibrados (ENT), com o DmENT2 exibindo atividade funcional de transporte em Drosophila⁸.

A família ENT compreende múltiplos subtipos, entre os quais o ENT2 é um transportador de nucleósídeos transmembrana⁹ amplamente estudado. Ele facilita o transporte transmembranar independente de energia de vários nucleossídeos de purina e^{pirimidina 10,11}. Em mamíferos, ENT2 é um transportador bidirecional onipresente que facilita a absorção celular de nucleossídeos e nucleobases de purina e pirimidina. Essa atividade de transporte contribui para o salvamento de nucleotídeos e ajuda a manter a homeostase metabólica^{celular 12}. O ENT2 também media o transporte de uma variedade de medicamentos derivados de nucleósídeos, estendendo sua relevância funcional além do movimento endógeno dos nucleósídeos, destacando sua importância fisiológica e clínica^{mais ampla 13}. Além disso, ENT2 tem sido implicada em distúrbios neurológicos¹⁴, metabolismo^{tumoral 15}, disfunção^{vascular 16} e metabolismo energético celular^{em humanos 17}. No entanto, estudos que abordam os papéis em nível de organismo do Ent2 em Drosophila continuam limitados.

Os papéis do ENT2 no crescimento e desenvolvimento, metabolismo energético, desempenho locomotor e capacidade antioxidante sob condições de temperatura variável ainda não foram totalmente^{explorados 18}. A temperatura afeta fortemente a taxa metabólica basal e a longevidade na Drosophila, com temperaturas mais altas geralmente aumentando a atividade metabólica e reduzindo a^{longevidade 19}. Essas mudanças dependentes da temperatura na expressão gênica podem influenciar vias fisiológicas e, assim, podem modificar os efeitos fenotípicos de mutações genéticas^{específicas 20}.

A proteína 9 associada a repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas e agrupadas (CRISPR/Cas9) tem sido amplamente aplicada em Drosophila para várias operações de modificação genômica, como eliminação, deleção, substituição e introdução de marcadores específicas do sítio, demonstrando sua eficiência e^{confiabilidade 21,22,23}. O avanço mais recente indica que editores de base derivados do CRISPR também podem ser usados para modificações de base específicas de local mais finas em Drosophila, fornecendo uma nova ferramenta para mutações pontuais e controle fenotípico^{preciso 24}. Métodos tradicionais de mutagênese, incluindo mutagênese química e por radiação, bem como triagens mediadas por transposons, podem gerar mutações^{genéticas 25}. Essas abordagens são frequentemente limitadas por baixa eficiência e alta aleatoriedade nos eventos de mutação. Como resultado, os pesquisadores devem fazer triagem em grandes números de indivíduos para isolar alelos específicos de^{interesse 26}. O CRISPR/Cas9 permite a clivagem dirigida por RNA-guia programado (gRNA) em sequências de DNA especificadas. As quebras resultantes de fita dupla são reparadas por meio de união de extremidades não homólogas ou reparação dirigida por homologia, gerando mutações definidas e hereditárias e reduzindo significativamente mutações de fundo que podem confundir a análise^{fenotípica 27,28}. Alelos mutantes gerados via CRISPR/Cas9 podem ser mantidos em estado heterozigótico por ligação com cromossomos balanceadores, como Curly O (CyO)²⁹. Essa estratégia demonstrou prevenir efetivamente a perda de alelos letais em forma homozigótica na genética de Drosophila. Como resultado, apoia avaliações fenotípicas sistemáticas e de longo prazo, incluindo estudos funcionais sob temperaturas variáveis ou condições^{ambientais 29,30}. O design simples e a alta eficiência do CRISPR/Cas9 reduziram significativamente o ciclo de construção da cepa e aumentaram a estabilidade do fundo genético. Isso é particularmente importante para estudar fatores ambientais de longo prazo, como resposta à temperatura e homeostase do desenvolvimento.

Com base nessa base, o gene Ent2 em Drosophila melanogaster foi eliminado usando o sistema CRISPR/Cas9, e uma cepa mutante heterozigota Ent2*/CyO herdada de forma estável foi estabelecida. O ciclo de desenvolvimento, peso corporal, capacidade locomotriça e atividades das enzimas antioxidantes SOD e CAT foram avaliados sistematicamente. Ao comparar fenótipos multidimensionais de ^w1118 e moscas mutantes sob condições de temperatura variadas, este estudo visa apresentar uma estratégia reprodutível para gerar e manter linhas mutantes derivadas do CRISPR e fornecer uma caracterização descritiva dos fenótipos resultantes. Esse trabalho oferece uma estrutura metodológica e um recurso genético útil para estudos futuros que investiguem genes envolvidos no metabolismo e nas respostas ambientais.

Protocolo

1. Desenho de alvos CRISPR/Cas9 para o gene Ent2

1. Selecione sítios CRISPR candidatos nos exons 2 e 5 do Ent2 (ID FlyBase: FBgn0263916) usando CHOPCHOP (v3)³¹ e o CCTop (v1.0)³².
2. O genoma de referência foi definido como Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (Acessão de montagem RefSeq: GCF_000001215.4). Em seguida, foram identificados os sítios candidatos de gRNA. Por fim, os sítios identificados foram filtrados para obter os gRNAs ideais.
3. Filtro alvos por Pontuação de Especificidade do MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), pontuação CFD ≤ 0,1 (CCTop), conteúdo GC 40%–60% e distância mínima do PAM.
4. Classifique os alvos com uma pontuação ponderada (eficiência 50%, especificidade 30%, otimização GC 20%) e escolha dois gRNAs.
5. Adicione um "G" na extremidade 5′ de cada gRNA para satisfazer o requisito de promotor T7. Use os seguintes oligonucleotídeos diretos específicos de gRNA para gerar o molde de transcrição de sgRNA de comprimento completo por PCR:
   Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
   Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGTTTAGAGCTAGAAATAGC
6. A sequência restante do andaime sgRNA é fornecida pelo oligonucleotídeo universal reverso durante a PCR.

2. Preparação de modelos de transcrição de sgRNA

1. Preparação de modelos de transcrição de sgRNA
   1. Monte uma mistura de reação PCR de 60 μL usando o método de recozimento duplo-oligonucleotídeo–^{PCR 33}, conforme as instruções do fabricante. Combine o oligonucleotídeo direto específico do gRNA (Ent2-sg1-F ou Ent2-sg2-F) com um oligonucleotídeo reverso universal que codifica o andaime do sgRNA para obter o molde de dsDNA de comprimento completo para transcrição in vitro.
   2. Programe o termociclador: 95 °C 3 min; 35 ciclos de 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; depois 72 °C em 10 minutos; segure a 12 °C.
2. Purificar o modelo de transcrição
   1. Adicionar 100 μL de acetato de amônio (veja Tabela de Materiais) ao produto de PCR de 60 μL; Misturar. Adicionar 400 μL de etanol anidro; Inverta para misturar e incube a -20 °C por 20 minutos.
   2. Centrifugar a 4 °C, 20.000 x g por 15 min; Descarte o supernadante.
   3. Seque o pellet ao ar com o tubo aberto por 10 minutos. Resuspenda o pellet em 10 μL de ddH₂O livre de nuclease.
3. Transcrição in vitro de gRNA
   1. Configure uma reação transcricional in vitro de T7 de 10 μL seguindo as instruções do kit (veja Tabela de Materiais).
   2. Incube a 37 °C por 35 minutos. Adicione 0,5 μL de DNase I (fornecido no kit de transcrição) e incube a 37 °C por 15 minutos.
4. Purificar gRNA
   1. Dilua a mistura de transcrição a 60 μL com ddH₂O livre de nuclease. Adicione 60 μL de fenol/clorofórmio saturado em água (veja Tabela de Materiais); Vórtice brevemente e centrifugar a 4 °C, 16.000 x g por 5 minutos.
   2. Transfira 45 μL da fase aquosa para um novo tubo livre de RNase de 1,5 mL. Adicione 5 μL de acetato de sódio; mistura.
   3. Adicione 125 μL de etanol anidro pré-resfriado; misture e incube a -20 °C por 20–30 minutos. Centrifugar a 4 °C, 20.000 x g por 15 min; Descarte o supernadante.
   4. Lave o pellet com 200 μL de etanol a 70% (livre de RNase); centrífuga a 4 °C, 20.000 x g por 5 min; Remova o supernadante.
   5. Seque o pellet a 37 °C até que o etanol evapore completamente. Resuspenso em 20 μL ddH₂O; aliquota e armazene a -80 °C.
   6. Meça a concentração de gRNA usando um espectrofotômetro NanoDrop e ajuste a concentração para 250 ng/μL para injeção. Garanta a pureza do gRNA com uma razão A260/A280 de aproximadamente 2,0.
      NOTA: Enfatizamos que luvas devem ser usadas durante todo o processo para proteção contra RNase. Todos os consumíveis, incluindo tubos centrífugos pré-resfriados livres de RNase e pontas de pipeta, devem ser usados consistentemente durante o procedimento. Resíduos orgânicos gerados durante a operação devem ser coletados separadamente em recipientes designados de acordo com o tipo e regularmente transportados para uma instalação certificada de descarte de resíduos perigosos para o manuseio adequado.

3. Preparação do mRNA Cas9

1. Preparação do Modelo de Transcrição
   NOTA: Use pontas e tubos sem RNase durante as etapas relacionadas ao RNA.
   1. Descongelar o plasmídeo de expressão Cas9 MLM3613 (veja Tabela de Materiais) sobre gelo. Em um tubo livre de RNase, combine 20 μg de DNA plasmídico, 7,5 μL de buffer de restrição 10x, 1 μL de PmeI (10.000 U/mL) e ddH₂O livre de nuclease para 75 μL.
   2. Incube a 37 °C por 30 minutos. Verifique a linearização completa carregando 5 μL em um gel de agarose a 1% a 120 V por 30 minutos.
2. Purificação de Modelos de Transcrição
   1. Adicione 23 μL de dodecil sulfato de sódio a 2% (SDS, veja Tabela de Materiais para detalhes) e 0,5 μL de proteinase K (veja Tabela de Materiais para detalhes) a 70 μL do digesto; incubar a 50 °C por 30 minutos.
   2. Adicione 45 μL de clorofórmio e 45 μL de fenol Trissaturado; Vortex brevemente; Centrífuga 13.800 x G, 5 min.
   3. Transfira a fase aquosa de 90 μL para um novo tubo. Adicione 10 μL de acetato de sódio (fornecido pelo kit) e 200 μL etanol anidro pré-resfriado; mix; incubar −20 °C, 30 min.
   4. Centrífuga 20.000 x g, 4 °C, 15 min; Descarte o supernadante. Lave o pellet duas vezes com 100 μL de etanol 70%; centrifugar 20.000 x g, 2 min cada; Seca ao ar.
   5. Dissolver o DNA em 20 μL ddH₂O livre de nuclease; confirme >500 ng/μL.
3. Transcrição in vitro com co-caping
   1. Configure a reação usando um kit de transcrição in vitro T7 com capas (veja a Tabela de Materiais) conforme as instruções do fabricante.
   2. Incubar a 37 °C por 2 horas para gerar o mRNA Cas9 limitado.
   3. Após a conclusão da reação de transcrição, adicione 1 μL de DNase (fornecido no kit, concentração 2 U/μL), misture bem e incube a 37°C por 15 minutos para degradar o molde de DNA.
4. Adicione uma cauda poli(A)
   1. Leve o RNA para 14 μL ddH₂O.
   2. Adicione 2 μL de 10x E. coli Poli(A) polimerase tampon, 2 μL de ATP (10 mM), 1 μL inibidor de RNase e 1 μL de poli(A) polimerase.
   3. Incube a 37 °C por 45 minutos.
5. Purificar o mRNA
   1. Aplique a reação a um kit de RNA total em coluna de spin (veja Tabela de Materiais). Carregue a amostra sobre uma coluna de spin de membrana de sílica de 2 mL; centrífuga 8.000 x g, 15 s; descartar o fluxo contínuo.
   2. Adicione 500 μL de tampão RPE à coluna RNeasy, centrifuge a 8000 x g por 15 s e descarte o líquido residual. Repita essa etapa uma vez, depois centrifuge por 2 minutos e descarte o líquido residual.
   3. Coloque a coluna RNeasy em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 30 μL de ddH₂O livre de RNase, centrifuge a 8000 x g por 1 minuto para eluir o RNA. Ajuste a concentração de mRNA para 500 ng/μL para a injeção. Armazene o RNA eluiado a -80 °C.

4. Microinjeção de embriões de Drosophila

1. Preparação de Amostras de Injeção
   1. Misture 15 μg de mRNA Cas9 com gRNA de fita dupla de 7,5 μg em uma razão de volume de 2:1.
   2. Ajuste para 30 μL com água livre de RNase tratada com DEPC; Fique no gelo.
2. Criação de Drosophila
   1. Transfira a cepa injetada de Drosophila w¹¹¹⁸ para grandes tubos de alimentação para amplificação. As moscas^{W 1118} foram usadas como controle de referência para representar o estado fisiológico de base sem efeitos associados ao balanceador.
   2. Mantenha as moscas em uma câmara climática artificial ajustada a 25 °C com umidade de 60%–70% e um ciclo de 12:12 de luz a escuro por 14 dias.
   3. Às 17:00 do dia seguinte ao período de criação de 14 dias (Dia 15), colete moscas adultas para sincronizar a postura cronometrada dos embriões. Esse tempo específico de coleta garante que os embriões usados para injeção estejam em um estágio de desenvolvimento consistente. Controlar o horário do dia é importante para minimizar os efeitos do ritmo circadiano no desenvolvimento embrionário e no comportamento reprodutivo, garantindo assim a reprodutibilidade experimental e reduzindo a variabilidade fisiológica entre os lotes.
3. Microinjeção de Drosophila
   1. Colete moscas adultas para injeção em gaiolas para moscas, com aproximadamente 400 adultos por gaiola. Coletar embriões em placas de ágar revestidas com levedura; Recolha os embriões em até 60 minutos após a postura e enxágue-os nas coberturas. Nenhuma decorionação foi realizada antes da injeção.
   2. Alinhe os embriões em coberturas com os polos posteriores voltados para fora, organizados de forma ordenada de cima para baixo. Certifique-se de que a agulha de injeção penetre no polo posterior até uma profundidade apropriada (aproximadamente um quinto do comprimento do embrião) para uma entrega citoplasmática consistente. Um total de 300 embriões foram usados neste estudo.
   3. Sob um estereoscópio, foque a ponta da agulha e o embrião no mesmo plano.
   4. Usando o instrumento de injeção, perfure o polo posterior e injete 0,001 μL da mistura em cada embrião.
   5. Transferir embriões injetados para frascos de alimentos; incubar a 25 °C, ~70% de umidade relativa (RH) para obter geração de P₀ (os adultos injetados que sobrevivem para produzir descendentes).

5. Construção de cepas de expressão estável em Drosophila

1. Cruzar P₀ eclosedado com moscas Bc/CyO .
   1. Microinjetar uma mistura de gRNA direcionado ao gene de interesse e à proteína Cas9 em 300 embriões da cepa w1118 Drosophila . Após a injeção, obtenha um total de 30 adultos P0 viáveis e férteis. Cruze cada adulto P0 (mosaico) individualmente com moscas da cepa w1118 , resultando em 16 cruzamentos de pares únicos (8 frascos com machos P0 cruzados com fêmeas virgens e 8 frascos com fêmeas P0 cruzados com machos). Mantenha todos os cruzamentos a 25 °C sob condições de cultivo constante.
   2. Após o aparecimento das larvas F1, remova as moscas parentais P0. Extrair DNA genômico da prole F1 e submetê-lo à análise por PCR para determinar os genótipos adultos F1 (Ent2/+).
   3. Gerar descendentes F2 por meio de cruzamentos simples entre moscas Bc/CyO . Selecione adultos individuais F2 e genotipe-os para identificar moscas com o genótipo Ent2/CyO .
   4. As moscas Intercross F3 (Ent2/CyO) para avaliar a presença de mutantes homozigóticos. Se nenhuma mosca homozigótica for recuperada, cruza moscas Ent2/CyO por uma geração adicional para determinar ainda mais se o genótipo homozigótico é letal.
2. Extração de DNA genômico de Drosophila
   1. Colete uma ou duas moscas adultas em um tubo EP de 1,5 mL e adicione 110 μL de Pad de Extração de DNA Vegetal.
   2. Homogeneize as amostras completamente usando um moedor de tecido por pelo menos 3 minutos.
   3. Incube os homogenados em um banho metálico a 65 °C por pelo menos 30 minutos.
   4. Adicione 100 μL de clorofórmio, inverta suavemente a mistura e faça vórtice por 10 segundos. Centrifuge as amostras a 14.000 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente.
   5. Transfira cuidadosamente aproximadamente 65 μL (ou mais) do sobrenadante para um novo tubo, adicione dois volumes de etanol absoluto pré-resfriado (pré-incubado a 4 °C por pelo menos 10 minutos), invirca suavemente para misturar e incube a -20 °C por pelo menos 15 minutos.
   6. Centrifuge amostra a 14.000 rpm por 10 minutos a 4 °C e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
   7. Seque o pellet de DNA ao ar em temperatura ambiente ou em uma incubadora até secar completamente, depois ressuspenda em um volume apropriado de tampão de PB. Para amostras fêmea (f), adicione 50 μL de tampão PB, enquanto para amostras macho (m), adicione 15 μL.
3. Amplificação por PCR e sequenciamento Sanger
   1. Realize amplificação por PCR usando primers específicos projetados para flanquear as regiões a montante e a jusante do sítio alvo do gRNA.
   2. Purifique os produtos de PCR e submete-os ao sequenciamento Sanger. Analise os cromatogramas de sequenciamento usando o software^{SnapGene 34} e alinhe com a sequência de referência do tipo selvagem para análise comparativa.
   3. Examine os gráficos de pico próximos ao sítio alvo do gRNA para observar picos sobrepostos indicativos de mutações indeles. Realize a divisão de pico para resolver sinais mistos e confirmar o tipo de mutação, incluindo inserções ou deleções no local alvo.
   4. Retrocruzamento com machos Bc/CyO por 4 gerações para estabelecer Ent2/CyO.
      Nota: Foi observado que Ent2*/Ent2* e CyO/CyO são letais nos estágios iniciais do desenvolvimento; portanto, heterozigotos Ent2*/CyO são mantidos.
4. Após estabelecer os heterozigotos Ent2*/CyO , colete amostras do mesmo lote de heterozigotos Ent2*/CyO sob um estereoscópio.
5. Selecione aleatoriamente 20 moscas adultas e pese-as usando um balanço de precisão com resolução de 0,001 g. Fotografe as amostras para documentar as características fenotípicas.

6. Caracterização fenotípica descritiva

1. Os últimos 120 machos e 120 fêmeas (testados três frascos para cada grupo, com cada frasco contendo 20 moscas) de cada um de Ent2*/CyO e w¹¹¹⁸ a 22 °C e 25 °C.
2. Registre o número de mortes semanalmente e trace as curvas de sobrevivência.
3. Formar 30 pares aleatórios de acasalamento por grupo; permitir acasalamento por 24 horas;
4. Transfira adultos para tubos frescos; descendente posterior.
5. Aos 7 dias após a eclosão, avalie o sucesso da escalada (≥8 cm em até 30 s) com seis réplicas por grupo.
6. Todas as observações foram registradas como características descritivas da linhagem mutante e não foram usadas para inferir a função gênica.

7. Medir as atividades enzimáticas antioxidantes

1. Coletar 300 machos e 300 fêmeas adultos (testar três frascos para cada grupo, com cada frasco contendo 100 moscas) Ent2*/CyO e ^w1118 moscas controle aos 5 dias após a eclosão para garantir maturidade fisiológica e idade comparável.
2. Transfira as moscas para tubos vazios sem comida e passe fome por 2 horas para padronizar o estado metabólico antes dos ensaios bioquímicos.
3. Adicione um fio/tubo de aço; homogeneize a 60 Hz, 2 min.
4. Centrífuga 4 °C, 161 x g, 10 min; Colete o sobrenadante.
5. Meça superóxido total de dismutase (SOD, veja Tabela de Materiais para detalhes) e catalase (CAT, veja Tabela de Materiais para detalhes) de acordo com as instruções do kit.

8. Estatísticas e análise de dados

1. Expresse todos os dados como média ± erro padrão da média (± SEM).
2. Use ANOVA unidirecional para comparar dados de atividade enzimática; Aplique ANOVA de três vias (fatores: genótipo, temperatura, sexo) para o peso do corpo, capacidade de escalada e comprimento corporal. Realize o teste HSD de Tukey post hoc quando^{apropriado 35}.
3. Defina significância como P < 0,05 para todos os testes estatísticos.
4. Analise dados de longevidade usando curvas de sobrevivência e realize o teste log-rank (Mantel-Cox), que avalia se existem diferenças significativas nas trajetórias de sobrevivência entre as coortes^{experimentais 36}.
5. Realize todas as análises e plotamentos no software GraphPad Prism 9.5.0 seguindo as diretrizes^{do software 37}.
6. Todas as análises estatísticas foram realizadas apenas para comparação descritiva e não para estabelecer relações causais.

Resultados

Análise de design e verificação de efetividade dos sítios de direcionamento do gene Ent2
Os locais-alvo candidatos para o gene Ent2 foram projetados usando plataformas CHOPCHOP e CCTop (Figura 1). Dois gRNAs que visam as regiões do éxon 2 e do exon 5 foram selecionados com base em critérios de especificidade e eficiência. Para verificar a edição bem-sucedida do genoma, o DNA genômico de indivíduos selecionados aleatoriamente da linha Ent2*/CyO estabelecida foi amplificado e submetido ao sequenciamento Sanger. Cromatografias de sequenciamento mostraram picos sobrepostos começando próximos ao sítio alvo, consistentes com mutações de inserção/deleção (indel). Análises de sequência adicionais revelaram mutações de deslocamento de quadro que levaram a códons de parada prematuros (Figura 2). Esses resultados confirmam que o sistema CRISPR/Cas9 introduziu com sucesso mutações no locus Ent2 alvo e demonstram a viabilidade do fluxo de trabalho de edição do genoma.

Figura 1. O diagrama esquemático do local de eliminação do gene Ent2 e a localização do primer de detecção no genoma. Este esquema ilustra a estrutura genômica do locus Ent2, destacando o CDS (verde), códons de início e parada (vermelho), motivo PAM do gRNA (cinza), sequência alvo do gRNA (azul) e sequência do primer de amplificação de gRNA (amarelo). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. O gráfico máximo de sequenciamento dos resultados da descendência de Drosophila de linhagem estável autoendogámica Ent2*/CyO. Cromatograma sequenciante confirmando o genótipo da prole obtida do autocruzamento da linha heterozigota estável Ent2*/CyO . Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Observações morfológicas descritivas da linha Ent2/CyO
Observamos diferenças no formato corporal entre os dois genótipos de moscas-das-frutas entre sexos sob condições de 22 °C e 25 °C usando um estereomicroscópio (Figura 3). Em ambas as condições de temperatura, tanto machos quanto fêmeas apresentavam um formato corporal típico de "fuso longo". Os abdômens das fêmeas eram largos e em formato de fuso, com as pontas das asas se estendendo levemente além da ponta abdominal. A junção tórax–abdômen nos machos era claramente definida, e a pigmentação escurecida na extremidade do abdômen — uma característica distintiva dos machos — era visível. As asas das moscas w¹¹¹⁸ de ambos os sexos eram transparentes, com veias claramente definidas, e não foi observada curvatura na borda das asas ou quebra das veias. Em contraste, heterozigotos Ent2*/CyO apresentaram flexão perceptível na base da asa e curvatura das bordas da asa. Com 22 °C, independentemente do gênero, o comprimento corporal das moscas-das-frutas era significativamente maior que o do mesmo genótipo, com 25 °C. Além disso, o comprimento corporal das fêmeas era significativamente maior do que o dos machos na mesma temperatura. Além disso, tanto em 22 °C quanto em 25 °C, o tamanho corporal dos heterozigotos Ent2*/CyO era menor do que o das moscas correspondentes w¹¹¹⁸ . Para investigar a base morfológica, medimos simultaneamente o comprimento do corpo das moscas (Figura 3E, Tabela 1). Uma ANOVA tripla revelou efeitos principais significativos do genótipo (F(1,16)=230,1, P<0,0001), temperatura (F(1,16)=19,50, P=0,0004) e sexo (F(1,16)=166,9, P<0,0001). Interação genótipo x sexo significativa (F(1,16)=14,96, P=0,0014) e uma interação significativa entre genótipo x temperatura x sexo (F(1,16)=6,231, P=0,0239) também foram observadas.

Figura 3. A morfologia controle de adultos w¹¹¹⁸ e Ent2*/CyO . Imagens representativas mostrando características posturais de Drosophila feminina (A, C) e masculina (B, D) em 22 °C e 25 °C, juntamente com comparação quantitativa do comprimento corporal (E). ** P < 0,01. Barra de escala: 1 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de sobrevivência sob diferentes condições de temperatura
Analisamos estatisticamente as curvas de sobrevivência de heterozigotos Ent2*/CyO e de^w1118 moscas a 22 °C e 25 °C (Figura 4). Os resultados mostraram que a curva de sobrevivência das fêmeas heterozigotas Ent2*/CyO foi a mais alta, com dois indivíduos ainda vivos na 14ª semana. Todas ^{as 1118} mulheres morreram até a 14ª semana. Todos os machos heterozigotos Ent2*/CyO morreram até a 12ª semana, enquanto todos os^{homens com 1118} morreram até a 11ª semana. Esses achados indicam que, a 22 °C, a expectativa de vida total das fêmeas é maior do que a dos machos, e dentro do mesmo sexo, a capacidade de sobrevivência dos heterozigotos Ent2*/CyO é ligeiramente maior do que a do tipo w¹¹¹⁸.

Sob condições de 25 °C, o período geral de sobrevivência foi significativamente reduzido. As curvas de sobrevivência de ^{w 1118} fêmeas e machos heterozigotos Ent2*/CyO caíram para zero até a décima semana. As curvas de sobrevivência das fêmeas heterozigotas Ent2*/CyO e de^{W 1118} machos diminuíram para 1–2 indivíduos na 8ª semana e atingiram zero na nona semana. A diferença entre o mutante e w¹¹¹⁸ não foi estatisticamente significativa (P > 0,05). Essas observações descrevem as características de sobrevivência da linhagem mutante sob diferentes condições ambientais.

Figura 4. Curvas de sobrevivência de Drosophila sob diferentes condições de temperatura. Análise de sobrevivência comparando a expectativa de vida das moscas Ent2*/CyO e w¹¹¹⁸ a 22 °C e 25 °C. n=3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Avaliação da atividade locomotora
As habilidades de escalada das moscas da fruta w¹¹¹⁸ e Ent2*/CyO foram comparadas sob duas condições de temperatura: 22 °C e 25 °C (Figura 5, Tabela 2). Os resultados mostram que, a 22 °C (Figura 5A), 98,15% das ^{mulheres de W 1118} conseguiram escalar mais de 8 cm em até 30 s, enquanto essa proporção caiu para 89,74% em fêmeas heterozigotas Ent2*/CyO (P < 0,05). Todos os ¹¹¹⁸ machos conseguiram escalar mais de 8 cm, enquanto a taxa de sucesso na escalada em machos heterozigotos Ent2*/CyO foi de 98,14% (P < 0,05). A 25 °C (Figura 5B), todas as¹¹¹⁸ fêmeas (100%) subiram mais de 8 cm em até 30 s, mas essa proporção diminuiu para 91,31% em fêmeas heterozigotas Ent2*/CyO (P < 0,05). Entre ^{os 1118} machos, 77,28% conseguiram escalar mais de 8 cm (P < 0,01), enquanto apenas 63,57% dos machos heterozigotos Ent2*/CyO conseguiram essa subida (P < 0,01). Para avaliar melhor o desempenho locomotor, foi analisada a proporção de moscas que subem além de 15 cm (Figura 5C). Uma ANOVA tripla revelou efeitos principais altamente significativos do sexo (F(1,16) = 201,7, P < 0,0001) e da temperatura de criação (F(1,16) = 72,60, P < 0,0001) no desempenho na escalada. No entanto, o principal efeito do genótipo não foi significativo (F(1,16) = 0,59, P = 0,4545). Esses resultados indicam que o desempenho locomotor varia dependendo das condições experimentais e pode diferir entre grupos de forma dependendo do contexto.

Figura 5. Comparação da capacidade de escalada de Drosophila em diferentes temperaturas. Quantificação do desempenho de escalada em 22 °C (A) e 25 °C (B) e estatísticas para indivíduos com distância de escalada > 15 cm (C). ** P < 0,01. n=3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Medição do peso corporal
O peso corporal foi medido em moscas da fruta heterozigotas W¹¹¹⁸ e Ent2*/CyO em 22 °C e 25 °C (Figura 6). Nossos resultados mostram que, comparado com ^{w 1118} moscas, o peso dos heterozigotos Ent2*/CyO foi significativamente reduzido tanto em 22 °C quanto em 25 °C (P < 0,05 ou P < 0,01). Observamos que o peso dos machos w¹¹¹⁸ moscas era significativamente menor do que o das fêmeas ^{w 1118} moscas (P < 0,01). Da mesma forma, o peso dos heterozigotos masculinos Ent2*/CyO foi significativamente menor do que o das heterozigotas Ent2*/CyO femininas (P < 0,01). Realizamos uma ANOVA tripla para avaliar os efeitos independentes e interativos do genótipo, temperatura de criação e sexo no peso corporal em Drosophila. A análise mostrou efeitos principais significativos do genótipo (F(1,16) = 32,38, P < 0,0001), temperatura (F(1,16) = 23,31, P = 0,0002) e sexo (F(1,16) = 25,52, P = 0,0001) (Figura 6; Tabela 3). Além disso, houve uma interação significativa bidirecional entre temperatura e sexo (F(1,16) = 24,76, P = 0,0001), indicando que o efeito da temperatura sobre o peso corporal variava conforme o sexo. No entanto, não foram encontradas interações significativas entre genótipo e temperatura (F(1,16) = 0,40, P = 0,538), genótipo e sexo (F(1,16) = 1,31, P = 0,269), ou a interação tripla (genótipo x temperatura x sexo: F(1,16) = 0,48, P = 0,497), sugerindo que a resposta dos mutantes Ent2*/CyO à temperatura e ao sexo foi semelhante à do tipo selvagem.

Dada a temperatura significativa × interação sexual, realizamos uma análise simples de efeitos para esclarecer seu padrão específico. Os resultados mostraram que, em fêmeas, indivíduos criados a 22 °C apresentavam peso corporal significativamente maior do que aqueles criados a 25 °C (P = 0,00²); no entanto, nos machos, não houve diferença significativa no peso corporal entre as duas temperaturas (P > 0,9999). Isso indica que baixar a temperatura de 25–22 °C aumentou especificamente o peso corporal das fêmeas, sem ter efeito significativo nos machos.

Embora não houvesse interações significativas entre o genótipo e outros fatores, o forte efeito principal do genótipo indicou que os mutantes Ent2*/CyO apresentavam geralmente menor peso corporal em todas as condições em comparação com o tipo selvagem. Comparações pós-hoc revelaram ainda que, a 22 °C, as fêmeas do tipo selvagem (w¹¹¹⁸:22 °C Fêmeas) tinham peso corporal significativamente maior do que todos os grupos mutantes (P < 0,0001), e dentro da mesma temperatura, ambos os genótipos apresentaram dimorfismo sexual significativo (fêmeas > machos, P < 0,01). A 25 °C, a diferença de peso corporal entre o tipo selvagem e os mutantes mostrou uma tendência semelhante, mas não atingiu significância estatística. Esses achados descrevem as características do peso corporal da linhagem mutante sob diferentes condições ambientais e biológicas.

Figura 6. A comparação do peso corporal em Drosophila em diferentes temperaturas. Medições de peso corporal em 22 °C e 25 °C. ^ns P > 0,05, * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Atividade enzimática antioxidante
As atividades enzimáticas antioxidantes de W¹¹¹⁸ e Ent2*/CyO heterozigotas Drosophila foram comparadas a 25 °C (Figura 7). Nossos resultados mostraram que, comparados com ^{w 1118} moscas, tanto machos quanto fêmeas heterozigotos Ent2*/CyO apresentaram atividades significativamente reduzidas de catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) (P < 0,01). Também descobrimos que as atividades de CAT e SOD em W¹¹¹⁸ machos foram significativamente maiores do que as do W¹¹¹⁸ fêmeas (P < 0,05 ou P < 0,01). De forma semelhante, as atividades enzimáticas antioxidantes em homens heterozigotos Ent2*/CyO foram significativamente maiores do que em mulheres heterozigotas Ent2*/CyO (P < 0,01).

Figura 7. A comparação da capacidade antioxidante de Drosophila na temperatura ideal de alimentação. Ensaios de atividade enzimática mostrando atividade CAT (A) e SOD (B) em moscas Ent2/CyO em comparação com as moscas^{W 1118} . * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valor P
Genótipo	0.8026	1	0.8026	F (1, 16) = 230,1	P<0,0001
Temperatura	0.06803	1	0.06803	F (1, 16) = 19,50	P=0,0004
Gênero	0.5822	1	0.5822	F (1, 16) = 166,9	P<0,0001
Genótipo x Temperatura	0.005798	1	0.005798	F (1, 16) = 1,662	P=0,2156
Genótipo x Gênero	0.05218	1	0.05218	F (1, 16) = 14,96	P=0,0014
Temperatura x Gênero	0.01323	1	0.01323	F (1, 16) = 3,793	P=0,0692
Genótipo x Temperatura x Gênero	0.02173	1	0.02173	F (1, 16) = 6,231	P=0,0239
Residual	0.05581	16	0.003488

Tabela 1: Análise de Variância das Medições de Comprimento Corporal em Drosophila.

Tabela ANOVA	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valor P
Gênero	0.1483	1	0.1483	F (1, 16) = 201,7	P<0,0001
Genótipo	0.0004319	1	0.0004319	F (1, 16) = 0,5877	P=0,4545
Temperatura	0.05336	1	0.05336	F (1, 16) = 72,60	P<0,0001
Genótipo x Gênero	0.01418	1	0.01418	F (1, 16) = 19,30	P=0,0005
Gênero x Temperatura	0.007134	1	0.007134	F (1, 16) = 9,708	P=0,0067
Genótipo x Temperatura	0.0135	1	0.0135	F (1, 16) = 18,37	P=0,0006
Gênero x Genótipo x Temperatura	0.005903	1	0.005903	F (1, 16) = 8,032	P=0,0120
Residual	0.01176	16	0.0007349

Tabela 2: Análise de Variância da Habilidade de Escalada (> 15 cm) em Drosophila.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valor P
Genótipo	4.363E-07	1	4.363E-07	F (1, 16) = 32,38	P<0,0001
Temperatura	3.141E-07	1	3.141E-07	F (1, 16) = 23,31	P=0,0002
Gênero	3.439E-07	1	3.439E-07	F (1, 16) = 25,52	P=0,0001
Genótipo x Temperatura	5.333E-09	1	5.333E-09	F (1, 16) = 0,3958	P=0,5381
Genótipo x Gênero	1.765E-08	1	1.765E-08	F (1, 16) = 1,310	P=0,2692
Temperatura x Gênero	3.336E-07	1	3.336E-07	F (1, 16) = 24,76	P=0,0001
Genótipo x Temperatura x Gênero	6.513E-09	1	6.513E-09	F (1, 16) = 0,4834	P=0,4968
Residual	2.156E-07	16	1.347E-08

Tabela 3: Análise de Variância das Medições de Peso Corporal em Drosophila.

Discussão

Otorrinolaringo (a) é uma proteína conservada evolutivamente que influencia múltiplos processos biológicos³⁸. Quando expresso em ovocitos de Xenopus laevis, Ent2 apresenta atividade de transporte de^{nucleósidos 8}. Estudos demonstraram que o mutante homozigótico de Ent2 é letal durante o estágio larval tardio ou início da^{pupa 10}. No presente estudo, foi estabelecido um fluxo de trabalho de edição genômica baseado em CRISPR/Cas9 para gerar alelos direcionados a Ent2 em Drosophila melanogaster. A letalidade observada de mutantes homozigóticos durante o estabelecimento da cepa é consistente com esses relatos anteriores, apoiando a validade da estratégia de edição do genoma. Dentro desse contexto, a linha heterozigota Ent2*/CyO gerada neste estudo fornece um modelo para documentar características fenotípicas associadas à perda parcial de Ent2. Sob as condições experimentais testadas, foram observadas diferenças no tamanho corporal, peso corporal, atividade locomotora e níveis de enzimas antioxidantes entre as moscas Ent2*/CyO e w¹¹¹⁸ . Essas observações descrevem o perfil fenotípico da linha mutante estabelecida.

Em termos de desenvolvimento e tamanho corporal, indivíduos heterozigotos Ent2*/CyO foram significativamente menores do que as^{moscas W 1118} , tanto a 22 °C quanto a 25 °C. Essa diferença pode ser atribuída à redução da eficiência do transporte de nucleósidos resultante da ausência do gene Ent2, o que, por sua vez, afeta a estabilidade do metabolismo energético e a regulação da ecdisona. Além disso, os efeitos negativos ficaram mais acentuados a 25 °C. Pesquisas indicam que a expectativa de vida animal é influenciada pela taxa metabólica, um conceito conhecido como teoria da taxa^{metabólica 19}. Os achados deste estudo sugerem que a taxa metabólica elevada das moscas-das-frutas em temperaturas mais altas pode estar intimamente associada às deficiências nutricionais e atrasos no desenvolvimento resultantes do metabolismo dos nucleósidos comprometido. No entanto, dado o uso de um único alelo derivado do CRISPR, esses achados devem ser interpretados como observações descritivas, e não como evidências diretas da função gênica.

Variações dependentes da temperatura também foram evidentes em múltiplas leituras fenotípicas. O mutante apresenta uma extensão modesta da expectativa de vida a 22 °C, especialmente em mulheres, um achado consistente com estudos^{anteriores 39,40}. Em contraste, a 25 °C, a diferença de vida útil diminui ou até desaparece. Como organismos poiquilotérmicos, as moscas-das-frutas apresentam uma taxa metabólica maior e, consequentemente, uma vida mais curta em temperaturas^{elevadas 41,42}, o que está alinhado com os achados deste estudo. Nesse contexto, os padrões observados podem refletir respostas fisiológicas gerais à temperatura.

O desempenho locomotor e as atividades enzimáticas antioxidantes também variaram entre genótipos, sexos e condições de temperatura. Desempenho reduzido na escalada e atividades mais baixas de SOD e CAT foram observadas em moscas Ent2/CyO sob certas condições. Estudos anteriores relacionaram transportadores de nucleósidos ao metabolismo do NAD⁺, função mitocondrial e regulação do estresse^oxidativo 17,43,44,45,46,47. Embora esses relatos forneçam um possível contexto biológico, os dados atuais se limitam à caracterização fenotípica e não estabelecem ligações mecanicistas entre a Ent2 e essas vias.

Nossos resultados também mostram que, sob as mesmas condições, os machos geralmente apresentam maior atividade enzimática antioxidante do que as fêmeas^39,48. Isso significa que fatores relacionados ao gênero podem regular a resposta antioxidante por meio de diferentes vias de sinalização. Fatores de transcrição relacionados às respostas antioxidantes, como Nrf2/CncC e seus genes-alvo posteriores, mostram diferenças de expressão entre diferentes gêneros, afetando assim a capacidade antioxidante^{total 49}. Essa observação é consistente com relatos de diferenças sexuais na resistência ao estresse oxidativo e nas defesas antioxidantes em Drosophila, onde as mulheres normalmente mantêm níveis mais baixos de ROS e atividades enzimáticas antioxidantes mais altas em relação aos machos, o que pode contribuir para diferenças na resistência ao estresse e longevidade entre os^sexos. Essas observações destacam ainda mais a importância de considerar variáveis biológicas como o sexo ao caracterizar fenótipos mutantes.

Do ponto de vista metodológico, este estudo delineia um fluxo de trabalho reproduzível para gerar e validar mutações mediadas por CRISPR/Cas9 em Drosophila. O design e a seleção precisos do gRNA são essenciais, pois gRNAs eficazes determinam a eficiência da clivagem alvo pelo Cas9 e minimizam modificações não^{intencionais 21,51}. Microinjeção de alta precisão de componentes de Cas9 e gRNA em embriões também é crucial, pois injeções ineficientes podem levar a baixas taxas de edição ou mosaicismo⁵². Uma confirmação completa do genótipo por meio do sequenciamento garante que as edições pretendidas estejam presentes e exclui edições fora do alvo ou incompletas, fortalecendo assim a integridade do modelo⁵³. Notavelmente, o uso do cromossomo balanceador CyO foi essencial para manter o alelo mutante Ent2 devido à letalidade dos mutantes homozigóticos. Essa abordagem é amplamente utilizada na genética de Drosophila para preservar mutações deletérias e permitir análises posteriores. O presente estudo demonstra a aplicação prática dessa estratégia dentro de um framework de edição CRISPR/Cas9.

Várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiro, análises fenotípicas foram realizadas usando uma única linha mutante derivada do CRISPR. É amplamente reconhecido que a edição CRISPR/Cas9 pode gerar alelos heterogêneos, e a análise de múltiplas linhas independentes é geralmente recomendada para fortalecer conclusões genéticas. Portanto, os achados aqui relatados devem ser interpretados como caracterização preliminar de um alelo mutante. Estudos futuros que incorporem alelos Ent2 gerados de forma independente serão necessários para melhorar a robustez das conclusões. Segundo, a linha mutante foi mantida usando o cromossomo balanceador CyO, enquanto o grupo controle (w¹¹¹⁸) não possui um cromossomo balanceador. Como os cromossomos balanceadores podem influenciar características do desenvolvimento e fisiológicas, a ausência de um controle com balancer corresponde representa uma fonte potencial de confusão. Essa limitação deve ser levada em conta ao interpretar diferenças fenotípicas entre genótipos. Terceiro, condições ambientais como umidade, ciclo de luz e dieta foram mantidas em ambientes laboratoriais padrão, mas não foram sistematicamente variadas. Como esses fatores podem influenciar o metabolismo e as respostas ao estresse, estudos futuros incorporando gradientes ambientais controlados forneceriam uma avaliação mais abrangente das interações fenótipo-ambiente.

Em resumo, este estudo estabelece um fluxo de trabalho baseado em CRISPR/Cas9 para gerar e manter alelos mutantes Ent2 em Drosophila melanogaster e fornece uma caracterização descritiva da linha heterozigota resultante sob diferentes condições ambientais. Os resultados destacam a aplicabilidade dessa abordagem para o estudo de genes com fenótipos letais e ressaltam a importância das considerações no desenho experimental, incluindo o fundo genético, os cromossomos balanceadores e as variáveis ambientais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ammonium acetate	Sigma	A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Dodecyl sulfate	Sigma	L3771
Injection device	Eppendorf FemtoJet	4i
Linearized plasmid: MLM3613	Addgene	42251
Microscope	OLYMPUS	CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kit	Thermo Fisher	AM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1344
PmeI restriction enzyme	NEB	R0560S
Poly(A) polymerase	NEB	M0276S
Protease K	Thermo Fisher	EO0491
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
T7 RiboMAX Kit	Promega	P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-1
w1118 Drosophila	Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroform	Sigma	P2069