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Artigo de método

Patologia Estriatal Induzida por Lentiviral como Modelo Pré-clínico de Ataxias Espinocerebelosas de Poliglutamina

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DOI:

10.3791/69550

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13 de março de 2026

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1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

Neste artigo

Resumo

As ataxias spinocerebelares de poliglutamina são causadas por expansões CAG que produzem proteínas propensas à agregação. Este protocolo descreve a produção de vetores, entrega estereotáxica e análise de inclusões e perda de marcadores neuronais, fornecendo uma plataforma controlada para investigar mecanismos e avaliar terapias direcionadas para doenças neurodegenerativas.

Resumo

As ataxias spinocerebelosas poliglutaminanas são um grupo de seis doenças neurodegenerativas causadas por uma mutação no trato CAG trinucleotídico dentro da região codificante de cada gene causador. Essa mutação leva a um estiramento anormalmente expandido da poliglutamina na proteína, tornando-a propensa à agregação e levando à formação de inclusões intraneuronais, que são uma característica dessas doenças. Os mecanismos moleculares subjacentes à patogênese dessas doenças são complexos e não totalmente compreendidos. Até agora, essas doenças continuam incuráveis. Compreender os mecanismos moleculares em regiões cerebrais vulneráveis é essencial para o desenvolvimento terapêutico. São necessárias plataformas experimentais flexíveis e específicas para cada região para testar rapidamente mecanismos e intervenções sem o tempo e custo de gerar múltiplas linhas transgênicas, mesmo sem abordar vulnerabilidades seletivas. Nos últimos anos, nós e outros desenvolvemos vários modelos baseados em lentivirais para estudar o impacto da expansão da expressão proteica em regiões específicas do cérebro. Esses modelos apresentam características neuropatológicas e comportamentais que imitam algumas características da doença, destacando sua importância na compreensão da patogênese e no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Neste artigo, descrevemos o desenvolvimento de um modelo estriatal usando o SCA2 como exemplo. Destacamos o desenvolvimento e a produção de vetores lentivais, e a injeção estereotáxica dos vetores que expressam a forma expandida da ataxina-2 (a proteína causadora da doença). Por fim, caracterizamos duas principais características neuropatológicas: a formação de inclusões e a perda de marcadores neuronais. Ao fornecer uma plataforma controlada que reproduz essas principais características patológicas, esse modelo oferece uma ferramenta valiosa para dissecar mecanismos específicos de neurodegeneração por região e avaliar intervenções terapêuticas direcionadas.

Introdução

As ataxias espinocerebelosas de poliglutamina (polyQ SCAs) são um grupo de seis distúrbios neurodegenerativos autossômicos dominantes causados por expansões repetidas dos trinucleotídeos CAG em vários genes causais, resultando em tratos tóxicos de poliglutamina (polyQ) dentro de proteínascodificadas 1. Entre elas, as SCAs poliQ mais frequentes são a doença de Machado-Joseph e a doença de Machado-Joseph e aSCA2 2. Esses distúrbios afetam principalmente células neuronais em regiões específicas do cérebro, incluindo o cerebelo e o tronco encefálico, além do estriado e outras áreas. Consequentemente, causam descoordenação motora progressiva, distúrbios na marcha, neurodegeneração severa e morteprematura 3.

Múltiplos modelos animais foram desenvolvidos para estudar as SCAs polyQ e testar abordagens terapêuticas. Camundongos transgênicos, linhas knock-in e modelos de camundongos de expressão condicional foram usados para elucidar a base molecular da progressão da doença e as vias celularesenvolvidas 4,5. No entanto, gerar um novo modelo animal de doença é demorado e custoso, e muitas vezes não é adequado para estudar o envolvimento regional do cérebro na patogêneseda doença 6.

Modelos de camundongos baseados em lentivirais (LV) oferecem uma alternativa complementar aos modelos convencionais, com custo reduzido e a possibilidade de estudar regiões específicas docérebro 7,8. Vetores lentivírus permitem a entrega de transgenes grandes (até 8 kb), levando a uma indução rápida de patologia em regiões cerebrais definidas sem necessidade de modificação da linha germinativa, e podem ser usados em animais de diferentes idades. A injeção direta de vetores lentivirais na região cerebral alvo pode alcançar a expressão específica de genes patogênicos ou terapêuticos com imunogenicidade reduzida em comparação com outros vetoresvirais 4. Além disso, o parto pós-natal evita a compensação do desenvolvimento para investigar mecanismos da doença em condições que se assemelham mais ao início humano9. Os níveis de expressão podem ser ajustados ajustando a dose viral, produzindo fenótipos de severidade controlada e facilitando a modelagem da progressão gradual da doença. Além disso, esse método permite a expressão específica do tipo celular dependente do promotorescolhido 4,7.

Diversos estudos demonstraram a praticidade e utilidade de modelos de camundongos baseados em LV para a modelagem dos SCAspolyQ 10,11,12,13. Nós e outros desenvolvemos modelos baseados em LV para SCA111, SCA212, SCA311,12 e SCA714, constituindo plataformas para expressão rápida e específica de regiões ou silenciamento de genes da doença, ao mesmo tempo em que reproduzem aspectos-chave da neuropatologia.

Em resumo, a abordagem lentiviral descrita aqui fornece uma ferramenta versátil e eficiente para modelar a patogênese dos SCAs polyQ. Ao superar algumas das principais desvantagens dos modelos animais atuais, esse método acelera os estudos de prova de conceito e oferece maior controle sobre o aparecimento, localização e gravidade da doença – características que o tornam altamente adequado para triagem terapêutica e estudo de mecanismos moleculares. Aqui, descrevemos um método reprodutível para gerar e caracterizar um modelo lentiviral estriatal da ataxia spinocerebelosa poliglutamina, permitindo a análise detalhada de eventos patogênicos precoces e a avaliação de terapêuticas candidatas.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) e com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O presente estudo foi aprovado pela Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV). Camundongos C57BL/6J foram usados neste estudo e foram alojados em grupos em gaiolas padrão sob um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão, com alimento e água fornecidos ad libitum.

NOTA: Os materiais usados neste protocolo são descritos mais detalhadamente na Tabela de Materiais.

1. Embalagem de vetores lentivirais

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo vetores lentivirais devem ser realizados em um laboratório BSL-2, seguindo as diretrizes de segurança da instituição. Utilizamos o sistema de transfecção de 4 plasmídeos devido à sua maior biossegurança em comparação com outros sistemas produtores de lentivirais (veja a Figura 1 para os detalhes sobre o plasmídeo de transferência).

  1. Descongele as células HEK 293T em banho-maria e seme-as em um frasco T75 usando o Meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10% FBS e 1% Pen-Streptocócico. Esse meio DMEM completo foi utilizado em todas as etapas do protocolo. Use células na passagem número ≤10 para garantir altos títulos virais e resultados consistentes.
    NOTA: Sempre verifique se há contaminação por micoplasma antes de prosseguir.
  2. Quando as células atingirem 80%-90% de confluência, expanda-as para 2 frascos de T175 dividindo a cultura inicial 1:2. Semente 20 potes de cultura de 100 mm com 3,8 x 106 células por recipiente (volume final 10 mL) e incube-os por 24 horas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. Conte células por exclusão de azul tripano usando um hemocitometro Neubauer.
    NOTA: Considere excluir Pen-Strep do meio para reduzir o estresse celular e, consequentemente, maximizar a transfecção celular.
  3. No dia seguinte, prepare a mistura de transfecção conforme descrito na Tabela 1. Vórtice e giram brevemente para baixo para homogeneizar. Incube a mistura em temperatura ambiente por 10–20 minutos para permitir a formação de complexos PEI do DNA.
  4. Após o DNA: Os complexos PEI foram deixados se formar por 15 minutos à temperatura ambiente, ajustando a mistura para 5 mL com DMEM completo.
    Remova 5 mL de meio de cada recipiente de cultura (metade do volume total) e substitua pelos 5 mL da mistura de transfecção. Isso mantém o volume final de cultura em 10 mL durante a transfecção.
  5. Transfecte as células com os três plasmídeos de embalagem e o plasmídeo de transferência conforme descrito na Tabela 1.
    NOTA: Todos os plasmídeos usados para produção lentiviral devem ser preparados com kits de purificação sem endotoxinas. Além disso, a integridade do plasmídeo deve ser verificada por análise enzimática de restrição para confirmar a correção das regiões LTR e do cassete transgene antes da transfecção.
  6. Adicione 5 mL da mistura de transfecção gota a gota em cada prato e incube por 6 horas. Aspire todo o meio e substitua por 10 mL de meio fresco. Incube por 48 horas.
    NOTA: Para aumentar o título viral, colete o meio em 48 horas, adicione 10 mL de meio fresco a cada placa e colete novamente após 24 horas. O meio previamente coletado pode ser armazenado a 4 °C por até 24 horas. Isso permitirá uma concentração de duas vezes maior do volume e aumentará o título viral.
  7. Filtre todo o meio condicionado contendo vetores lentivirais usando uma unidade de filtro de 0,22 μm.

2. Purificação e titulação de vetores lentivirais

  1. Transfira o sobrenadante filtrado para tubos cônicos de ultracentrífuga apropriados e centrifuge a 65.000 x g por 1 h 30 min a 4 °C, utilizando, por exemplo, um rotor de balde oscilante.
  2. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 400 μL de 1% de BSA diluído em 1x PBS, evitando a formação de bolhas. Incube no gelo por pelo menos 1 hora.
  3. Após 1 hora de incubação, misture cuidadosamente cada tubo para garantir que os pellets estejam totalmente ressuspensos e homogêneos, depois agrupe todos os pellets ressuspensos em um único tubo.
  4. Encha o tubo com 1% de BSA/PBS até pelo menos dois terços de estar cheio para evitar o colapso durante a centrifugação.
  5. Centrifuge novamente a 65.000 x g por 1 h 30 min a 4 °C para pelletar os vetores lentivirais. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e seque a borda do tubo com papel estéril.
  6. Resuspenda o pellet contendo os vetores lentivirais em 45 μL de 1% de BSA/PBS, evitando bolhas. Sele o tubo com filme transparente e incube a 4 °C por 24 horas.
  7. No dia seguinte, prepare 10 μL aliquotas dos vetores lentivirais. Mantenha uma alíquota de 10 μL para titulação: 5 μL para o kit ELISA p24 e 2 μL para o kit qPCR. Titule os vetores lentivirais usando ELISA e qPCR conforme as instruções do fabricante.
    NOTA: A escolha do método de titulação depende das necessidades experimentais, por exemplo, uma avaliação rápida ou quantificação precisa das unidades infecciosas. O ELISA baseado em p24 quantifica a proteína da capsídeo e, portanto, mede partículas físicas totais; É rápido, menos caro que outros métodos e altamente reproduzível. No entanto, ele não distingue partículas infecciosas de não infecciosas, o que pode levar à superestimação do título funcional. A titulação baseada em qPCR mede o número de genomas virais (vg) embalados em partículas, fornecendo uma estimativa mais precisa dos vírions contendo genomas e permitindo a comparação direta entre preparações de vetores. No entanto, ainda não consegue avaliar a infetividade efetiva das partículas virais. Por fim, ensaios baseados em infectividade, como citometria de fluxo para vetores fluorescentes ou formação de colônias de resistência a antibióticos, medem diretamente unidades transdutoras funcionais (TU/ml) e são as mais relevantes biologicamente, embora sejam mais laboriosas, dependentes do tipo celular, demoradas e maiscaras 15,16.

3. Cirurgia estereotáxica para entrega bilateral de lentiviral no estriado do camundongo

  1. Preparação animal
    1. Pese o animal e calcule a dose anestesicária necessária. Administrar anestesia intraperitonealmente em uma dose de 10 μL/g de peso corporal usando uma solução pronta para misturar. Essa solução é preparada combinando 7,5 mL de 0,9% de NaCl, 500 μL de medetomidina (1,0 mg/mL), 1,0 mL de midazolam (5,0 mg/mL) e 1,0 mL de fentanil (0,05 mg/mL), para um volume final de 10 mL. Deixe aproximadamente 10 minutos para a indução total da anestesia.
    2. Confirme a profundidade da anestesia (por exemplo, reflexo de beliscão no dedo do pé). Aplique pomada oftálmica nos dois olhos e raspe o couro cabeludo.
    3. Coloque o animal na estrutura estereotáxica em uma almofada térmica. Posicione a cabeça usando as barras auriculares e a barra de mordida.
      NOTA: O número de animais a injetar e o prazo dependem do experimento e devem ser determinados por análise estatística a priori baseada nas hipóteses específicas e nos tamanhos esperados de efeito. Como exemplo, em nosso estudoanterior 12, os cérebros injetados foram analisados 4, 8 e 12 semanas após a injeção para avaliar a progressão das alterações neuropatológicas.
  2. Preparação de seringa e carregamento viral
    1. Use a agulha Hamilton padrão para carregar e uma agulha de ponta romba de 26G para injeção. Coloque 2 μL de solução vetorial lentiviral na seringa. Certifique-se de que a dose viral por local de injeção seja de 400 ng de antígeno p24/mL, ou 5 x 109 IU/mL 10,12,17.
    2. Monte a seringa na bomba automática de microinjeção (por exemplo, Stoelting). Prepara a seringa em modo infusão até que uma gota de líquido apareça na ponta da agulha. Certifique-se de que o bisel esteja voltado para frente.
    3. Defina os parâmetros da bomba - velocidade: 0,25 μL/min, volume por hemisfério: 2 μL, tipo de seringa: adequado ao que está sendo utilizado.
      NOTA: O volume a ser injetado depende da espécie do roedor e da área cerebral alvo a ser transduzida. Injeções de 1 μL levam a uma expressão focal, enquanto volumes totais maiores (até 10 μL) exigem taxas de injeção muito lentas e apresentam maior risco de perturbação tecidular ou refluxo.
  3. Direcionamento e injeção estriatal
    1. Desinfete o couro cabeludo com 70% de etanol. Faça uma incisão na linha média (~1–1,5 cm) usando uma lâmina estéril de bisturi entre as orelhas até os olhos.
    2. Expor e limpar o crânio, removendo o periósteo com cotonetes. Localize o Bregma e grave o ponto zero estereotáxico (manual ou digitalmente).
    3. Determinar coordenadas de injeção em relação ao Bregma (para um camundongo de 8 a 12 semanas de idade com aproximadamente 18-20 g): Antero-posterior (AP) +0,6 mm; Média lateral (ML) ±1,8 mm; Dorso-ventral (DV): –3,3 mm.
    4. Treine cuidadosamente nas coordenadas AP/ML marcadas. Prossiga devagar para evitar penetrar o cérebro. Alternativamente, pare quando o osso estiver suficientemente afinado – isso é indicado pela visualização dos vasos sanguíneos na dura-máter através do crânio. Perfure cuidadosamente a dura-máter com uma agulha pequena.
    5. Teste se o furo está na posição correta abaixando a agulha de injeção. Teste para entupimentos de agulha injetando uma parte da solução até que uma gota fique claramente visível.
    6. Abaixe a agulha de injeção lentamente até a coordenada DV. Injete 2 μL de solução viral por hemisfério a 0,25 μL/min. Após a injeção, espere 5 minutos antes de retrair lentamente a agulha para evitar refluxo.
    7. Injetar lentivírus codificando a proteína selvagem (ATXN2WT ou ATXN3WT) em um hemisfério e lentivírus codificando a proteína mutante/expandida (ATXN2MUT ou ATXN3MUT) no lado contralateral (randomizado ou pré-definido)12,13.
      NOTA: Usando o atlas cerebralde camundongo 18, praticamente todas as regiões cerebrais podem ser direcionadas estereotaxicamente além do estriato, incluindo córtex, hipocampo, substância negra e cerebelo. Como o cerebelo é o principal local de patologia nas SCAs, ele representa um alvo particularmente relevante para a entrega de vetores. Para o desenvolvimento deste modelo cerebelar SCA3 de camundongo, usamos coordenadas 1,6 mm rostral para lambda, 0 mm da linha média e 1 mm ventral para a superfície do crânio, com a barra bucal ajustada em −3,3, garantindo a precisão do córtexcerebelar 12,15.
  4. Monitoramento durante a cirurgia
    1. Monitore o movimento dos bigodes e os reflexos. Se houver movimento, administre uma dose suplementar de anestesia (um terço do volume inicial).
  5. Fechamento e recuperação da ferida
    1. Feche a incisão com 3–5 pontos de nylon 5-0 interrompidos. Administre uma mistura de medicamentos antagônicos por via subcutânea, em uma dose de 10 μL/g de peso corporal, para reverter os efeitos dos anestésicos iniciais. Essa solução é preparada combinando 1,5 mL de 0,9% de NaCl, 500 μL de atipamezol (5,0 mg/mL), 5,0 mL de flumazênila (0,1 mg/mL) e 3,0 mL de naloxona (0,4 mg/mL), para um volume final de 10 mL.
    2. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação limpa sobre uma bolsa térmica e monitore-o durante a noite.
      NOTA: A sala de injeção deve idealmente ser equipada com um armário de segurança biológica para manuseio de vetores. Os pesquisadores devem usar equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jaleco, luvas e proteção ocular. Todo lixo (por exemplo, agulhas, seringas e materiais contaminados) deve ser descartado em recipientes de risco biológico conforme regulamentações institucionais e nacionais.

4. Coleta, preparação e processamento de tecidos

  1. Preparação
    1. Prepare todos os instrumentos de dissecação e as soluções necessárias para eutanásia de camundongos e coleta de tecidos (por exemplo, anestesia, paraformaldeído a 4% [PFA] em PBS).
    2. Prepare 4% de PFA com antecedência, armazene congelado e descongele no máximo 24 horas antes do uso. Certifique-se de que a solução esteja bem refrigerada antes da perfusão.
      ATENÇÃO: PFA é tóxico. Manuseie apenas dentro de uma exaustão, com equipamentos de proteção individual (EPI) e treinamento adequados.
    3. Administre uma dose letal de pentobarbital (100–200 mg/kg, intraperitoneal) para anestesiar o animal. Confirmar anestesia profunda pela ausência do reflexo de beliscão do dedo do pé; Se o reflexo persistir, administre uma dose adicional.
  2. Perfusão transcárdica
    1. Posicione e prenda o animal no aparelho de dissecação. Usando pinças, levante a pele abdominal e faça uma incisão vertical ascendente com tesoura (Figura 2A, seta rosa).
    2. Levante a fáscia superficial e faça uma incisão superior até que o fígado fique visível, evitando lesões nos órgãos abdominais.
    3. Corte o diafragma horizontalmente e depois estenda a incisão em direção à axila (Figura 2A, seta branca). Refleta e prenda a parede torácica para trás.
    4. Insira uma agulha de perfusão no ápice do ventrículo esquerdo, garantindo que ela não perfure a parede ventricular. Faça uma pequena incisão no átrio direito com tesoura fina (Figura 2B).
    5. Inicie a perfusão transcárdica usando 50 mL de paraformaldeído (PFA) gelado a 4% com vazão de 1-2 mL/min.
      NOTA: Frequentemente, a solução fria causa enrolamento da cauda e contrações musculares, o que é um indicativo de boa perfusão.
  3. Dissecação cerebral
    1. Prepare um tubo contendo 4% suficiente de PFA para submergir completamente o cérebro. Decapite o rato com uma tesoura grande. Descarte o corpo em um saco biohazard lacrado para incineração.
    2. Refleta o couro cabeludo para expor o crânio. Identifique o forame magnum e comece a remover o crânio cortando lateralmente com tesouras finas, paralelo ao cérebro (Figura 2C).
    3. Repita no lado contralateral, depois corte o crânio entre os olhos acima dos bulbos olfativos.
    4. Eleve o crânio do cerebelo em direção aos bulbos olfativos para expor o cérebro. Usando uma espátula, remova cuidadosamente o cérebro da parte posterior para a anterior e mergulhe-o em PFA a 4% por não mais de 24 horas a 4 °C.
    5. Substitua a solução de incorporação por 20%-30% de sacarose em PBS e incube a 4 °C até que a infiltração seja completa. O cérebro inicialmente flutua e depois afunda quando está totalmente infiltrado, normalmente em até 24 horas. Se permanecer à tona, estenda a incubação até que ele se fixe no fundo do tubo.
      NOTA: Esta etapa de crioproteção minimiza artefatos de congelamento ao reduzir o teor de água dos tecidos.
      Seque suavemente o cérebro e o tubo, depois armazene a -80 °C até o uso adicional.
  4. Criosseção e coleta de tecidos flutuantes
    1. Antes de seccionar, ajuste o criostato a -20 °C e a espessura desejada.
      NOTA: Para o estriado, seções coronais com espessura de 20-25 μm oferecem um compromisso ideal entre preservação estrutural e penetração de anticorpos, produzindo seções robustas o suficiente para manuseio, mantendo alta qualidade de coloração e resolução espacial. Condições de criosseção também devem ser especificadas para outras regiões cerebrais, pois a espessura ideal pode variar conforme a citoarquitetura. Para o cerebelo, geralmente recomendam-se seções sagitais de 25–35 μm, pois essa espessura preserva a organização em camadas do córtex cerebeloso.
    2. Transporte o cérebro em gelo seco e deixe ele se equilibrar dentro do criostato por 5-10 minutos. Essa etapa é importante para prevenir danos nos tecidos.
    3. Remova os bulbos olfativos com um bisturi; Devem ser macios e fáceis de cortar. Aplique uma gota do tamanho de uma ervilha de O.C.T. fresco sobre o disco da amostra e coloque o cerebelo em contato (Figura 1D). Posicione o cérebro para a cesariana coronal. Uma vez congelado, adicione O.C.T. adicional para imobilizar todo o cérebro.
      NOTA: O.C.T. é transparente em temperatura ambiente e fica opaco branco quando totalmente congelado; Se permanecer brilhante, permita mais tempo de congelamento no criostato.
    4. Monte o disco da amostra no suporte e corte até que o estriado (dois círculos brancos em cada hemisfério) fique visível. Se os hemisférios receberam tratamentos diferentes, perfure um dos hemisférios com uma agulha para manter a orientação. Registre isso para análise posterior.
    5. Mude para o modo de seccionamento e colete seções flutuantes em uma placa de 48 poços usando um pincel fino ou uma pipeta Pasteur de vidro polido ao fogo.
      NOTA: O método de flutuação livre melhora a penetração de anticorpos, reduz o fundo, permite armazenamento a longo prazo e garante seções espaçadas uniformemente para cobertura estriatal completa.
    6. Preencha os poços com PBS contendo azida de sódio 0,05%.
      ATENÇÃO: Azida de sódio é tóxica - manuseie com EPI e descarte resíduos adequadamente.
    7. Coloque a primeira seção no poço A1, a segunda em A2, e continue sequencialmente. Quando a placa estiver cheia, continue em uma nova placa ou retorne ao poço A1 e prossiga até que todo o estriado seja seccionado (~3 placas completas de 48 poços). Fele as placas com filme transparente e armazene a 4 °C até o uso.
      NOTA: Para análise de estriato inteiro, selecionar uma coluna da placa gera seções espaçadas uniformemente representativas de toda a região.

5. Imunohistoquímica com coloração DAB

  1. Lave as seções 3 vezes em PBS para remover azida de sódio residual. Incube em solução de fenilhidrazina (0,2 - 0,3 mg/mL em PBS) por 30 minutos a 37 °C.
    ATENÇÃO: A fenilhidrazina é cancerígena - realize essa etapa em uma exaustão e descarte resíduos como perigosos.
  2. Lave 3 vezes em PBS por 5 minutos, 10 minutos e 10 minutos sequencialmente. Bloqueie o tecido por 1 hora em RT em PBS contendo 10% de soro normal de cabra (NGS) e 0,1% Triton X-100.
  3. Incube durante a noite a 4 °C com anticorpo primário na diluição recomendada (por exemplo, anti-ataxina de camundongo-2, 1:1000 em solução bloqueante) sob agitação suave. Lave 3 vezes em PBS por 5 minutos, 10 minutos e 10 minutos sequencialmente.
  4. Incubar com anticorpo secundário biotinilado (1:200 em solução bloqueante) por 2 horas em RT sob agitação suave. Lave 3 vezes em PBS por 5 minutos, 10 minutos e 10 minutos sequencialmente.
  5. Incubar no complexo ABC por 30–40 minutos em tempo de descanso. Lavar 3 vezes em PBS por 5 minutos, 10 minutos e 10 minutos sequencialmente.
  6. Prepare a solução de DAB fresca: para 2,5 mL de água ultrapura, adicione 1 gota de tampão e vórtice; adicionar 2 drops de DAB e Vortex; adicione 1 drop H₂O₂ e vórtice novamente.
    ATENÇÃO: DAB é cancerígeno – manuseie em uma exaustão e descarte resíduos corretamente.
  7. Desenvolva seções em solução de DAB individualmente até atingir a intensidade desejada de coloração (tipicamente de 1 a 10 minutos). Pare a reação imediatamente transferindo para o PBS.
    NOTA: A reatividade do DAB diminui com o tempo; Trabalhe de forma eficiente. Se houver mais de uma seção no poço ao mesmo tempo, certifique-se de que elas não estejam em contato, pois isso influenciará o processo de tingimento.
  8. Lave 3 vezes em PBS por 5 minutos, 10 minutos e 10 minutos sequencialmente. Monte as seções em lâminas revestidas a gelatina e deixe-as secar completamente. Não rotule as lâminas com lápis de grafite, pois isso pode interferir na imagem.
  9. Desidrate, limpe e faça coverslip da seguinte forma: Imerga em água destilada por 30 segundos, desidrate por série de etanol: 75%, 96%, 100% (3 min cada). Transparente em substituto de xileno por 5 minutos e seco ao ar. Aplique o coverslip usando um meio de montagem de endurecimento rápido e deixe curar dentro da exaustão por pelo menos 24 horas antes de fazer a imagem ou armazenar.

6. Quantificação do volume depleto com DARPP-32 no estriado do camundongo usando FIJI (ImageJ)

  1. Aquisição de imagem
    1. Capture imagens de seções cerebrais coronais que abrangem todo o estriado (aproximadamente Bregma +1,0 a –0,5 mm). Mantenha iluminação, ampliação (por exemplo, 10x) e resolução consistentes. Salve imagens em formato TIFF com nomes de arquivo sequenciais (por exemplo, Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. Preparação de imagens nas FIJI
    1. Abra cada imagem no FIJI. Calibre o tamanho do pixel: Vá para Analisar > Definir Escala. Use uma escala conhecida de um micrômetro ou dos metadados da imagem (por exemplo, 1 pixel = 1 μm).
    2. Converter imagens para 8 bits: Tipo > imagem > 8 bits. Ajuste o brilho/contraste se necessário para visualizar de forma ótima a área esgotada (evite o limiar nessa etapa).
  3. Seleção de ROI em áreas esgotadas
    1. Use a ferramenta Polygon, Freehand ou Pincel para delinear a região com DARPP-32 (geralmente mais clara ou sem mancha no estriato). Vá em Analisar > Medir para registrar a área emμm 2.
    2. Salve o ROI indo para o ROI Manager > Adicionar > Mais > Salvar ou usar a função Multi-medida para análise em lote.
    3. Repita para todas as seções relevantes do cérebro.
  4. Cálculo do volume esgotado
    1. Multiplique a área esgotada em cada seção pela distância entre as seções (tipicamente 120 – 240 μm, dependendo da espessura e espaçamento da seção).
      Volume por seção (mm3) = área esgotada (mm2) × Intervalo de seção (mm)
    2. Soma o volume em todas as seções:
      Volume total esgotado (mm3) = Σ (área × intervalo)
    3. Opcional: Overlay para visualização. Use a Imagem > Overlay > From ROI para visualizar as regiões esgotadas em seções. Exporte uma imagem resumida ou animação para as figuras.
  5. Sempre verifique o alinhamento com o atlas cerebral do camundongo para um mapeamento rostro-caudal preciso. Analise cada hemisfério separadamente para distinguir efeitos unilaterais (por exemplo, WT vs injeção mutante).

7. Quantificação de agregados proteicos no estriado do camundongo

  1. Quantificação manual usando FIJI
    1. Carregue e calibre a imagem. Abra a imagem em FIJI. Calibre o tamanho dos pixels (pule essa etapa se estiver usando imagens com metadados).
    2. Vá para Analisar > Definir Escala, insira a distância conhecida (por exemplo, 1 pixel = 0,5 μm). No FIJI, vá em Plugins > Analisar > Contador de Células > Contador de Células. Clique em Inicializar e selecione a imagem.
    3. Escolha um tipo de marcador (por exemplo, Tipo 1) para agregados. Clique manualmente em cada agregado visível para rotulá-lo. Dados de Registro: A FIJI exibirá a contagem no painel de Contador de Células. Contagem de registros para cada imagem/seção. Exporte contagens manualmente ou use uma macro para compilar resultados.
  2. Quantificação semi-automatizada usando IHCAggreCount
    1. Faça upload e processe imagens. Abra o IHCAggreCount e clique em Upload Image (Figura Suplementar 1).
      NOTA: A aplicação IHCAggreCount foi desenvolvida pelo nosso laboratório como uma ferramenta científica independente projetada para simplificar e padronizar a quantificação de agregados celulares a partir de imagens de microscopia. O software foi construído inteiramente em Python usando uma arquitetura modular que separa o tratamento de imagens, processamento, correções de seleção, cálculo de medições e outros. O IHCAggreCount é totalmente compatível com Windows 10 e Windows 11, assim como com macOS 13 Ventura e macOS 14 Sonoma, e foi testado com sucesso em ambas as plataformas. Comparado aos métodos manuais convencionais de inspeção de imagens, o software oferece vantagens analíticas significativas: reduz a subjetividade do usuário, elimina etapas manuais repetitivas, acelera o processamento de imagens, garante medições reprodutíveis, permite extração consistente por região de interesse e possibilita o processamento em lote de múltiplos ambientes. No geral, a aplicação oferece um fluxo de trabalho mais rápido, objetivo e robusto para detecção e quantificação de globulos do que a abordagem manual tradicional. A inscrição está disponível pelos autores mediante solicitação razoável.
    2. A imagem aparecerá na Exibição da Imagem Original. Navegue até a aba de Processamento. Aplique o HiLo para melhorar agregados/contraste de fundo (veja a Figura Suplementar 2). Aplique um limiar de brilho para filtrar agregados do fundo (Figura Suplementar 3). Use o Filtro de Tamanho Mínimo para remover pequenas partículas (ruído) (Figura Suplementar 4). Opcionalmente, aplique o Limiar de Arredondamento para excluir formas não agregadas (Figura Suplementar 5).
    3. Para a detecção de agregados IHC, vá até a aba Geral e clique em Calcular Agregados Totais e Calcular a Área dos Agregados. Todos os agregados detectados são destacados e listados na Tabela de Matrizes (ID, área, tamanho médio; Figura Suplementar 6).
  3. Correções manuais (opcionais)
    1. Vá até a aba de correção, use Smart Add para detectar automaticamente agregados em regiões selecionadas (Figura Suplementar 8). Use adicionar manualmente para rotular agregados manualmente. Use o Smart Delete para remover rótulos indesejados. (Agregados destacados são exibidos para inspeção visual; Figura suplementar 7).
  4. Resultados de exportação
    1. Clique em Exportar CSV para exportar os dados atuais da imagem. Clique em Exportar Todos para exportar em lote dados de múltiplas imagens analisadas. Sempre analise imagens sob as mesmas configurações de brilho/contraste e outros parâmetros (por exemplo, limiar) entre grupos experimentais no IHCAggreCount.

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Resultados

Este estudo identificou com sucesso a expressão de ataxina-2 e DARPP-32 usando o protocolo atual. Após a injeção estereotáxica de vetores lentivirais no estriado de camundongos C57BL/6J, foi detectada expressão robusta tanto de ataxina-2 selvagem quanto mutante após 12 semanas. Já mostramosanteriormente 12 que esses construtos são específicos dos neurônios, efetivamente transduzindo uma média de 20.000 neurônios pormilímetro 3. Em nossas condiç...

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Discussão

Este artigo descreve a geração de um modelo de camundongo lentiviral estriatal para um SCA polyQ. Também descreve a produção de vetores lentivirais de alto título que codificam a forma selvagem e expandida da proteína causadora, e a injeção bilateral dos LVs no estriado do camundongo por meio de cirurgia estereotáxica. Além disso, descreve o procedimento de coleta cerebral, o processamento histológico e a quantificação baseada em imagem das marcas da doença. Juntos, esses método...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

O laboratório de Clévio Nóbrega é financiado pelo projeto Cure CSB, pela Associação Viljem Julijan para Crianças com Doenças Raras (Eslovênia) e pelo Instituto de Pesquisa do Centro Biomédico Algarve (ABC-Ri). Alguns dos autores deste artigo possuem uma bolsa de doutorado financiada pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), com as seguintes referências: Tiago Moreira-Gomes (2022.11008.BD), Inês T Afonso (2022.10161.BD) e Rafael G Costa (2022). 11973.BD).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.9% NaClFornecedor local—Usado para preparação de misturas de anestesia e antagonistas
Placas de cultura de tecido de 100 mmSPL Life Sciences11090
Kit ABC (Complexo Avidina-Biotina)VECTASTAIN Elite
Atipamezole (5,0 mg/mL)Fornecedor local—Antagonista da medetomidina
Centrífuga de mesa--
Gabinete de biossegurança, Classe II (compatível com BSL-2)--
Anticorpo secundário biotinilado--
Álbumina Sérica Bovina (BSA)NZYTechMB47002
Secções cerebrais (por exemplo, secções coronárias de 30–40 µm) imunomarcadas para DARPP-32--
Plugin Contador de Células (FIJI)Construído / ImageJ—Ferramenta para contagem manual de agregados
Incubadora CO2 (37 °C, 5% CO2, umidificado)--
Estação de trabalho de computadorFornecedor local—Usado para processamento de imagem e execução de software
Tubo cônico para ultracentrifugaçãoBeckman Coulter358126
AlgodãoFornecedor local—Usado para remoção do periósteo
Criostato com suporte para disco de espécime--
DAB (Diaminobenzidina)--
Leitor de coordenadas estereotáxicas digitalStoelting/WPI51725Display digital para medição de coordenadas
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, glicose alta)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Álcool etílico 70, 96 e 100%--
Álcool etílico, 70%Fornecedor local—Para desinfecção do couro cabeludo
Fentanil (0,05 mg/mL)Fornecedor local—Componente anestésico
Soro Bovinote Fetal (FBS), desativado por calorGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (distribuição ImageJ)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/Software de código aberto para quantificação manual de agregados
Pinça fina (para pinça do dedo)Fornecedor local—Para monitoramento da profundidade da anestesia
Flumazenil (0,1 mg/mL)Fornecedor local—Antagonista do midazolam
Pinça e bisturiFornecedor local—Para remoção do periósteo e exposição do crânio
Seringas Microlitro/Gastight Hamilton Série 700/1700Hamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203Para carregamento de solução viral
Agulhas removíveis com HUB pequeno Hamilton (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205Para entrega viral
Almofada de aquecimento (para roedores)Kent Scientific / SOMNIpor ex. 04-777-177Para manter a temperatura corporal
Células HEK 293T (≤ passagem 10, livre de micoplasma)ATCC ou equivalenteCRL-3216
Peróxido de hidrogênio--
Software IHCAggreCountFornecido sob demandaN/ASoftware proprietário interno para detecção e quantificação semiautomatizada de agregados
Microscópio invertido (para confluência celular)--
Misturador de laboratório--
Vetores lentivirais (WT e mutantes)In-house / Instalação centralN/ASolução viral para injeção
L-glutamina (200 mM)Gibco/Thermo Fisher25030081
Microscópio de luz com câmera (campo brilhante)--
Medetomidina (1,0 mg/mL)Fornecedor local—Componente anestésico
Microbroca (compatível com estereotáxico)Stoelting / Fornecedor local—Para craniotomia
Bomba de microinjeção (por exemplo, Stoelting)Stoelting/WPI53210Bomba de infusão automatizada para injeções virais
Micropipeta (P1000, P200, P10) e pontas--
Imagens de microscopia (secções IHC)Gerado internamenteN/AImagens de imunohistoquímica a serem analisadas
Lâminas de microtomo (baixa perfil, descartáveis)--
Midazolam (5,0 mg/mL)Fornecedor local—Componente anestésico
Meio de montagem--
Naloxona (0,4 mg/mL)Fornecedor local—Antagonista do fentanil
Suporte de agulhas e agulhas de dissecação fina--
Soro de cabra normal (NGS)--
Composto O.C.T.Tissue-Tek
Pomada oftálmica (Bepanthen Eye and Nose Ointment, 5% Dexpanthenol)Bayer11568-0053Previne a secagem da córnea durante a cirurgia
Misturador orbital--
Kit ELISA p24ZeptoMetrix0801111
Parafilm--
Paraformaldeído (PFA)--
PBS--
PBS sem Ca2+/Mg2+, pH 7,0Gibco/Thermo Fisher10-010-031
pCMV-dR8.2AddgenePlasmid #12263
Penicilina-Estreptomicina (100×)Gibco/Thermo Fisher15140122
Pentobarbital--
Fenilidrazina--
pMD2.GAddgenePlasmid #1

Referências

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