Ensaio de Perfil de Trombo: Uma Plataforma Baseada em Microfluídica para Caracterização Abrangente da Trombogênese Biomecânica

Summary

Este trabalho descreve um ensaio microfluídico que utiliza o estresse de cisalhamento para desencadear a formação de trombos no sangue e caracteriza o trombo por múltiplas dimensões de leitura. O ensaio pode medir a tendência protrombótica de amostras de sangue e, portanto, é útil no diagnóstico de doenças, descoberta de fármacos, bem como em estudos mecanicistas básicos relacionados à trombose.

Abstract

Trombose é uma condição patológica que descreve o acúmulo anormal de plaquetas e fatores de coagulação em um vaso sanguíneo. Embora muitos trabalhos tenham focado na ativação plaquetária por agonistas solúveis como mecanismo subjacente da trombose, muitas vezes foi negligenciado que o fluxo sanguíneo também facilita a formação de trombos. Especialmente nas artérias, a trombose geralmente está associada à estenose arterial, que eleva o estresse de cisalhamento no fluxo sanguíneo e facilita o processo de trombogênese, um fenômeno chamado trombogênese biomecânica. Por muito tempo, não havia um bioensaio disponível para fornecer insights completos e detalhados sobre o processo de trombogênese biomecânica. Para resolver isso, foi desenvolvido um ensaio de perfil de trombo combinando microfluídica com imagens de fluorescência multicoloridas, que permite a caracterização abrangente da trombogênese biomecânica com sete leituras cobrindo o tamanho e a composição do trombo, bem como o nível de ativação plaquetária. Este ensaio de perfil de trombo pode ser usado para avaliar a tendência protrombótica em humanos e a eficácia de agentes antitrombóticos, além de ser útil para compreender melhor os mecanismos subjacentes à trombose arterial.

Introduction

A trombose é uma das principais causas de doenças cardiovasculares, responsável por milhões de mortes no mundo todo^{o ano.} Atualmente, não existe bioensaio disponível em ambientes clínicos padrão para avaliar os riscos de trombose. Entre os ensaios hematológicos comercializados de laboratório e no ponto de atenção, os ensaios convencionais de coagulação e a aggregometria mostraram-se pouco confiáveis na previsão de trombose ou eventos adversos graves ^2,3,4. O teste global de^{trombose 5}, PFA-100/200⁶ e os ensaios globais de^{coagulação 7, 8, 9, 10 e 11} também apresentam dados limitados que apoiam seu desempenho.

Com base no entendimento atual, o processo de trombogênese é principalmente contribuído por três mecanismos. Além dos dois mecanismos convencionalmente reconhecidos, a saber, agregação e coagulação bioquímicas de plaquetas, um terceiro mecanismo que é pouco estudado e frequentemente subestimado é a agregação plaquetária impulsionada por cisalhamento, também chamada de "agregação plaquetária biomecânica^"12,13. Na agregação biomecânica de plaquetas, alta tensão de cisalhamento e gradiente de cisalhamento servem como principal motor para a reticulação plaquetária via fator GPIbα-von Willebrand (VWF), integrina α_IIbβ 3-VWF e integrina α_IIbβ interações_{3-fibrinogênicos}. Na trombose arterial, a agregação biomecânica de plaquetas provavelmente serve como o mecanismo mais essencial, considerando que é fortemente reforçada pelo alto fluxo de cisalhamento causado pela estenose arterial. Portanto, a trombogênese impulsionada pela agregação biomecânica de plaquetas foi chamada de 'trombogênese ^{biomecânica'12,14}.

Em trabalhos anteriores, um método comum para observar experimentalmente a agregação biomecânica de plaquetas é o ensaio de estenose microfluídica, no qual um local de estenose grave é incorporado em um canal reto. Quando o sangue é perfundido sobre o canal sob uma tensão fisiológica de cisalhamento na parede, uma tensão de cisalhamento patologicamente alta é gerada ao redor do local estenótico, o que impulsiona o acúmulo de plaquetas para formar um trombo. No entanto, trabalhos anteriores utilizaram apenas uma única leitura (para plaquetas, refletindo o tamanho do trombo) 15,16,17,18,19 ou, no máximo, duas (uma para plaquetas e outra para outro biomarcador) ^13,20, que assim não conseguem alcançar uma caracterização abrangente do trombo.

Um ensaio de perfil de trombo foi desenvolvido recentemente, que incorpora imagens de fluorescência multicolorida no ensaio de estenose microfluídica, alcançando rastreamento em tempo real de 7 biomarcadores (plaquetas, nível de fibrinogênio, nível do fator von Willebrand, nível de expressão P-seletina, nível de exposição à fosfatidilserina, integrina estendida α_IIbβ_{nível 3} , integrina totalmente ativa α_IIbβ₃ nível de expressão) em um trombo, que estabelece a base para caracterizar de forma abrangente a trombogênese^{biomecânica 21}. Neste trabalho, protocolos detalhados são fornecidos para a preparação e desempenho do ensaio de perfil de trombo, bem como para a análise de dados relacionada. O equipamento necessário para o ensaio inclui um microscópio de fluorescência multicolorido invertido e um sistema microfluídico. O ensaio utiliza uma quantidade relativamente pequena de sangue humano total (menos de 2 mL), tem alta relação custo-benefício (~$12 por amostra) e obtém resultados em até 30 minutos. O ensaio pode detectar com precisão as anormalidades protrombóticas multidimensionais dos indivíduos e avaliar os efeitos dos agentes antitrombóticos na alteração do tamanho, composição e status de ativação plaquetária do trombo, endossando sua ampla aplicação tanto para pesquisas quanto para fins clínicos no^{futuro 21}. É importante notar que o ensaio deve usar sangue heparinizado recém-coletado. Armazenar o sangue a 4 °C ou por mais de 6 horas, ou usar anticoagulantes diferentes da heparina, pode prevenir a formação de trombos ou apresentar resultados imprecisos.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana da University of Texas Medical Branch. O equipamento experimental consiste em um dispositivo microfluídico, componentes de perfusão (conectores, tubos, seringa e bomba de seringa) e um microscópio invertido com componentes ópticos que permitem imagens de campo claro e fluorescência multicolorida. Um farol multiLED e um cubo filtro multi-passe são usados no microscópio para dividir 4 canais fluorescentes com mínimo de fluxo mútuo de passagem: excitação: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 e emissão: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. Use equipamentos de proteção individual, incluindo luvas, proteção ocular e jaqueta de laboratório, para todos os procedimentos experimentais. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de dispositivos microfluídicos

1. Projete um molde mestre para conter canais retangulares (200 μm de largura × 50 μm de altura) que incorporem um local com 80% de estreitamento luminal. Cada canal possui entradas e saídas dedicadas para conexões de tubos (Figura 1; veja Arquivo Suplementar 1 para o arquivo original de projeto).
2. Com base no projeto, utilize uma pastilha de silício para fabricar um molde mestre fotorresistente SU-8 via fotolitografia padrão. Prenda o molde no fundo de uma placa de Petri de 15 cm (Figura 2A).
3. Prepare a mistura de PDMS misturando a base do pré-polímero e o agente de cura no kit de elastômero de silicone em uma proporção de peso de 10:1. Despeje a mistura sobre o molde mestre (Figura 2B).
4. Coloque a placa contendo a mistura de PDMS em um dessecador a vácuo para desgasificar e eliminar bolhas de ar aprisionadas.
   NOTA: Mantenha a placa sob vácuo por pelo menos 2 horas até que as bolhas sejam completamente removidas.
5. Cure termicamente a mistura de PDMS incubando-a a 75 °C por 2 horas.
6. Corte cuidadosamente o PDMS curado do molde mestre (Figura 2C,D) e divida-o em unidades individuais de chip.
7. Crie a entrada e a saída perfurando os furos nos locais designados usando uma agulha de sonda (Figura 2E).
   NOTA: Use um pulverizador de ar comprimido para remover qualquer resíduo dos furos perfurados. Para minimizar a contaminação superficial, limpe os dispositivos PDMS usando fita adesiva antes da colagem.
8. Em um exaustor químico, borrife etanol 75% em um lenço de tarefa, e use o lenço molhado para limpar e limpar lâminas de vidro. Deixe os slides de vidro secarem.
9. Em uma capuz química, trate as lâminas de vidro e chips PDMS com um gerador de alta frequência por 30 s e 20 s, respectivamente, e então alinhe cada chip com uma lâmina de vidro. Pressione suavemente a lasca sobre a superfície do vidro para que possa ser fixada.
   NOTA: Essa etapa precisa ser feita em um exaustor químico porque o gerador de alta frequência produz ozônio durante o uso, o que é prejudicial à saúde.
10. Ligue termicamente os dispositivos incubando-os a 150 °C por 15 minutos. Após o resfriamento, os dispositivos estarão prontos para uso (Figura 2F).
11. Armazene os dispositivos em temperatura ambiente sob condições livres de poeira.
12. Use uma pinça para remover a parte plástica das agulhas da sonda e dobre os tubos metálicos a 90°. Esses tubos dobrados serão usados como conectores para os dispositivos microfluídicos.

2. Preparação do sensor fluorescente

NOTA: O experimento utiliza um total de 7 sensores fluorescentes: SZ22-FITC, fibrinogênio-Alexa Fluor 405, 2.2.9-Alexa Fluor 555, AK4-Alexa Fluor 647, Annexin V-Pacific Blue, MBC 370.2-Alexa Fluor 555, PAC-1-Alexa Fluor 647. Entre eles, fibrinogênio, 2.2.9 e MBC 370.2 estão disponíveis comercialmente apenas na forma não conjugada e precisam ser conjugados fluorescentes em laboratório.

1. Para conjugar fibrinogênio com Alexa Fluor 405:
   1. Faça um tampão novo de bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 8,5.
   2. Diluir o estoque de fibrinogênio para 1 mg/mL em soro salino tamponado com fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_{Na 2}HPO₄, 1,8 mM_{KH 2}PO₄, pH 7,4).
   3. Adicione 1/10 de volume de buffer de bicarbonato de sódio à solução de fibrinogênio.
   4. Misture 1 mL de fibrinogênio com 1 mg de Alexa Fluor 405 NHS-ester e incube por 1 hora em temperatura ambiente em um rotador. Proteja da luz.
   5. Remova o buffer de armazenamento de uma coluna de purificação centrifugando a coluna a 1.100 × g por 2 minutos e descarte o fluxo contínuo. Coloque a solução de reação na coluna, monte a coluna em um frasco de coleta compatível e centrifuge a 1.100 × g por 5 minutos para extrair o fibrinogênio-Alexa Fluor 405.
   6. Use um espectrofotômetro para medir a absorvância em 280 nm (A₂₈₀; sinal proteico) e 405 nm (A₄₀₅; sinal de corante). Calcule a concentração de proteínas e a razão F/P (fluorescência: razão molar de proteína).
      NOTA: A relação F/P deve estar na faixa de 8-10.
   7. Armazene fibrinogênio-Alexa Fluor 405 a 4 °C no escuro.
2. Para conjugar os anticorpos 2.2.9 e MBC 370.2 com Alexa Fluor 555:
   1. Faça um tampão novo de bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 8,5.
   2. Dilua o estoque de anticorpos para 1 mg/mL em um tampão livre de aminas.
   3. Adicione 1/10 de volume de bicarbonato de sódio tampão à solução de anticorpos.
   4. Misture 100 μL de anticorpo com 1 frasco (100 μg) de Alexa Fluor 555 NHS-éster e incube por 1 hora em temperatura ambiente em um rotador. Proteja da luz.
   5. Remova o buffer de armazenamento de uma coluna de purificação centrifugando a coluna a 1.100 × g por 2 minutos e descarte o fluxo contínuo. Carregue a solução de reação na coluna, monte a coluna em um frasco de coleta compatível e centrifuge a 1.100 × g por 5 minutos para colher o 2.2.9- ou MBC 370.2-Alexa Fluor 555.
   6. Use um espectrofotômetro para medir a absorvância em 280 nm (A₂₈₀; sinal proteico) e 555 nm (A₅₅₅; sinal de corante). Calcule a concentração de anticorpos e a razão F/P (fluorescência: razão molar de anticorpo).
      NOTA: A relação F/P deve estar na faixa de 1-1,5.
   7. Armazene 2.2.9 e MBC 370.2-Alexa Fluor 555 a 4 °C no escuro.
      NOTA: Evite a supermarcação – uma alta relação F/P pode prejudicar a função biológica.

3. Coleta de sangue de sujeitos humanos

NOTA: Este procedimento deve ser conduzido por profissionais médicos qualificados (por exemplo, enfermeiros licenciados, flebotomistas certificados). Além disso, obtenha consentimento informado por escrito das pessoas participantes do estudo.

1. Prepare a seringa aspirando 500 μL de tampão de tirode (12 mM_{NaHCO 3}, 10 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5,5 mM D-Glicose, 0,5% de albumina sérica bovina, pH 7,4) contendo 0,32 U/mL de heparina por 10 mL de sangue a ser coletado.
2. Colete sangue por meio de venapunção. Use uma seringa vazia para coletar os primeiros 2 mL de sangue para descartar. Depois, troque para a seringa contendo heparina para coletar a amostra de sangue. Puxe a seringa lentamente para minimizar a ativação das plaquetas.
3. Transfira o sangue coletado para um tubo centrífugo de 15 mL e mantenha-o abaixo de 37 °C.
   NOTA: Amostras de sangue devem ser usadas para experimentos dentro de 6 horas após a coleta.

4. Ensaio de perfilamento por trombo

NOTA: Recomenda-se realizar todos os procedimentos envolvendo manuseio de sangue em um gabinete de biossegurança sempre que possível para evitar derramamentos de sangue no experimentalista. Se isso não for possível, use um paredão contra respingos na bancada.

1. Dilua o monômero VWF para 2 μg/mL no PBS. Pré-recubra os dispositivos microfluídicos com monômero VWF e incube por 1 hora em temperatura ambiente.
2. Incube a amostra de sangue com sensor fluorescente. Ajuste 1 ou 2 por 10 minutos em temperatura ambiente:
   1. Conjunto 1: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), fibrinogênio-Alexa Fluor 405 (60 μg/mL), 2,2,9-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), AK4-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
   2. Conjunto 2: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), Annexin V-Pacific Blue (1 μg/mL), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), PAC-1-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
      NOTA: Como dois conjuntos de sensores precisam ser usados separadamente, cada amostra de sangue precisa ser testada pelo menos duas vezes (uma com o Conjunto de sensores 1 e outra com o Conjunto de sensores 2) para adquirir um conjunto completo de dados.
3. Conecte um dispositivo microfluídico com conectores de entrada e saída e tubos. Conecte a outra extremidade do conector de entrada com um tubo contendo PBS, e a outra extremidade do conector da tomada com uma seringa. Monte a seringa em uma bomba de seringa. Monte o dispositivo microfluídico em um microscópio invertido e manobre manualmente o palco para encontrar o local da estenose sob o microscópio (Figura 3A).
4. Encha o canal microfluídico e o tubo com PBS usando a bomba de seringa a uma vazão de 0,5 mL/min. Certifique-se de que não haja bolhas de ar ao redor do local da estenose.
5. Conecte o tubo de entrada à amostra de sangue e perfunda a amostra pelo canal microfluídico usando a bomba de seringa a uma vazão de 0,018 mL/min (Figura 3A).
6. Defina o tempo de exposição e o ganho de cada canal de fluorescência. Realize imagens de fluorescência multicoloridas em tempo real alternando entre os 4 canais, excitando um tipo de fluoróforo por vez. Enquanto isso, encontre o plano de foco do trombo e registre sinais no local da estenose, normalmente com duração de 15 a 30 minutos (Figura 4).
   NOTA: O tempo de exposição de cada canal precisa ser ajustado para que o sinal fluorescente seja facilmente distinguível, evitando a saturação (Figura 4). No sistema atual, as amostras de sangue de sujeitos saudáveis normalmente produzem a seguinte faixa de intensidade de sinal dentro do trombo formado: SZ22-FITC, 70-110; fibrinogênio-Alexa Fluor 405, 60-100; 2.2.9-Alexa Fluor 555, 70-110; AK4-Alexa Fluor 647, 45-75; Anexo V-Pacific Blue, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-Alexa Fluor 647, 10-30. Notavelmente, porém, uma pequena proporção de sujeitos saudáveis apresentaria um resultado não típico. Portanto, recomenda-se testar pelo menos 5 amostras de sangue de sujeitos saudáveis para garantir que o tempo de exposição de cada canal seja selecionado corretamente.

5. Análise de dados

1. Abra o arquivo de dados usando ImageJ 1.53 (Fiji, Institutos Nacionais de Saúde).
   NOTA: Cada arquivo deve conter um total de 4 vídeos de 4 canais diferentes. O procedimento a seguir é geralmente aplicável a qualquer momento em que o usuário tenha interesse em analisar.
2. Use o canal SZ22-FITC para identificar o contorno do trombo e use 'seleções de polígonos' para selecionar aproximadamente a área do trombo (Figura 5A,B).
3. Para cada canal, use Imagem -> Ajustar -> Limiar para eliminar o fundo (Figura 5C) e depois use Analisar -> Medir para medir a área e a intensidade média do sinal dentro do trombo.
   NOTA: O SZ22-FITC tinge plaquetas e, assim, reflete o tamanho do trombo. No Conjunto 1, o fibrinogênio-Alexa Fluor 405 reflete o nível de enriquecimento de fibrinogênio, o 2.2.9-Alexa Fluor 555 reflete o nível de enriquecimento do fator von Willebrand (VWF), e o AK4-Alexa Fluor 647 reflete a expressão da seleção P. No Conjunto 2, a Anexina V-Pacific Blue reflete a exposição à fosfatidilserina (PS), o MBC 370.2-Alexa Fluor 555 reflete a integrina α_IIbβ₃ ativação para a conformação estendida (E⁺ α_IIbβ₃), e o PAC-1-Alexa Fluor 647 reflete a integrina α_IIbβ₃ ativação total (Ato α_IIbβ₃)²¹.

Results

O ensaio de perfilamento de trombo perfunde o sangue através de um canal estenótico para permitir a formação de trombos impulsionados por cisalhamento, e realiza imagens de fluorescência multicolorida em tempo real para coletar informações multidimensionais sobre o trombo formado. Ao completar experimentos usando sensores do Set 1 e do Set 2, deve-se ser possível caracterizar o trombo em aspectos como tamanho, enriquecimento de proteínas de reticulação (fator de von Willebrand, fibrinogê...

Discussion

Ao combinar o ensaio de estenose microfluídico com imagens de fluorescência multicoloridas, o ensaio de perfilamento de trombo oferece uma abordagem conveniente e poderosa para estudar trombogênese biomecânica e mecanobiologia plaquetária. Enquanto isso, o ensaio é útil em uma ampla variedade de aplicações. Por exemplo, pode ser usado para triar agentes antitrombóticos que inibem especificamente a agregação biomecânica de plaquetas, onde o alvo molecular e o mecanismo de ação podem ser d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringas de 10 mL	Henke Sass Wolf	5100-X00V0	Coleta de amostras de sangue
Tubos Falcon de 15 mL	Genesee Scientific	28-101	Armazenamento de amostras de sangue
Seringa de vidro estanque de 1 mL	Hamilton	81331	Montagem de hardware
2.2.9	MERU VasImmune		Coloração por trombo
Agulhas de sonda 20 X1/2	McMaster-Carr	M919	Fabricando dispositivos PDMS
Seringas de 20 mL	Henke Sass Wolf	5200-X00V0	Coleta de amostras de sangue
70% etanol	Sigma-Aldrich	EX0281-1	Desinfecção de seringas herméticas e limpeza de lâminas de vidro
AK4-Alexa Fluor 647	BioLegend	304918	Coloração por trombo
Alexa Fluor 405 NHS Ester	Invitrogen	A30000	Marcagem de fibrinogênio
Kit de marcação de anticorpos Alexa fluor 555	Invitrogen	A88065	Rotulagem MBC 370.2 e 2.2.9
Anexin V-Pacific Blue	Invitrogen	501121505	Coloração por trombo
Espanador de Limpeza	Depósito de Escritórios	911245	Fabricando dispositivos PDMS
Conjunto de facas de hobby para artesanato com caixa de madeira	Excel Blades	44282	Fabricando dispositivos PDMS
Água desionizada	ThermoFisher Scientific	751-628	Lavagem de seringas gasíferas
Dessecador	Bel Art	F420270000	Desgasificação de PDMS
Espátula de Laboratório Multipropósito Descartável	LevGo	17211	Misturando a base de elastomer de silicone e o agente de cura
Coluna de Spin para Remoção de Corantes e Biotina	Zeba	A44296S	Marcagem de fibrinogênio
Fibrinogênio	Pesquisa Inovadora	IHUFBG25MG	Coloração por trombo
Bomba de seringa Fusion 200-X	Chemyx Inc.	0720X	Montagem de hardware
Heparina & nbsp;	Sigma-Aldrich	H3149	Anticoagulação por amostra de sangue
Gerador de Alta Frequência	Electro-technic product Inc.	BD-20	Fabricando dispositivos PDMS
Monômero VWF humano	Sino Biological Inc.	10973-H08C	Revestimento de dispositivos microfuídicos
Software Image J v1.53	Fiji, Instituto Nacional de Saúde		Análise de dados
Microscópio invertido	Leica	DM IL LIDEROU; cubo de filtro: Leica DFT51010; Farol: LED5	Montagem de hardware
Kimwipes	Kimberly-Clark Profissional	34120	Limpeza de lâminas de vidro
Tampas Luer lock	International Medical Industries, Inc.	57100B	Coleta de amostras de sangue
MBC 370.2	Kerafast	EBW104	Coloração por trombo
Óculos de cobertura de microscópio	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	ES0107222	Fabricando dispositivos PDMS
Raspador de Mini-Lâmina de Barbear	Stanley	28-100	Fabricando dispositivos PDMS
Espectrofotômetro UV-Vis NanoDrop 2000	Termo Científica	ND-2000	Medição da concentração de proteínas e da razão F/P
Forno	Instrumentos de Linha de Laboratório	3512	Fabricando dispositivos PDMS
PAC-1-Alexa Fluor 647	BioLegend	362806	Coloração por trombo
Copo plástico	ThermoFisher Scientific	S04589	Misturando a base de elastomer de silicone e o agente de cura
Mestre de fotorresiste SU-8   Mofo	Instalação de Sala Limpa de Nano3 Nanofabricação da UC San Diego		Fabricando dispositivos PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Krayden Dow	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	Beckman Coulter	IM 1756U	Coloração por trombo
Tubulação	Cole - Palmer Instrument Co.	06422-01	Montagem de hardware