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Artigo de método

Estabelecimento de organoides tumorais, fibroblastos associados ao carcinoma e fibroblastos equivalentes do mesmo paciente com câncer de esôfago

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DOI:

10.3791/69548

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3 de abril de 2026

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1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para isolar simultaneamente organoides cancerígenos, fibroblastos associados ao carcinoma (CAFs) e fibroblastos (CFs) não associados a tumores do mesmo paciente com carcinoma de células escamosas esofágicas (ESCC). O uso desses materiais combinados com pacientes poderia evitar problemas de variabilidade entre pacientes e fornecer uma plataforma experimental adequada para pesquisas em ESCC.

Resumo

No carcinoma de células escamosas esofágicas (CCE), a aquisição da resistência ao tratamento e a recidiva tumoral continuam sendo grandes desafios clínicos. Fibroblastos associados ao carcinoma (CAFs), componentes-chave do microambiente tumoral, são conhecidos por influenciar a progressão da CCE e a resposta terapêutica. No entanto, muitos aspectos do papel dos CAFs na malignidade tumoral permanecem desconhecidos, presumivelmente devido à variabilidade entre pacientes em ESCC. Acredita-se que várias linhas celulares de ESCC humanas disponíveis para pesquisa imitem parcialmente a natureza do carcinoma humano. Eles também são propagados in vitro por anos e décadas em uma placa de Petri, resultando na adaptação às condições da cultura. Além disso, as linhagens celulares humanas de CCES apresentam várias alterações genéticas e epigenéticas distintas entre os pacientes originais, resultando em variabilidade entre pacientes. No entanto, linhas celulares cancerígenas cultivadas de longo prazo foram empregadas na maioria dos estudos anteriores para experimentação com CAFs descompatíveis com pacientes. A variabilidade entre pacientes dentro de cada linhagem celular cancerígena e entre células cancerígenas e CAFs pode, portanto, causar redução da reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados. Para eliminar a variabilidade entre pacientes, três tipos celulares distintos foram isolados do mesmo paciente: organoides cancerígenos e CAFs de uma região de ESCC dissecada cirurgicamente, e fibroblastos (CFs) equivalentes de uma região não tumoral adjacente como controles específicos de pacientes para CAFs. Um protocolo detalhado é apresentado que permite o isolamento simultâneo de organoides cancerígenos, CAFs e CFs. Os organoides cancerígenos cresceram bem sob condições tridimensionais. CAFs e CFs coloriram positivamente vimentina, um dos marcadores fibroblastos, apoiando o enriquecimento dessas células em linhagens fibroblásticas. O protocolo descrito nos permite estabelecer organoides ESCC e fibroblastos pareados com pacientes, fornecendo uma plataforma experimental valiosa que exclui a variabilidade entre pacientes no estudo das interações tumor-estromais.

Introdução

O câncer de esôfago está associado a altas taxas de incidência e mortalidade em todoo mundo. Ele é amplamente classificado em dois principais subtipos histológicos: carcinoma de células escamosas esofágicas (ESCC) e adenocarcinoma esofágico (EAC)2. O ESCC é mais prevalente que o EAC, com uma incidência particularmente maior no Leste Asiático ena África 3. As estratégias de tratamento para CCES são relativamente bemestabelecidas 4,5. Para lesões em estágio inicial confinadas à camada mucosa, a resseção endoscópica é indicada como uma opção curativa e minimamente invasiva. Em pacientes com doença localmente avançada, porém ressecável, a combinação de quimiorradioterapia neoadjuvante seguida de esofagectomia demonstrou eficácia clínica. Para casos não ressecáveis ou metastáticos, a quimioterapia sistêmica continua sendo a base do tratamento. No entanto, a resistência terapêutica e a recorrência da doença continuam a apresentar grandes desafios clínicos.

Os tumores consistem não apenas em células cancerígenas, mas também em um microambiente tumoral complexo que compreende vários tipos de células estromais (células estromais e selvagens). Entre eles, fibroblastos associados ao carcinoma (CAFs), componentes celulares principais do microambiente tumoral, demonstraram desempenhar papéis críticos na progressão tumoral e na respostaterapêutica 6,7,8,9. Na ESCC, o envolvimento dos CAFs em malignidade tumoral e resistência ao tratamento também tem sido cada vez maisrelatado 10, 11, 12. No entanto, os mecanismos moleculares precisos dos CAFs subjacentes à malignidade ESCC permanecem em grande parte incertos.

Na maioria dos estudos anteriores, os efeitos das CAFs sobre células cancerígenas foram avaliados usando várias linhagens celulares de CCES propagadas em placas de Petri por muitos anos, ou até décadas. Tais linhagens celulares se adaptariam às condições de cultura e pouco se assemelhariam aos tumoresoriginais 13. Além disso, as linhagens celulares de ESCC são derivadas de diferentes pacientes e possuem várias alterações genéticas e epigenéticas, que são evidentemente distintas nas respectivas células ESCC, atuando como variáveis entre pacientes. Resultados experimentais de uma linhagem celular cancerígena podem frequentemente ser inconsistentes com os de outra linhagem celular. Portanto, experimentos que utilizam diferentes linhas celulares de ESCC e os CAFs inadequados pelo paciente podem resultar em dificuldade em abordar com precisão as interações dessas células de maneira reprodutível e confiável.

Para abordar essas limitações, foi desenvolvido um protocolo para isolar simultaneamente organoides tumorais compatíveis com o paciente, CAFs e fibroblastos (CFs) equivalentes não tumorais a partir do mesmo espécime cirúrgico de CCE. Organoides derivados do paciente geralmente recapitulam características arquitetônicas e fenotípicas chave dos tumores primários, preservando a heterogeneidade molecular. Os organoides estabelecidos formaram esferoides sob condições de cultura tridimensional (3D) e demonstraram capacidade proliferativa estável. Tanto CAFs quanto CFs foram confirmados como enriquecidos para populações de células fibroblásticas positivas para vimentina, um marcador fibroblasto.

Este protocolo fornece etapas detalhadas e reprodutíveis para processamento de tecidos, dissociação enzimática, semeadura de organoides, isolamento de CAF/CF, passagem e criopreservação. Para ajudar os pesquisadores a avaliar a aplicabilidade antes da implementação, informações práticas foram incluídas: organoides normalmente se formam em 3–5 dias, atingem a prontidão para passagem em 7–10 dias e podem ser estabilidademente expandidos por mais de dez trechos. CAFs e CFs podem ser aprovados por pelo menos oito gerações. Organoides e fibroblastos podem ser criopreservados em aproximadamente 20 dias. As taxas de sucesso dos estabelecimentos chegam a aproximadamente 70% para organoides e 80% para CAFs e CFs. Além disso, um ensaio validado em meio condicionado usando meio condicionado por CAF ou CF está incluído, fornecendo uma abordagem robusta para avaliar os efeitos paracrinos das células estromais no comportamento dos organoides tumorais. Coletivamente, essa plataforma organoide–estroma tumoral compatível oferece um modelo experimentalmente acessível e biologicamente relevante para investigar as interações tumor–estromais da ESCC e apoiar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de precisão.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo tecido humano devem ser realizados sob aprovações apropriadas de biossegurança institucional e em um gabinete certificado de segurança biológica. O paciente forneceu consentimento informado por escrito, e o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade Juntendo. Uma visão geral do procedimento dos protocolos 2 a 6 é mostrada na Figura 1. A composição e concentrações de cada componente no meio organoide (Eso_v1) do ESCC foram determinadas com base em Kijima et al.14 e outrosestudos 15,16,17, com apenas pequenas modificações. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Reagentes e preparação de tecidos

  1. Prepare reagentes e equipamentos.
    1. Esterilize todos os instrumentos, incluindo tesouras, pinças e pipetas, antes de iniciar o procedimento.
    2. Prepare 10 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) em um tubo de 15 mL.
    3. Prepare tubos de baixa fixação de 15 mL e identifique-os de acordo com a origem da amostra (por exemplo, Tubo de Lavagem Tumoral (A), Tubo de Digestão Tumoral (B), Tubo de Lavagem Não Tumoral (C), Tubo de Digestão Não Tumoral (D)).
    4. Revestir as pipetas funcionando aspirando e dispensando soro bovino fetal (FBS) 2–3 vezes para reduzir a adesão celular durante o processamento.
      NOTA: O revestimento FBS impede que fragmentos de tecido aderam às superfícies plásticas durante a dissociação mecânica.
  2. Prepare soluções enzimáticas
    1. Prepare a Solução Enzimática I para digestão tumoral misturando 2,7 mL do Meio de Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco com 10% de FBS e 1x penicilina–estreptomicina (PS) (doravante, DMEM/10% FBS), 0,3 mL de colagnase de 10 mg/mL, 0,15 mL de dispase de 10.000 PU/mL e 0,03 mL de 2,5 μg/mL de Anfotericina B. Aqueça até 37 °C.
    2. Prepare a Solução Enzimática II para digestão não tumoral misturando 2,7 mL de DMEM/10% FBS, 0,3 mL de 1 mg/mL de colagênase e 0,03 mL de 2,5 μg/mL de Anfotericina B. Aqueça até 37 °C.
      NOTA: Colagenase e dispase facilitam a dissociação do tecido tumoral.
  3. Prepare o meio de cultura organoide
    1. Prepare meio organoide ESCC (meio Eso_v1) contendo 60% de meio organoide basal, 40% de meio condicionadoL-WRN 18 (ver passo 1.4), 50 ng/mL de EGF (fator de crescimento), 1 mM de N-acetil-L-cisteína (antioxidante), 5 mM de nicotinamida (vitamina solúvel em água), 500 nM A83-01 (inibidor de TGF-βR (prevenindo o crescimento de fibroblastos)), 1x B-27 (suplemento de cultura sem soro), 1x N-2 (suplemento de cultura sem soro) e 10 μM Y-27632 (inibidor de ROCK).
    2. Equilibre o meio a 37 °C antes do uso.
      NOTA: Meio condicionado a L-WRN (Sobrenadante de células L-WRN) fornece sinais de WNT, R-spondin e Noggin essenciais para a iniciação dos organoides. Y27632 está contido no meio durante todo o período cultural.
  4. Prepare um meio condicionado L-WRN
    1. Descongele um frasco de células L-WRN e seme-as em uma placa de 100 mm com 10 mL de DMEM/FBS a 10% e cultive por 1–2 dias.
    2. Substitua o meio por 10 mL de DMEM/10% FBS contendo G418 (500 μg/mL final) e Higromicina B (500 μg/mL final), e cultive até que as células atinjam 80% de confluência.
    3. Passe as células para dois pratos de 100 mm com 10 mL de DMEM/10% FBS (com G418 e Higromicina B) e cultive até que as células atinjam 100% de confluência.
    4. Passar as células para cinco pratos de 150 mm com 20 mL de DMEM/10% FBS (sem antibióticos) por recipiente e cultivar até 100% de confluência.
    5. Aspire e descarte o meio de cada recipiente de 150 mm.
    6. Adicione 25 mL por recipiente do meio coletor (meio basal organoide suplementado com 5% de FBS).
    7. Incubar por 24 horas.
    8. Recolha o meio de todos os cinco pratos (25 mL × 5 = 125 mL) em uma garrafa de vidro estéril.
    9. Repita os passos 1.4.6–1.4.8 para um total de 8 coleções (volume alvo agrupado: ~1.000 mL).
    10. Filtre estéril o CM agrupado usando um filtro de tampa de garrafa.
    11. Aliquota 40 mL em 25 tubos estéreis de 50 mL.
    12. Armazene as aliquotas a −80 °C.
  5. Prepare o meio de cultura de fibroblastos
    1. Prepare o fibroblasto médio-1.
    2. Equilibre o meio a 37 °C antes do uso.
  6. Prepare as placas para manuseio de lenços
    1. Dispense várias gotas (de três a cinco) de FBS com uma ponta P1000 em dois pratos de 100 mm para criar um revestimento (Recipiente T para tecido tumoral, Recipiente N para tecido não tumoral).
      NOTA: O revestimento FBS promove uma moção mecânica mais suave e previne a aderência de pequenos fragmentos de tecido à superfície do prato.
  7. Manuseio de tecidos e identificação de amostras
    1. Confirme que amostras tumorais e não tumorais são transportadas no gelo.
    2. Coloque os lenços em uma panela de 60 mm contendo uma pequena quantidade de DMEM/10% de FBS e guarde no gelo até o uso. Inicie o processamento dentro de 16 horas após a resseção cirúrgica para manter a viabilidade.
    3. Identifique o tecido tumoral por sua textura firme e morfologia superficial irregular, que diferem das do tecido não tumoral.

2. Processamento de tecidos, lavagem e digestão enzimática

NOTA: Esta etapa é realizada para digerir seções de tecido de tumor e não tumorais com diferentes soluções enzimáticas.

  1. Corte o tumor e os tecidos não tumorais
    1. Transfira cada amostra de tecido (aproximadamente 5 mm × 5 mm) para seu respectivo prato revestido com FBS (Recipiente T para tecido tumoral e Recipiente N para tecido não tumoral).
    2. Triture cada tecido em fragmentos de ~0,5 mm usando um bisturi estéril.
      NOTA: Fragmentos menores aumentam o acesso enzimático e melhoram a eficiência digestiva.
  2. Lave o papel picado.
    1. Cubra uma pipeta de 10 mL com FBS para evitar a aderência do tecido.
    2. Adicione 5 mL de PBS em cada recipiente usando a pipeta revestida com FBS e resspense suavemente o papel picado.
    3. Transfira a suspensão para o tubo de lavagem tumoral correspondente (Tubo A) ou tubo de lavagem não tumoral (tubo C).
    4. Repita os passos 2.2.2 e 2.2.3 (volume total: 10 mL).
    5. Deixe os tubos em repouso por 2 minutos em temperatura ambiente; remova o sobrenadante, deixando aproximadamente 0,5–1 mL de PBS e tecido na parte inferior.
    6. Adicione 10 mL de PBS fresco com uma nova pipeta; Após revestir a pipeta com FBS, pipete a suspensão com força evitando a formação de bolhas.
      NOTA: A pipeteação forçada auxilia na dissociação mecânica e na remoção de sangue e muco. Evitar bolhas previne a lise celular induzida por cisalhamento. Todas as etapas de lavagem têm como objetivo remover detritos.
    7. Deixe os tubos em repouso por 2 minutos em temperatura ambiente; remova o sobrenadante, deixando aproximadamente 0,5–1 mL de PBS e tecido na parte inferior.
    8. Repita o procedimento de lavagem (etapas 2.2.6 e 2.2.7) duas vezes, totalizando três lavagens.
  3. Transfira tecidos para tubos de digestão.
    1. Adicione 10 mL de PBS fresco com uma nova pipeta; após revestir a pipeta com FBS, transfira o tecido tumoral para o Tubo de Digestão Tumoral (Tubo B) e o tecido não tumoral para o Tubo de Digestão Não Tumoral (Tubo D).
    2. Deixe os tubos em repouso por 2 minutos em temperatura ambiente, remova o sobrenadante deixando aproximadamente 0,5 mL de PBS e tecido no fundo.
  4. Realize digestão enzimática.
    1. Digestão de tecido tumoral
      1. Adicione todo o volume da Solução Enzimática I (colagênase + dispase) no Tubo de Digestão Tumoral (Tubo B).
      2. Incube a 37 °C por 2 horas com rotação suave.
    2. Digestão de tecido não tumoral
    3. Adicione todo o volume da Solução Enzimática II (apenas colanase) no Tubo de Digestão Não Tumoral (Tubo D).
      1. Incube a 37 °C por 4 horas com rotação suave.
    4. Continue para a etapa 3 (processamento da amostra tumoral) ou para a etapa 6 (semeadura de fibroblastos equivalente), dependendo da origem da amostra.
      NOTA: Os tipos de enzimas usadas para digerir tecidos tumorais e não tumorais, bem como os tempos de processamento, foram determinados com base em otimização experimental prévia. Os tecidos tumorais frequentemente contêm matriz extracelular densa; A dispase em combinação com colagênase aumenta a capacidade digestiva.

3. Processamento de amostras tumorais para organoide e isolamento de CAF

NOTA: Esta etapa é realizada para isolar células tumorais epiteliais para formação de organoides e fibroblastos estromais (CAFs) a partir das mesmas amostras tumorais digeridas.

  1. Filtrar e coletar células derivadas de tumores.
    1. Coloque um filtro de célula de 100 μm em um tubo cônico de 50 mL.
    2. Pré-molhe o penador passando 3 mL de DMEM/10% FBS por ele.
      NOTA: A pré-umedição reduz a perda celular ao evitar a aderência às fibras secas da malha.
    3. Transfira todo o conteúdo do Tubo de Digestão Tumoral (Tubo B) para o peneiro usando uma ponta P1000 revestida com FBS para remover fragmentos de tecido não digeridos.
    4. Adicione mais 6 mL de DMEM/10% de FBS para enxaguar os cachos residuais através do peneiro.
    5. Remova o filtro e retorne o filtrado ao Tubo B (um novo tubo de baixa fixação de 15 mL também pode ser usado).
  2. Lave e concentre o filtrado.
    1. Centrifuge o tubo a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
    2. Remova o sobrenadante usando uma pipeta descartável.
    3. Adicione 10 mL de DMEM/10% FBS, misture suavemente por inversão e centrifuge novamente a 300 × g por 5 minutos.
    4. Aspire cuidadosamente o sobrenadante enquanto retém o pellet.
    5. Reduza o volume restante para 40 μL usando uma pipeta P200.
  3. Aloque células para organoides e cultura CAF.
    1. Aloque 30 μL para a semeadura de organoides.
    2. Aloque 10 μL para a semeadura de CAF.
      NOTA: Essa proporção fornece empiricamente populações epiteliais e fibroblastas suficientes para expansão paralela.

4. Semeadura de organoides (cultura 3D)

NOTA: Esta etapa é realizada para estabelecer organoides de CCE a partir de uma suspensão celular derivada de tumores.

  1. Prepare cúpulas de matriz de membrana do embasamento.
    1. Pré-aqueça uma placa padrão de 24 poços a 37 °C.
      NOTA: O pré-aquecimento da placa acelera a solidificação das cúpulas da matriz de membrana do basamento.
    2. Misture 30 μL da suspensão derivada do tumor com 90 μL de matriz de membrana basal gelada (razão 1:3).
    3. Aplique 30 μL por cúpula em quatro poços.
    4. Deixe as cúpulas solidificarem por 15 minutos em uma incubadora de CO₂.
  2. Adicionar meio de cultura organoide
    1. Prepare um meio organoide com suplementos pré-misturados (FGF10, SB202190 e antibióticos, como 1× Anfotericina B e 100 μg/mL Primocina, se utilizados).
      NOTA: Bem 1: Eso_v1; Poço 2: Eso_v1 + 10 μM SB202190; Poço 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; Poço 4: Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (concentrações finais).
    2. Adicione suavemente 1 mL de médio em cada poço ao longo da parede.
    3. Incubar sob condições padrão de cultura de CO₂.
    4. Troque o médio a cada 3 a 5 dias.
      NOTA: Pré-misturar os suplementos evita a necessidade de pipetar pequenos volumes diretamente sobre frágeis cúpulas da matriz de membrana do base. Os antibióticos são adicionados apenas nos primeiros 6 dias após o estabelecimento do organoide. As condições de cultura (FGF10 +/-, SB202190 +/-) são determinadas com base na taxa de crescimento e morfologia (preferencialmente esférica).
  3. Monitore a formação dos organoides.
    1. Observe as cúpulas diariamente usando um microscópio invertido.
      NOTA: Morfologia esperada: Dia 3–5 → esferoides visíveis; Dias 7–10 → esferoides densos prontos para a passagem.
    2. Faça passagem dos organoides quando atingirem um tamanho aproximado de 100–200 μm ou mostre um amontoamento na cúpula de 90% ou mais.

5. Classificação da CAF

NOTA: Esta etapa é realizada para estabelecer CAFs a partir de uma suspensão celular derivada de tumores.

  1. Semeie os CAFs em um prato revestido com colágeno.
    1. Prepare um recipiente de 60 mm revestido com colágeno, contendo 1,5 mL de fibroblasto médio-1.
    2. Adicione 10 μL do filtrado tumoral alocado para a semeadura do CAF.
    3. Adicione antibióticos como 1× Anfotericina B e 100 μg/mL de Primocina.
    4. Incubar sob condições padrão de cultura de CO₂.
    5. Troque o médio a cada 3 a 5 dias.
      NOTA: Empiricamente, o meio de fibroblastos-1 é frequentemente mais adequado do que outros meios para o estabelecimento e crescimento inicial de CAFs e FQ. Antibióticos são adicionados apenas durante os primeiros 6 dias.
  2. Monitorar o crescimento da CAF
    1. Monitore a aparência da morfologia do fuso semelhante a fibroblastos a partir dos dias 3–5.
    2. Fibroblastos de passagem em confluência de 90%–100%.
      NOTA: Se ocorrer contaminação por células epiteliais, os fibroblastos podem ser isolados seletivamente ajustando a duração da tripsinização, pois os fibroblastos se destacam mais rapidamente do que as células epiteliais durante a passagem.

6. Classificação de CF

NOTA: Esta etapa é realizada para obter FCs pareadas com pacientes a partir de tecido adjacente não tumoral.

  1. Lave e prepare a digestão não tumoral.
    1. Centrifuge o Tubo de Digestão Não Tumoral (Tubo D) a 300 × g por 5 minutos.
    2. Remova o sobrenadante usando uma pipeta descartável.
    3. Adicione 10 mL de DMEM/10% FBS, misture suavemente por inversão e centrifuge novamente a 300 × g por 5 minutos.
    4. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, mantendo a bola.
    5. Repita os passos 6.1.3 e 6.1.4 mais uma vez.
  2. Semeie CFs em um recipiente revestido de colágeno
    1. Transfira toda a suspensão para um prato de 60 mm revestido com colágeno, contendo 1,5 mL de meio fibroblasto-1.
    2. Adicione antibióticos como 1× Anfotericina B e 100 μg/mL de Primocina.
    3. Incubar sob condições padrão de cultura de CO₂.
    4. Troque o médio a cada 3 a 5 dias.
      NOTA: Os antibióticos são adicionados apenas nos primeiros 6 dias.
  3. Monitore o crescimento da FQ.
    1. Observe a morfologia do fuso semelhante a fibroblastos a partir de 3 a 5 dias.
    2. Fibroblastos de passagem em confluência de 90%–100%.

7. Passagem organoide e criopreservação

  1. Passagem organoide.
    NOTA: O objetivo desta etapa é expandir os organoides assim que atingem uma densidade apropriada.
    1. Aspire o meio antigo e lave cada poço com 1 mL de PBS.
    2. Adicione 0,5 mL de tripsina pré-aquecida para organoide em cada poço.
    3. Pipete vigorosamente com uma ponta P1000, usando a borda da ponta para desestabilizar a cúpula da matriz de membrana do basamento.
      NOTA: O cisalhamento mecânico ajuda a quebrar a densa matriz de membrana basal, melhorando o acesso enzimático.
    4. Incube por 10–15 minutos em uma incubadora de CO₂ até que todos os grumos de gel se dissolvam. Dissociar organoides em 20–50 aglomerados celulares.
      NOTA: Evite a dissociação total de célula única, pois ela reduz a viabilidade.
    5. Recolha a suspensão em um tubo de 15 mL de baixa fixação.
    6. Enxágue o poço quatro vezes com 0,5 mL de DMEM/10% FBS e transfira todos os enxágues para o mesmo tubo de baixa fixação.
    7. Centrifuge o tubo a 300 × g por 5 minutos.
    8. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em DMEM mínimo/10% FBS; ajuste o volume da suspensão para 80 μL.
    9. Misture 80 μL da suspensão organoide com 240 μL de matriz de membrana basal gelada (razão 1:3).
    10. Coloque a mistura em uma placa pré-aquecida de 6 poços (37 °C), com 4 a 6 cúpulas por poço.
    11. Deixe as cúpulas solidificarem por 15 minutos, depois adicione 3 mL de meio Eso_v1 (a composição que era ótima na cultura inicial no passo 4.2) por poço.
    12. Troque o médio a cada 3 a 5 dias.
      NOTA: Os organoides são travessados quando atingem um diâmetro de aproximadamente 100–200 μm ou quando a apinhamento das cúpulas ultrapassa 90%. A contagem celular não é realizada. Para subculturas rotineiras, os organoides são divididos em uma proporção de 1:4 a 1:10. A rápida reformação dos esferoides é esperada dentro de 48–72 horas.
  2. Criopreservação organoide
    1. Lave cada poço com 3 mL de PBS.
    2. Adicione 1,5 mL de tripsina para organoide em cada poço, pipete vigorosamente e incube por 10 minutos.
    3. Recolha toda a suspensão em um tubo de 15 mL de baixa fixação e enxágue o poço quatro vezes.
    4. Centrifuge o tubo a 300 × g por 5 minutos e remova o sobrenadante.
    5. Resuspenda o pellet em 2 mL de 90% FBS/10% DMSO.
    6. Aliquota 0,5 mL em cada criovial.
    7. Coloque frascos em um recipiente congelante e armazene a −80 °C durante a noite.
    8. Transfira frascos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
      NOTA: Os organoides são repovoados quando atingem um diâmetro de aproximadamente 100–200 μm ou quando a apinhamento das cúpulas ultrapassa 90%.
  3. Recuperação de organoides congelados
    1. Descongele rapidamente o cryovial em um banho-maria a 37 °C.
    2. Transfira o conteúdo para 5 mL de DMEM/10% FBS em um tubo de 15 mL.
    3. Centrifuge o tubo a 300 × g por 5 minutos.
    4. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 40–60 μL de DMEM/10% FBS.
    5. Misture a suspensão com matriz de membrana basal gelada na proporção 1:3.
    6. Coloque a mistura em uma placa pré-aquecida de 6 poços (37 °C) como 4–6 domos por poço.
    7. Deixe as cúpulas solidificarem por 15 minutos, depois adicione 3 mL de meio Eso_v1 (a composição que era ótima na cultura inicial no passo 4.2) por poço.

8. Passagem de fibroblastos e criopreservação

  1. CAFs e CFs de passagem
    NOTA: O objetivo desta etapa é expandir os fibroblastos assim que atingem uma densidade adequada.
    1. Lave a taça com 2 mL de PBS.
    2. Adicione 0,4 mL de 0,25% de tripsina.
    3. Incube por 5 minutos em uma incubadora de CO₂, monitorando o descolamento ao microscópio.
    4. Neutralize a tripsina com DMEM/FBS a 10% e transfira toda a suspensão celular para uma antena de 100 mm contendo 10 mL de meio.
      NOTA: Os fibroblastos são travessados quando atingem 90%–100% de confluência. Para subculturas rotineiras, elas são divididas em uma proporção de 1:3. Empiricamente, a proliferação de fibroblastos desacelera ou cessa quando a densidade celular é baixa.
  2. Criopreservação de fibroblastos
    1. Lave as células com 5 mL de PBS.
    2. Adicione 1 mL de tripsina 0,25% e depois incube por 5 minutos em uma incubadora de CO₂.
    3. Neutralize a tripsina com DMEM/10% de FBS e transfira toda a suspensão celular para um tubo de 15 mL.
    4. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos.
    5. Resuspenda o pellet celular em 2 mL de 90% FBS/10% DMSO.
    6. Aliquota 0,5 mL em cada criovial.
    7. Coloque os frascos em um recipiente congelante e armazene a −80 °C durante a noite.
    8. Transfira os frascos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

9. Ensaio médio condicionado

NOTA: O objetivo desta etapa é avaliar os efeitos paracrinos dos fibroblastos nos organoides tumorais de CCE usando meio condicionado (MC). Este ensaio fornece um modelo reprodutível de interação estromal–tumor quando a cocultura direta ainda não está otimizada.

  1. Preparação de meio condicionado CAF/CF
    1. Cultive o mesmo número de CAFs ou CFs em 3 mL de DMEM/10% FBS em antenas de 60 mm até uma confluência de 80%–90%.
    2. Lave as células uma vez com 2 mL de PBS.
    3. Adicione 3 mL de DMEM/2% de FBS.
    4. Incube por 48 horas em uma incubadora de CO₂.
    5. Colete o sobrenadante em um tubo de 15 mL.
    6. Centrifuge a 2000 × g por 5 minutos para remover detritos celulares.
    7. Colete 2,5 mL do sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.
    8. Aliquota o meio condicionado em porções de 100–500 μL e armazene a -80 °C.
  2. Preparação do meio de ensaio organoide
    1. Prepare o meio organoide do ESCC conforme descrito no passo 1.3.
    2. Misture o meio organoide e o meio condicionado em uma proporção 1:1 (50% v/v).
  3. Cultura de organoides cancerides usando o meio de ensaio de organoides.
    1. Após a passagem organoide, conforme descrito no passo 7, organoides de semente em uma única cúpula de matriz de membrana basal de 20 μL por poço em uma placa pré-aquecida de 48 poços (37 °C).
    2. Após a solidificação da cúpula, adicione 0,3 mL de meio de ensaio organoide a cada poço.
    3. Substitua o meio de ensaio organoide a cada 3 a 7 dias.
    4. Avalie a morfologia e o tamanho dos organoides cancerígenos.
      NOTA: Todos os materiais de origem humana são tratados como potencialmente infecciosos. Equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo luvas, máscaras e óculos de proteção, são sempre usados. Colaganose, dispase e dimetil sulfóxido (DMSO) podem causar irritação na pele, nos olhos e nas respirações; portanto, o contato direto e a inalação são evitados. Todos os procedimentos enzimáticos envolvendo tecidos humanos são realizados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança. Resíduos líquidos contendo tecido humano são coletados em recipientes selados para riscos biológicos e autoclavados antes do descarte. Resíduos químicos, incluindo DMSO e soluções enzimáticas, são descartados de acordo com as diretrizes institucionais de resíduos perigosos. Todos os instrumentos reutilizáveis são enxaguados com etanol 70% e autoclavados antes de serem reutilizados.

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Resultados

Amostras de tecido foram obtidas da região tumoral e de uma região adjacente não tumoral localizada a 3 cm do tumor, excisadas cirurgicamente de um paciente com CCE que não havia recebido quimioterapia neoadjuvante. Organoides e CAFs do câncer foram isolados da região tumoral, enquanto as FQ foram isoladas da região não tumoral. Os tecidos cirúrgicos foram triturados em pedaços de aproximadamente 0,5 mm de tamanho (Figura 2A), depois tratados enzimaticamente...

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Discussão

Os relatórios anteriores utilizaram organoides do câncer e CAFs pareados com pacientes para investigar o papel dos CAFs na proliferação e resistência a medicamentos em cânceres de cólon, mama, pâncreas e cabeça e pescoço humanos 20,21,22,23,24. Esses estudos demonstraram que as CAFs influenciam a proliferação e a resistência a...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Prêmio Jovem Investigador da Universidade Juntendo (2024 e 2025) concedido a P. Z. e por Bolsas de Apoio para Pesquisa Científica do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão (23K07362, 21K08693). Gostaríamos de agradecer a todos os membros dos Departamentos de Patologia e Oncologia, e de Cirurgia Esofágica e Gastroenterológica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Antena parabólica de 100 mmTPP93100
100x Penicilina-Estreptomicina (PS)Nacalai26253-84
Tubo de 15 mlFastGeneFG2001
Placa de cultura celular de 24 poçosTPP92024
Placa de cultura celular de 48 poçosTPP92448
Tubo de 50 mlFastGeneFG2004
Antena parabólica de 60 mmTPP93060
Placa de cultura celular de 6 poçosTPP92006
A83-01Cayman9001799
DMEM Avançado/F12 Gibco12634010Meio basal organoide = DMEM avançado/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 anti-mouse IgGInvitrogenA11029
Anfotericina BThermoFisher15290018
Anticorpo anti-Vimentina (V9)Santa CruzSC-62601/500 diluição para uso
B-27ThermoFisher17504044
Filtro de tampa de garrafaSartorius180F15
Filtro celular, 100 & micro; m poreBD Falcon352360
Colagenase, Tipo ISIGMAC0130
Dishe de 60 mm revestido com colágenoIWAKI4010-010
Dimetil Sulfóxido (DMSO)Wako043-07216
Dispase IGODO SHUSEI386-02271
Eagle Médio Modificado (DMEM) de DulbeccoNacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
Soro Bovino Fetal (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Meio de Crescimento de Fibroblastos 2PromoCellC-23020Meio de fibroblastos-1 = Meio de crescimento de fibroblastos 2
G418InvivogenANT-GN-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Fibroblasto médio-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 x PS
Hoechst33342 Nacalai04929-82
HigromicinaInvivogenANT-HG-1
Sistema IncuCyteEssen BioScience
Células L-WRNATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234Matriz de Membrana do Embasamento = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-acetil-L-CisteínaWako017-05131
NicotinamidaTCIN0078
Soro Tamponado com Fosfato (PBS)Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenANT-PM-05
EGF humano recombinantePEPROTECHAF-100-15
FGF-10 humano recombinantePEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
Bisturi, nº 11Feather8-3086-02
STEMFULLBaquelite sumitomoMS-90150Tubo de baixa fixação de 15 mL = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Tripsina para organoide = TrypLE Express
TripsinaNacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

Referências

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