Artigo de método

Análise de Traçadores de Isótopos Estáveis da Vitamina A usando LC-MS/MS

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DOI:

10.3791/69558

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30 de dezembro de 2025

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1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar simultaneamente tanto os retinoides marcados isotopicamente quanto os nativos em plasma humano, usando LC-MS/MS, com limites de detecção de 6 fmol na coluna. O método incorpora um procedimento simples de extração de amostras e um curto tempo analítico, permitindo um alto rendimento de amostras.

Resumo

O método de diluição de isótopos de retinol (RID) estima as reservas totais do corpo (TBS) de vitamina A em humanos por meio da diluição estável de isótopos com o reservatório de vitamina A do corpo. Para isso, é fundamental determinar de forma precisa e eficiente a razão isotópica do plasma entre retinol marcado e não marcado por meio de espectrometria de massas. Para evitar procedimentos extensos e demorados de extração e/ou purificação, como HPLC preparativo e derivatização, o LC-MS/MS é empregado para realizar análises rápidas, sensíveis e simultâneas de retinoides marcados e não marcados. O método utiliza dois níveis de detecção: (i) uma separação inicial massa/carga (m/z) dos íons pais (precursores), seguida por (ii) detecção de íons filhos fragmentados (produto). Isso resulta em alta sensibilidade, com limites de detecção de retinol tão baixos quanto 6 fmol na coluna. Apesar das vantagens da espectrometria de massa em tandem, é necessária uma separação cromatográfica líquida para separar o retinol dos ésteres de retinila, já que os grupos funcionais terminais são perdidos durante a ionização, resultando em padrões de fragmentação de íons parentes semelhantes (m/z de 269) e filhos. O artigo descreve o isolamento do retinol endógeno e marcado (13C ou 2H) do plasma por extração com solvente, seguido pela quantificação por LC-MS/MS sob ionização química de pressão atmosférica (APCI) em modo íon positivo.

Introdução

A vitamina A é um nutriente lipossolúvel essencial para a saúdehumana 1. A deficiência de vitamina A aumenta a suscetibilidade à morbidade infecciosa grave e mortalidade, e estima-se que tenha uma prevalência global de 29%, com níveis mais altos na África Subsaariana (48%) e no Sul da Ásia (44%)2. A suplementação de vitamina A é uma estratégia eficaz para reduzir o excesso de mortalidade infantil, especialmente em áreas de alto risco, como a ÁfricaSubsaariana 3. No entanto, a introdução da suplementação semestral de vitamina A juntamente com a fortificação em larga escala de alimentos básicos e a distribuição de pó de micronutrientes, frequentemente gerenciados por diferentes entidades públicas e privadas, tem o potencial de expor indivíduos a uma ingestão excessiva de vitaminaA 4,5,6,7,8,9,10 . Assim, biomarcadores da vitamina A deveriam idealmente ser capazes de cobrir todo o espectro do status da vitamina A, desde deficiência até toxicidade. O método de diluição de isótopos de retinol (RID) é atualmente o método indireto mais preciso para avaliar o estoque total de vitamina A no corpo emhumanos 11,12,13 e tem sido validado contra concentrações hepáticas de vitamina A, considerada o melhor marcador bioquímico do status de vitamina A 14,15. O método baseia-se no princípio de que uma dose oral de traçante de vitamina A estável marcada como isótopos se mistura com a vitamina A não marcada (o traço) em reservas corporais intercambiáveis. A medição da atividade específica do retinol plasmático (ou seja, a razão entre o rastreador de retinol marcado e o retinol total no plasma (traçador/traço no plasma)) em um momento especificado após a dosagem permite a estimativa do status de vitamina A usando uma equação deRID 11,12,13.

Para determinar concentrações precisas e precisas tanto do traçador quanto do traço de retinol no plasma, vários métodos foram aplicados para quantificar a vitamina A estável marcada com isótopos, incluindo cromatografia gasosa-espectrometria de massas (GC-MS), espectrometria de massa com razão isotópica (IRMS) e espectrometria de massa tandem de cromatografia líquida (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22,23, 24, 25, 26. Importante, o LC-MS/MS combina alta sensibilidade, especificidade e simplicidade operacional com a capacidade de medir diretamente tanto o retinol nativo quanto o marcado em matrizes complexas. Assim, para evitar a preparação demorada da amostra, como cromatografia líquida de alto desempenho preparativa (HPLC) para IRMS ou derivatização para GC-MS, a análise LC-MS/MS é uma escolha ideal, pois esse método envolve um procedimento de extração simples, limites de detecção muito baixos para isótopos estáveis e tempos de execuçãocurtos 7,18,19. Aqui, apresentamos um método LC-MS/MS atualizado com tempo de execução mais curto, fluxos de trabalho simples combinados com alta sensibilidade e seletividade, como um método altamente adequado para análise de alto rendimento de amostras de estudos de intervenção humana em grande escala e observacionais, onde é necessária a determinação dos estoques totais de vitamina A no corpo.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Universidade das Filipinas, Manila (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), pelo Conselho de Revisão Institucional da UC, Davis (IRB ID: 903681-2) e registrado no ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Ética dos Serviços de Saúde de Gana (GHS-ERC 012/07/20), e o ensaio foi registrado em https://clinicaltrials.gov como NCT04632771.

1. Preparação de normas internas

  1. Solução padrão interna: Prepare a solução interna em estoque em uma concentração de 1 mg/mL de acetato de retinila em etanol contendo 0,1% de hidroxitolueno butilado (BHT; w/v). Divida as soluções originais em alíquotas e armazene-as a -80 °C por até 3 meses.
    NOTA: Para o padrão interno, é viável usar acetato de retinila não marcado ou acetato de retinila rotulado. Se for utilizado um padrão de acetato de retinil não marcado, é vital que se obteça a resolução basal dos picos de acetato de retinila e retinol (ver Figura 1).
  2. Solução de trabalho padrão interna: Prepare uma solução de trabalho padrão interna diluindo o padrão original (1 mg/mL) para 1 μg/mL. Primeiro, dilua 60 μL do padrão original com 300 μL de etanol, depois dilua 60 μL dessa solução em 10.000 μL de etanol. Para cada amostra, são adicionados 20 μL da solução padrão interna de trabalho, contendo 20 ng de acetato de retinila.
    NOTA: Soluções de trabalho padrão internas podem ser armazenadas a -20 °C por até 1 semana.

2. Preparação de padrões de calibração

  1. Padrão de calibração do estoque: Prepare as soluções padrão de calibração com uma concentração de 1 mg/mL de retinol em etanol contendo 0,1% BHT (p/v) tanto para o traço quanto para o traçador. Aliquot stock solutions e armazenar a -80 °C por até 3 meses. Use cada aliquota apenas uma vez para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
  2. Solução de trabalho padrão de calibração: retire 100 μL da solução padrão do estoque de calibração e dilua com 10.000 μL de etanol em um frasco volumétrico. Determine a concentração da solução de calibração diluída em 325 nm em um espectrofotômetro usando uma cuveta de quartzo (veja a Tabela 1 para detalhes).
  3. Pegue uma aliquota do padrão de calibração diluído e ajuste a concentração para 8 μM para o traço e para 2 μM para o traçador usando 50% de etanol e 50% acetonitrila/dH 2O (70:30 (v/v).
  4. Prepare padrões de calibração duplicados em sete concentrações diferentes usando 50% de etanol e 50% acetonitrila/dH 2O (70:30 (v/v). Se 200 μL de plasma forem extraídos, os padrões de calibração traço devem variar de 6 μM a 0,03 μM, e os padrões de calibração dos traçadores devem variar de 0,5 μM a 0,004 μM.
    NOTA: Para quantificação precisa, ésteres de retinol e retinila marcados isotopicamente no plasma são quantificados usando curvas de calibração duplicadas de 7pontos 27. O ponto mais alto na curva de calibração (o dobro da maior concentração esperada do traço e do traçador no plasma) considera o fator de concentração do extrato reconstituído a partir do volume original do plasma.

3. Extração de retinoides do plasma

  1. Retire amostras de plasma do freezer a -80 °C e descongele em temperatura ambiente (aproximadamente 30 min).
  2. Depois de descongelada, faça vórtice de cada amostra e gire por alguns segundos para garantir que não reste plasma na tampa. Depois, coloque as amostras no gelo.
  3. Ligue uma centrífuga refrigerada e deixe esfriar até 4 °C. Rotule tubos de vidro de 15 mL com tampas rosqueadas (ID do sujeito e ponto de tempo) e pipete 200 μL de água desionizada (dH2O) em cada tubo de amostra.
  4. A partir da solução de trabalho padrão interna, pipetei 20 μL da mistura padrão interna para o tubo de vidro.
  5. Usando uma pipeta, dispense 200 μL de plasma no respectivo tubo contendo o padrão interno edH2O.
  6. Pipete 400 μL de etanol em cada tubo de amostra e faça girar o tubo para misturar o etanol com o plasma. Não faça vórtices para evitar resíduos de proteína grudados na parede de vidro.
  7. Para a primeira extração de hexano, adicione 2 mL de hexano a cada tubo e prenda firmemente as tampas.
  8. Coloque os tubos em um agitador orbital e agite a 15.000 rpm por 30 minutos. Transfira os tubos para uma centrífuga refrigerada e gire a 1.800 x g por 10 minutos a 4 °C.
  9. Usando pipetas Pasteur de vidro, transfira o sobrenadante para um conjunto limpo de tubos de ensaio de vidro rotulados. Tenha cuidado para não transferir proteína, precipitado ou água.
  10. Produza uma segunda extração de hexano adicionando mais 2 mL de hexano ao resíduo restante, feche firmemente as tampas dos tubos e coloque os tubos no agitador orbital e agite a 15.000 rpm por 15 minutos.
  11. Transfira os tubos para uma centrífuga refrigerada e gire a 1.800 x g por 10 minutos a 4 °C. Usando pipetas Pasteur de vidro, transfira o sobrenadante para o tubo de ensaio de vidro contendo o sobrenadante da primeira extração de hexano (passo 3.9) para cada amostra, respectivamente.
  12. Evapore o solvente combinado de extração hexano (primeiro e segundo sobrenadante de extração para cada amostra) sob um fluxo suave de N2 em uma capela de fumaça escurecida por aproximadamente 30 minutos. Ajuste o bloco de aquecimento a 35 °C.
  13. Resuspenda o resíduo seco em 50 μL de etanol, faça um vórtice breve e adicione 50 μL de fase móvel (70:30 acetonitril/dH 2O (v/v)) e novamente o vórtice.
    NOTA: A resssuspensão do resíduo seco deve ser realizada usando 100 μL de etanol somente se o objetivo for quantificar ésteres de retinila.
  14. Transfira para tubos microcentrífugas de 0,5 mL marcados. Centrifuge a 16.900 x g por 5 minutos.
  15. Transfira 80 μL do resíduo reconstituído para frascos de HPLC âmbar com inserções de 300 μL. Imediatamente tampe o frasco para evitar perda de solvente devido à evaporação.
  16. Transfira frascos de vidro para uma criocaixa, rotule-os com o nome do estudo, data de extração e IDs da amostra, e armazene-os em um freezer a -80 °C até a análise.
    NOTA: A análise das amostras armazenadas deve ser concluída em 3 a 5 dias. Um volume plasmático de 200 μL normalmente é suficiente para detectar o traçador de vitamina A marcado até 90 dias após a dose. No entanto, o volume do plasma pode ser ajustado para 400 μL se as proporções plasma/água/etanol forem mantidas em 1:1:2 em volume.

4. Preparação de amostras internas de controle padrão

  1. Prepare o etanol/solução de fase móvel pipetando 120 μL de etanol em um tubo de microcentrífuga e adicionando 200 μL de acetonitrila/dH 2O (v/v) e vórtice.
  2. Em três tubos separados de 0,6 mL, pipete 20 μL da solução de trabalho padrão interna.
  3. Adicione 80 μL do etanol/solução de fase móvel preparada e o vórtice. Transfira as três amostras de controle padrão interno para frascos de HPLC âmbar com inserções de 300 μL e imediatamente tape os frascos para evitar perda de solvente devido à evaporação.

5. Padrões de casas de plasma

  1. Para preparar as amostras padrão da casa, obtenha volume suficiente de plasma para permitir a análise de no mínimo três amostras por execução analítica. O volume total de plasma necessário é determinado pelo número de amostras que precisam ser analisadas.
  2. As aliquotas armazenam plasma padrão em pequenos crioviais nos volumes necessários para cada execução analítica e armazenam a -80 °C.
    NOTA: É fundamental que o padrão interno contenha o rastreador de retinol marcado com isótopos usado nas amostras desconhecidas. Material suficiente pode ser obtido ao agrupar amostras de voluntários em um único alíquota.
  3. Extraia pelo menos três amostras padrão de plasma para cada análise no mesmo volume que amostras de plasma desconhecidas, como feito na etapa 3.
  4. Coloque os padrões da casa de plasma por toda a estante de amostras, com pelo menos 10 amostras de plasma desconhecidas entre elas. Use padrões de casa de plasma para calcular variações intra e entre dias.

6. Amostras padrão externas

  1. Obtenha amostras certificadas externas e armazene a -80 °C. Um padrão externo certificado amplamente utilizado é o Material de Referência Padrão do NIST SRM 968.
  2. Extraia pelo menos quatro amostras padrão externas de plasma por análise no mesmo volume que amostras de plasma desconhecidas usando a etapa 3. Use amostras padrão externas para verificar a precisão dos resultados obtidos.

7. Otimização manual de compostos

  1. Certifique-se de que a sonda do nebulizador aquecido APCI esteja instalada na carcaça da fonte MS. Prepare a solução de infusão para cada traçador de isótopos estável a aproximadamente 1 μg/mL.
    NOTA: A solução deve ser semelhante à fase móvel e deve conter algum ácido para protonação. Um bom solvente para usar seria acetonitrila/dH 2O1:1 com 0,1% de ácido fórmico (v/v).
  2. Encha uma seringa Luer-lock Hamilton de 1 mL com a solução de infusão, depois conecte a seringa à fonte com tubo PEEK via a união de aterramento. Ajuste a vazão de infusão para 10 μL/s.
  3. Selecione Afinação Manual e certifique-se de que o instrumento está no modo Afinação e Calibração. Inicie a bomba da seringa e selecione o Tipo de Escaneamento Q1 no modo positivo.
  4. Defina uma faixa de massa inferior de 50 Da, e uma faixa de massa superior aproximadamente 100 Da acima da massa molecular do composto alvo.
  5. Ajuste os ciclos para 500, taxa de varredura 200 Da/s. Clique em Iniciar e observe o sinal na janela de espectros de massa.
  6. Espere o sinal se estabilizar e então verifique se os picos esperados de m/z estão aparecendo. Considere os picos [M+H]+ e [M+2H]2+ já que o MS está em modo positivo.
  7. A altura máxima alvo deve ser em torno de 1e6. A corrente total de íons (TIC) deve ser 1e7-1e9. Continue infundindo até o sinal ficar estável, então clique em Parar. Deve haver um pico distinto com alta intensidade formado a partir do composto na solução de infusão. A corrente total de íons (TIC) é exibida, mostrando o sinal total para todos os íons combinados.
    NOTA: a massa esperada de 12C Retinol é de 269 Da, então uma faixa de 50-300 Da é apropriada para mostrar íons [M+H]+ e [M+2H]2+ .

8. Varredura de íons de produto (MS2) / verificação de espectros CE

  1. Ajuste a massa inicial em uma massa menor, por exemplo, 50 Da, e a massa de parada logo acima da massa Q1 (por exemplo, 269,1 para 12C de Retinol). Defina os Ciclos para 5 e mude a energia de colisão (CE) para 10. Verifique se a massa Q1 é o íon precursor. Se não aparecerem fragmentos menores, aumente CE para 20.
  2. À medida que o CE aumenta, mais íons produto serão formados. Continue aumentando a CE até que o íon precursor à direita do espectro desapareça completamente. Aumente ainda mais a CE para ver possível fragmentação secundária.

9. Escaneamento MRM

  1. Na varredura MS2, selecione os três íons produto mais abundantes ou mais apropriados para levar adiante para otimização adicional.
  2. Para cada íon produto, insira a massa Q1 (precursor) e as massas Q3 (produto) encontradas. Ajuste o tempo de permanência para 200 ms. Nomeie cada fragmento de acordo (por exemplo, 12C_Frag_93).
  3. Selecione a energia de colisão e identifique o valor ideal de CE usando a característica de rampa. Preencha a coluna CE com o valor otimizado de CE para cada fragmento.
  4. Otimizar o Potencial de Desclusterização (DP) otimizado após otimizar a CE para minimizar interferências isobáricas. Otimize o Potencial de Saída da Célula de Colisão (CXP) para uma transição de cada vez.

10. Otimização de fonte/gás

  1. Esses parâmetros não podem ser otimizados automaticamente. Se precisar melhorar a intensidade do sinal, realize um processo de otimização manual. Mude um parâmetro de cada vez e compare se o sinal aumentou, permaneceu igual ou diminuiu.

11. Condições de cromatografia líquida

  1. Para cromatografia, utilize um gradiente de fase binário móvel de 0,1% (v/v) de ácido fórmico emdH 2O (A) e 0,1% (v/v) de ácido fórmico em acetonitrila (B).
  2. Dependendo do sistema LC aplicado, utilize-se uma coluna ABZ PLUS de 100 mm x 2,1 mm (3 μm) equipada com um cartucho C18 de 4 mm x 2 mm (para HPLC), ou um escudo Premier BEH de 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) equipado com uma coluna FIT RP18 (para cromatografia de ultra-alta pressão (UPLC)) para análise de retinol. Mantenha as colunas a temperaturas de 40 °C ou 50 °C, respectivamente.
  3. Injete 10 μL do extrato de plasma na coluna. Analitos elutais a uma vazão de 0,4 mL/min. Para sistemas HPLC, o gradiente linear é: 60% B a 95% B em 6,0 min; 100% B de 6,1 min a 13,0 min; 100% B a 60% B de 13,1 a 14,0 min; e 60% B de 14,0 a 17,0 min. Para sistemas UPLC, o gradiente linear depende da questão de pesquisa. Se apenas o retinol for determinado, o gradiente é: 40% B a 60% B em 1,0 min; 60% B a 95% B de 1,0 min a 6,0 min; 100% B de 6,5 min a 7,5 min; 100% B a 40% B de 7,5 a 7,6 min; e 40% B de 7,6 a 8,5 min. Se o objetivo for também analisar ésteres de retinil junto com retinol, o gradiente linear é: 60% B a 95% B em 3,0 min; 100% B de 3,5 min a 6,5 min; 100% B a 60% B de 6,5 a 7,0 min; e 60% B de 7,0 a 8,5 min.

12. Condições da EM/EM

  1. Realizar análise MS/MS sob ionização química (APCI) sob pressão atmosférica em modo íon positivo. APCI é escolhida em vez da ionização por eletrospray, pois oferece uma intensidade de sinal mais alta, uma faixa linear mais ampla e oferece menor ruído defundo 26.
  2. Para as respectivas transições de massa para [12C]retinol, [13C10]retinol e [2H6]retinol e seus respectivos ésteres/acetato com parâmetros selecionados de monitoramento de reação (SRM) para o API4000 e o espectrômetro de massa QTRAP 5500, consulte a Tabela 2, Tabela 3 e Figura 2.
    NOTA: O monitoramento selecionado de íons para retinol, ésteres de retinil e acetato de retinila foi o mesmo fragmento de íon m/z 269 para quantificação APCI, já que esse íon corresponde à perda de água, ácidos graxos ou ácidos acéticos das moléculas protonadas. Como o LC-MS/MS é capaz de separar os picos de retinol de seus ésteres, uma única injeção permite determinar o enriquecimento de isótopos tanto nas frações de retinol quanto de éster de retinil em uma amostra.

13. Quantificação do retinol

  1. Quantifique as concentrações de amostras de retinol [12C], [2H6] retinol e [13C10] de retinol em relação aos respectivos padrões de calibração.
  2. Determine as perdas de extração usando a recuperação das concentrações padrão internas de cada amostra em relação às amostras de controle padrão interno.
  3. Realize a confirmação das concentrações plasmáticas de retinol usando o material de referência padrão (SRM) 968 do National Institute of Standards and Technology (NIST).

Resultados

Para ilustrar a eficácia do método analítico para analisar retinol marcado com isótopos estáveis em diferentes sistemas cromatográficos, estamos apresentando resultados de dois estudos distintos.

Para o uso do API4000 com HPLC inicial, amostras de plasma de 111 crianças filipinas entre 12 e 18 meses, que receberam uma dose oral de 400 μg (1,17μmol) [13 C10] acetato de retinil no dia 0, seguida por uma coleta de 6 mL de sangue aos 4 dias após a dose, foramanalisadas 7,28. As concentrações médias de retinol total no plasma foram de 1,1 μmol/L, e a média [13C10] de retinol foi de 0,007 μmol/L. Como o nível de ruído de fundo dentro da transição m/z 279 para 100 teve uma altura média máxima de ~50 cps (Figura 1), o nível de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) para [13C10] retinol foram definidos em 150 cps e 500 cps, correspondendo a 6 fmol e 19 fmol na coluna, respectivamente. Como uma boa resolução de linha de base foi obtida entre o retinol [12C] e o padrão interno aplicado de acetato-retinila, não houve necessidade de usar um acetato de retinila marcado com isótopos estável.

Uma separação cromatográfica mais rápida pode ser alcançada usando UPLC em combinação com o QTRAP 5500, com tempos de execução inferiores a 10 min. Dependendo da questão de pesquisa, dois métodos diferentes de separação podem ser aplicados; (i) se o objetivo é determinar retinol marcado por isótopos nativo e isótopo aplicado com um padrão interno não marcado de acetato-retinil, os tempos de retenção entre retinol (4,37 min) e retinil-acetato (5,33 min) proporcionam boa separação de base (Figura 3); (ii) se o objetivo for separar retinol nativo e marcado por isótopos, junto com ésteres de retinil nativos e marcados, uma boa separação pode ser alcançada em uma corrida de 8,5 minutos (Figura 4). No entanto, devido aos tempos de retenção próximos entre retinol (2,10 min) e acetato de retinil (2,43 min), é recomendável usar acetato de retinil marcado isotopicamente ([2H4] acetato de retinila). Neste exemplo, amostras de soro foram analisadas de 80 mulheres ganesas em idade reprodutiva que receberam uma dose equivalente de retinol de 2 mgde acetato de retinila, seguida pela coleta de sangue aos 21 dias após a dose. As concentrações médias de retinol total sérico foram de 1,89 μmol/L, com retinol média [2H6] de 0,027 μmol/L e retinol média [13C10] de 0,025 μmol/L.

O método apresentado alcançou um baixo nível de detecção (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol na coluna), demonstrando alta sensibilidade e especificidade para detectar retinol marcado com isótopos estáveis, com clara separação de base entre retinol nativo e padrões internos. Além disso, o método funcionou eficazmente tanto com configurações HPLC quanto UPLC, apesar das diferenças nos tempos de retenção. O uso de padrões internos marcados isotopicamente ([2H4] acetato de retinila) garantiu quantificação precisa sob condições de UPLC mais rápidas, caso os ésteres de retinil precisem ser determinados. A validação contra padrões de referência certificados pelo NIST confirmou precisão, enquanto coeficientes de variação intradiários e interdias (2,3% e 4,4%, respectivamente) demonstraram excelente precisão e reprodutibilidade. A análise bem-sucedida de amostras de plasma/soro de duas populações distintas (crianças filipinas e mulheres ganesas) com protocolos de dosagem diferentes mostra robustez e utilidade prática em diversos estudos nutricionais.

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Figura 1: Cromatograma LC-MS/MS usando o espectrômetro de massa API4000. O cromatograma do retinol sérico foi obtido 4 dias após a ingestão oral de 0,4 mg de [13C10] acetato de retinila. O monitoramento selecionado de reação (SRM) de m/z 269 a 93 mostra a separação do retinol [12C] (RT = 5,06 min) e do acetato de retinil [12C] (RT = 5,83 min) como padrão interno (IS). O sinal de retinol [13C10] entre m/z 279 e 100 excede suficientemente tanto o limite de detecção (LOD) quanto o limite de quantificação (LOQ). Condições cromatográficas: (A) gradiente de fase binário móvel de 0,1% (v/v) ácido fórmico em dH2O e (B) 0,1% (v/v) ácido fórmico em acetonitrila; vazão de 0,4 mL/min com gradiente linear de: 60% B a 95% B em 6,0 min; 100% B de 6,1 min a 13,0 min; 100% B a 60% B de 13,1 a 14,0 min; e 60% B de 14,0 a 17,0 min; Coluna ABZ PLUS de 100 mm x 2,1 mm (3 μm), equipada com um cartucho C18 de 4 mm x 2 mm mantido a 40 °C. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Espectros de massa de iônicos do produto APCI-MS/MS. Espectros de massa iônicos do produto APCI-MS/MS de injeção de fluxo de (A) m/z 269 [12C] retinol, (B) m/z 273 [2H4] retinol, (C) m/z 275 [2H6] retinol, e (D) m/z 279 [13C10] retinol em modo iônico positivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Cromatograma LC-MS/MS usando o espectrômetro de massa QTRAP 5500. Cromatografia LC-MS/MS de um extrato típico de um plasma doméstico padrão amostrado 21 dias após ingestão oral de 1,0 mg de acetato de retinila [2H6] e 90 dias após ingestão oral de 1,0 mg de acetato de retinila [13C10]. O monitoramento selecionado de reação (SRM) de m/z 269→93 mostra o pico de retinol [12C] (RT = 4,37 min) e acetato de retinil (RT = 5,33 min) como padrão interno (IS); o retinol [2H6] (RT = 4,36 min) em m/z 275→96; e o pico de retinol [13C10] (RT = 4,38) em m/z 279→100. Condições cromatográficas: (A) gradiente de fase binário móvel de 0,1% (v/v) ácido fórmico emdH 2O e (B) 0,1% (v/v) ácido fórmico em acetonitrila; Vazão de 0,4 ml/min com um gradiente linear de: 40% B a 60% B em 1,0 min; 60% B a 95% B de 1,0 min a 6,0 min; 100% B de 6,5 min a 7,5 min; 100% B a 40% B de 7,5 a 7,6 min; e 40% B de 7,6 a 8,5 min; Coluna FIT AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT de 100 mm x 2,1 mm x 2,1 mm, mantida a 50°C. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Cromatograma LC-MS/MS de retinol e ésteres de retinil usando o espectrômetro de massa QTRAP 5500. Cromatograma LC-MS/MS de um extrato típico de plasma em casa padrão amostrado 6 h após a ingestão oral de 1,0 mg de acetato de retinila [2H6] e 90 mg após ingestão oral de 1,0 mg de acetato de retinila. O monitoramento selecionado de reação (SRM) de m/z 269→93 mostra o pico de [12C]retinol (RT = 2,10 min); o [2H4]acetato de retinil em m/z 273→94 (RT = 2,43 min) como padrão interno (IS); a separação do [2H6]retinol (RT = 2,09 min) e [2H6]palmato de retinil (RT = 5,11 min) atinge o pico em m/z 275→96; e o pico de [13C10] retinol (RT = 2,10) em m/z 279→100. Condições cromatográficas: (A) gradiente de fase binário móvel de 0,1% (v/v) ácido fórmico emdH 2O e (B) 0,1% (v/v) ácido fórmico em acetonitrila; vazão de 0,4 ml/min com gradiente linear de: 60% B a 95% B em 3,0 min; 100% B de 3,5 min a 6,5 min; 100% B a 60% B de 6,5 a 7,0 min; e 60% B de 7,0 a 8,5 min; Coluna FIT AcquityTM Premier BEH RP18 VanGuard FIT de 100 mm x 2,1 mm (2,1 mm), mantida em 50 °C. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetros
Absorção molar (ɛ) do retinol no etanol:52.770 M-1 cm-1
Fator de diluição:100 (100μL do padrão de calibração original em 10mL de etanol)
Absorção média medida:0.575
Cálculo
Concentração (mol) de [12C]retinol no etanol:Concentração (mol) = Absorção / ɛ x Comprimento da cuveta
= 0,575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1,09 x 10-5 M
Corrigindo para diluição:1,09 x 10-5 M x 100 = 1,09 x 10-3 M ou 1,09 mM

Tabela 1: Determinação da concentração padrão de calibração do estoque de retinol.

AnalitoTransições MRM (m/z)Potencial de desagrupamento (V)Potencial de entrada (V)Energia de colisão (eV)Potencial de saída de colisão (V)
[12C]-retinol/ésteres269→935110276
[2H4] acetato de retinil273→945110276
[2H6] retinol/ésteres275→965110276
[13C10]-retinol/ésteres279→1004110276

Tabela 2: Parâmetros selecionados de monitoramento de reação (SRM). Parâmetros para [12C] retinol, [13C10] retinol e [2H6] retinol e seus respectivos ésteres usando o API4000

AnalitoTransições MRM (m/z)Potencial de desagrupamento (V)Potencial de entrada (V)Energia de colisão (eV)Potencial de saída de colisão (V)
[12C]-retinol/ésteres269→939410338
[2H4] acetato de retinil273→9454102011
[2H6] retinol/ésteres275→966910253
[13C10]-retinol/ésteres279→10010210359

Tabela 3: Parâmetros selecionados de monitoramento de reação (SRM). Parâmetros para [12C] retinol, [13C10] retinol e [2H6] retinol e seus respectivos ésteres usando o QTRAP 5500

Discussão

O método LC-MS/MS apresentado oferece sensibilidade extremamente alta, com limites de detecção tão baixos quanto 6 fmol/L, permitindo assim que os investigadores utilizem apenas 100 a 200 μL de plasma19. Este método direcionado de esclerose múltipla em tandem é particularmente poderoso para confirmar a identidade dos isotopólogos retinoides quando são utilizados íons quantificadores e produtosqualificadores 18. No entanto, como os retinoides marcados por isótopos estão presentes em concentrações substancialmente menores do que os retinoides fisiológicos não marcados, amostras de plasma contendo retinol marcado e ésteres de retinil podem exigir uma etapa adicional de concentração. Essa necessidade depende de fatores como o momento da amostra de sangue pós-aplicação, a concentração de rastreador oral e a sensibilidade do sistema LC-MS/MS. Historicamente, doses maiores de aplicações eram usadas para superar a menor sensibilidade dos espectrômetros de massa anteriores, mas avanços recentes facilitaram o uso de dosesmais baixas 13. Nos exemplos apresentados, uma dose oral maior aumenta o nível de retinol marcado com isótopos estáveis mesmo em momentos posteriores, ou seja, em 21 dias versus 4 dias.

Como os grupos funcionais terminais dos ésteres de retinil são perdidos durante a ionização, o mesmo pai m/z de 269 e padrões semelhantes de fragmentação de íons filhos são observados tanto para os ésteres de retinol quanto para os ésteres de retinila. Portanto, a separação cromatográfica é crucial para determinar suas concentraçõesseparadas 18. Além disso, devido à alta abundância natural de isótopos estáveis de 13C em isótopólogos endógenos de retinol, recomenda-se incorporar mais de três átomos de 13C no traçador de retinol para evitar a necessidade de corrigir o enriquecimento natural de retinol com 13C noplasma humano 29.

Amostras de plasma requerem processamento prévio da análise de isótopos em duas etapas. Primeiro, as amostras de plasma precisam ser desproteinizadas, seguidas pela extração de retinol e ésteres de retinil usando um solvente não polar, que cria um sistema bifásico 18,19,20. Embora uma separação clara de fases seja obtida usando o protocolo acima, é fundamental que a interfase no sistema bifásico não seja perturbada ou coletada, pois isso aumentará o tempo de secagem e reduzirá a precisão da análise. Alternativamente, nosso grupo também explorou a aplicação de um procedimento de extração monofásica para osretinoides 20. Para isso, amostras de plasma de 200 μL são pipetadas em um tubo plástico de microcentrífuga de 2 mL, e os retinoides são extraídos usando uma combinação de etanol e acetato de etil. A aplicação desse protocolo de extração permite a análise do retinol e de mais retinoides polares, como isômeros do ácido retinoico, com recuperação equivalente à extração bifásica, e também é comparável ao método de extração de acetonitrilo em uma etapa de Kane e Napoli30.

Considerando que os retinoides são suscetíveis à oxidação e isomerização quando expostos à luz UV e ao calor, é crucial realizar a análise o mais rápido possível, e precauções gerais devem ser tomadas durante a coleta, manuseio e armazenamento do plasma30. Métodos tradicionais para análise de retinoides marcados com isótopos estáveis empregam isolamento e/ou derivatizações demoradas. A análise GC-MS requer o isolamento da fração de retinol do soro humano usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC), seguida pela derivatização doretinol 22. Embora a derivatização não seja necessária para GC-C-IRMS, a separação prévia do retinol usando duas etapas separadas de purificação HPLC érecomendada 17,25,31, e a determinação do enriquecimento natural basal de retinol com 13C no plasma humano na população amostral tambémé necessária17,32. Em contraste, o método LC-MS/MS apresentado apresenta várias vantagens. Evita procedimentos extensos e demorados de extração e/ou purificação, permitindo uma análise rápida, sensível e simultânea dos ésteres de retinil e do retinollivre 16,18,26,32. Além disso, o método é eficaz porque oferece alta precisão, baixa variabilidade e é adaptável a diferentes sistemas LC-MS/MS.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

O apoio a esse trabalho foi fornecido pela Fundação Bill & Melinda Gates (Número do Projeto: OPP1115464) e pela Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA) em Viena (Projeto Número E4.30.30).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solventes
Grau absoluto de etanol HPLCFisher10428671
Grau HPLC de acetonitriloFisher10660131
Hexano 95% N-Hexano para HPLC Certificado HPLCFisherH/0406/17
Grau HPLC de isopropanolVWR20880.32
Grau HPLC de isopropanolVWR20880.32
Metanol 99% 2,5 LTermo Científica11367996
Padrão/isótopos
All-trans-retinolBioXtra95144
Acetato de retinilaSigmaPHR1236
Retinol marcado com isótopos estáveis:ReseaChem/Buchem BV
Acetato de retinila marcado por isótopo estável:ReseaChem/Buchem BVN/AUma variedade de isótopos estáveis pode ser usada para o método RID. Uma lista de diferentes isótopos comercialmente disponíveis é apresentada na Tabela 1. 
Vitamina A e Vitamina; (19,19,19,20,20,20-D6)
Vitamina A e Vitamina; (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Acetato de vitamina A (10,19,19,19-D4)
Acetato de vitamina A (19,19,19,20,20,20-D6)
Acetato de vitamina A (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Equipamento
Dispensador de solvente ajustável de 5mlSigma-AldrichZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Balança analítica  Fisher13592970
Pistões capilares (pontas de pipeta) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Pistões capilares CP250ST 6x96GilsonF148714
Gabinete de fumaça
Microman E M100E Pipeta (deslocamento positivo)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipeta (deslocamento positivo)GilsonFD10005
Pipetman P100, 10-100ul, ejetor metálicoGilsonF114057M
Pipetman P1000, 100-1000ul, ejetor metálicoGilsonF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, ejetor metálicoGilsonF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Centrífuga Refrigerada 5810 REppendorf
Banho-maria sónicoVWRUSC100T
EspectrofotômetroThermo Fisher ScientificA51119600C
Concentrador de amostras Techne e bloco de calor.VWR
Vibrax VXR Shaker BásicoIKA0002819002
Misturador de vórtice; MS3 IKA básicoFisherMPR-555-050L
Acessório de tubo de ensaio VX2 - werke type VX2IKA0000568900
Consumíveis
Tubos microcentrífugas de 1,5mlFisherFB74323
100 mm x 2,1 mm (1,7 & mu; m) Coluna AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FITÁguas186009498
100 mm x 2,1 mm (3 & micro; m) Coluna Supelcosil ABZ PLUSSupelco57917
Pontas de pipeta de 1000ulStarlabS1122-1830
Frascos volumétricos de 100mlFisher11323644Frasco volumétrico certificado Pyrex Borosilicato Classe A
Pontas de pipeta 200ulStarlabS1120-8810
Cartucho SecurityGuard C18 4 mm x 2 mmFenomenônexAJ0-4286
Frascos volumétricos de 50mlFisher11313644Frasco volumétrico certificado Pyrex Borosilicato Classe A
Frascos de vidro âmbar de 9mm com inserçõesFisher11583680
Tampas roscas de frasco de 9mmFisher13206419
Caixa criogênica de papelãoStarlabA9623-8181
Hellma cuvette UV quartzSLSCEL1600
Gás nitrogênio (máxima pureza e livre de oxigênio)BOC
Pipeta PasteurFisher11546963
Tubos de cultura Pyrex 100x16mmCorningCLS9944916
Tampas de rosca PTFE liner 16mmCorningCLS999815
Tampas de PTFE de vidro de vidro de 2mlFisher11573542
Tampa de rosca do frasco 9mm silicone branco/PTFE vermelhoThermo 13206419

Referências

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