Artigo de método

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

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DOI:

10.3791/69562

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10 de abril de 2026

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1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

Neste artigo

Resumo

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Resumo

As células endócrinas pancreáticas derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) constituem uma fonte promissora para terapia celular do diabetes e modelagem de doenças. Embora vários protocolos de diferenciação tenham sido estabelecidos, a implantação in vivo é comumente necessária para estudar maturação e função dentro de um contexto fisiológico. A maioria das abordagens de transplante depende de locais como a cápsula renal ou o espaço subcutâneo, que podem apresentar limitações técnicas ou fisiológicas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o transplante intramuscular de ilhéus SC pancreáticos derivados de hPSC em camundongos imunodeficientes. Este site permite acesso cirúrgico simples, redução da invasividade e coleta confiável de enxertos para análises posteriores. O procedimento possibilita a implantação intramuscular de ilhéus derivados de células-tronco e apoia sua recuperação para avaliação posterior da secreção de insulina após um desafio oral de glicose. O protocolo inclui etapas para preparação e compactação de clusters, cirurgia de transplante, secreção de insulina estimulada por glicose in vivo (GSIS) e coleta de enxertos para análise histológica, fornecendo uma estrutura reprodutível para transplante intramuscular em modelos de camundongos pré-clínicos.

Introdução

O diabetes é um distúrbio metabólico heterogêneo cuja prevalência dobrou nas últimas três décadas e espera-se que afete 1,3 bilhão de pessoas até 2050. Embora fatores ambientais, como dieta e estilo de vida, desempenhem um papel significativo no aparecimento do diabetes tipo 2 (DT2), a predisposição genética também contribui substancialmente para suapatogênese 2. As células β pancreáticas são responsáveis pela síntese e secreção de insulina e desempenham um papel central na fisiopatologiado diabetes 3. Para entender como o risco genético contribui para a disfunção das células β, as células β derivadas de células-tronco humanas, organizadas como agrupamentos endócrinos tridimensionais (doravante chamados de ilhotas SC) fornecem um sistema modelo altamente informativoe relevante 4,5. Protocolos recentes orientam efetivamente a diferenciação das células-tronco humanas em células β produtoras de insulina, recapitulando estágios-chave do desenvolvimento pancreático usando inibidores e fatores de crescimento específicos 6,7.

Esses sistemas replicam de forma confiável marcos do desenvolvimento de forma escalável e reprodutível, superando as limitações dos ilhéus derivados de doadores, que não suportam modelagem de desenvolvimento e estão sujeitos a restrições de oferta. Modelos de Murine forneceram insights valiosos sobre o desenvolvimento pancreático, mas frequentemente não conseguem reproduzir totalmente as manifestações fenotípicas observadas em pacienteshumanos 5. Consequentemente, o uso de um sistema baseado em células-tronco permite a caracterização de variantes genéticas envolvidas no desenvolvimento pancreático humano e β disfunçãocelular 8.

Apesar desses avanços, ilhéus SC gerados in vitro permanecem transcriptomicamente e funcionalmente imaturos em comparação com as células nativas de β adultas. Eles apresentam secreção de insulina estimulada pela glicose subótima e falta de expressão de marcadores maduros de β células, como MAFA e G6PC2 9,10. Para preencher essa lacuna, a maturação in vivo via transplante em camundongos imunodeficientes é frequentemente empregada; Isso normalmente melhora tanto a dinâmica da secreção de insulina quanto os perfis de expressãogênica 6.

O metabolismo da glicose é rigidamente regulado e requer a integração de sinais sistêmicos. Ilhéus SC transplantados são capazes de integrar sinais de múltiplos órgãos, proporcionando um ambiente fisiologicamente mais relevante, crucial para avaliar as consequências funcionais da variação genética em células βhumanas 11.

O transplante de ilhotas SC em camundongos já foi realizado em diferentes locais anatômicos. O local convencional é a cápsula renal, eficaz para promover a maturação de células β e reverter o diabetes em roedores tratados com estreptozotocina (STZ) 12, mas envolve uma cirurgia invasiva complexa, que limita sua implementação emlaboratórios 13. Além disso, esse método não é aplicável para ambientes clínicos para tratar pacientes com diabetes tipo 1 devido às limitações de tamanho evascularização 14. Locais alternativos de transplante, como tecido intramuscular, subcutâneo e adiposo, foram relatados, oferecendo vias menos invasivas e mais clinicamente aplicáveis. Embora o transplante intramuscular possa apresentar desafios para alcançar a maturação ideal das células β e secreção de insulina em comparação com a cápsularenal 12, ainda assim pode alcançar secreção eficaz de insulina e manutenção da homeostase glicose, ao mesmo tempo em que oferece uma abordagem cirúrgica mais simplese acessível 15,16.

Portanto, neste protocolo, apresentamos uma abordagem de transplante intramuscular que aborda várias limitações de outros protocolos de transplante. Esse método é minimamente invasivo e oferece uma estratégia in vivo confiável para amadurecer ilhéus-SC e investigar variantes genéticas ligadas à disfunção β-celular.

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Protocolo

Todos os experimentos envolvendo células-tronco pluripotentes (hPSCs) e animais de laboratório foram aprovados por comitês de ética institucionais, regionais e nacionais. As linhas hPSC usadas aqui foram originalmente derivadas e distribuídas de acordo com as aprovações éticas apropriadas e os procedimentos de consentimento informado nas instituições de origem. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho geral, desde a manutenção do hPSC até a diferenciação e maturação dirigida da linhagem pancreática em ilhéus SC adequados para transplante.

1. Diferenciação de hPSCs em progenitores pancreáticos

NOTA: Este protocolo se baseia em dois passos preparatórios essenciais: 1) a manutenção e expansão dos hPSCs, e 2) sua diferenciação direcionada para a linhagem endócrina do pâncreas. Ambos os passos foram descritos emdetalhes 7,17. Os hPSCs são mantidos em placas revestidas com meio B8, seguindo as recomendações de Lyria-Leyte et al.17. Colhe hPSCs para diferenciação durante crescimento exponencial antes que se tornem confluentes. Na densidade de semeadura recomendada, elas devem atingir 90-100% de confluência no dia seguinte, prontas para iniciar a diferenciação. A diferenciação em direção à linhagem endócrina do pâncreas é realizada de acordo com o procedimento descrito por Barsby et al.7. Detalhes completos da mídia podem ser encontrados na Tabela 1.

  1. Recobrir as placas de diferenciação com uma matriz extracelular derivada da membrana basal.
  2. Semente 0,16-0,19 milhões de células/cm2 no Dia 0 (1,7 milhão de células em um poço a partir de uma placa de 6 poços). Use 1,5-2 vezes o volume de B8 + CEPT para evitar a perda de nutrientes (3-4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
    NOTA: Ao passar hPSCs ou experimentar de diferenciação de semeadura, suplementamos preferencialmente o meio B8 com CEPT, um coquetel de chroman 1, emricasan, poliaminas e trans-ISRIB, em vez do inibidor convencional de ROCK Y-27632, devido à sua comprovada capacidade de aumentar a sobrevivência dohPSC 18. No entanto, o Y27632 continua sendo uma alternativa válida para esse protocolo.
  3. Realize mudanças de mídia usando mídias de diferenciação de S1 a S4 de acordo com o seguinte cronograma: S1 (Dias 1-4), S2 (Dias 4-7), S3 (Dias 7-9) e S4 (Dias 9-11).
    NOTA: Consulte a Tabela 1 para composições completas em mídia; detalhes processuais adicionais são descritos por Barsby et al.7.

2. Geração de aglomerados 3D e diferenciação para células produtoras de insulina

NOTA: No 11º dia, as células diferenciadas deveriam ter se desenvolvido em progenitores pancreáticos. Para promover ainda mais a diferenciação endócrina nessa etapa, as células fazem a transição da cultura planar para a cultura 3D.

  1. Adicione 0,5 mL de solução antiaderência de 5% (p/v) (veja a Tabela 1 para detalhes) para cobrir o fundo de uma placa de micropoços de 24 poços contendo micropoços piramidais invertidos (400 μm de diâmetro). Centrifuge a 1.300 g por 10 minutos em temperatura ambiente (RT).
    NOTA: A solução antiaderente cria uma superfície antiaderente que impede que as células aderam ao plástico e promove a agregação uniforme.
  2. Examine os micropoços ao microscópio em busca de bolhas de ar e re-centrifuge conforme necessário para remover qualquer ar aprisionado (Figura 2A). Aspire a solução antiaderente e lave 2 vezes com 0,5 mL de PBS por poço. Deixe os poços cobertos com PBS até estar pronto para uso.
  3. Lave as células com 1 mL de PBS-0,5 mM EDTA, aspire o PBS-EDTA e cubra os poços com tripsina (1 mL para um poço de placa de 6 poços). Incube a 37 ºC por 8-12 minutos (até que o toque cause descolamento perceptível).
  4. Não remova a tripsina; em vez disso, dilua com 2x volumes de DMEM-F12 ou PBS, e resuspenda suavemente por pipeteamento. Coloque a suspensão em um tubo cônico e imediatamente prossiga para a próxima etapa.
    NOTA: É melhor incubar por mais tempo em tripsina do que realizar uma trituração mecânica severa.
  5. Centrifuge a suspensão a 200 g por 3 minutos em RT. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet suavemente em meio S4 pré-aquecido (1,25 mL para cada poço de um micropoço de 24 poços).
  6. Aspire o PBS de antenas micropoços. Delicadamente, adicione 1,25 mL das células suspensas a cada poço da placa do micropoço.
    NOTA: Cada poço da placa de 24 micropoços contém 1.200 micropoços. A densidade de semeadura necessária para obter aglomerados de tamanho adequado é de 1.500 células por micropoço, correspondendo a 1,8 milhão de células por poço. Alternativamente, micropoços de 6 poços podem ser usados, ajustando volumes e número de células (aproximadamente 8,85 milhões de células em 5 mL de meio Estágio 4).
  7. Centrifuge a placa a 100 g por 3 minutos em RT para distribuir as células uniformemente nos micropoços. Transfira cuidadosamente as placas do micropoço para uma incubadora umidificada.
  8. Realize mudanças de mídia usando mídias de diferenciação S5 (D14-D18), S6 (D18-D25) e S7 (D25-D46).
    NOTA: Detalhes completos da composição são fornecidos na Tabela 1, com detalhes processuais adicionais descritos por Barsby et al.7.
    O coquetel CEPT pode ser usado durante essa etapa em vez do inibidor ROCK Y-27632, devido à sua comprovada capacidade de aumentar a sobrevivência celular durante a formação doorganoide 18. A agregação bem-sucedida é indicada pela formação de aglomerados compactos e esféricos em 24-48 horas (ver Figura 2B).

3. Transplante de ilhéus SC para o músculo tenso de camundongos imunodeficientes

NOTA: Ilhéus SC foram transplantados em vários estágios de diferenciação (do estágio 4 ao estágio 7). Enquanto o transplante de ilhéus SC diferenciados S7 representa a estratégia ideal para avaliar a resposta àglicose 6, o transplante de progenitores em estágio anterior (S4-S5) ou ilhéus SC imaturos (S6) pode ajudar a revelar diferenças de diferenciação ou maturação que são mascaradas in vitro pelo uso de condições definidas em cultura. No entanto, o transplante de progenitores menos diferenciados traz um risco aumentado de formação de teratomas, principalmente devido à população celular residual e indiferenciada.

  1. Compactação de aglomerados
    1. Transfira a quantidade apropriada de clusters para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL (ver nota).
      NOTA: A dose celular depende do objetivo experimental. Para histologia, de 0,5 a 1 milhão de células por camundongo são suficientes para a recuperação confiável do enxerto, enquanto ensaios funcionais ou reversão de diabetes em camundongos tratados com STZ normalmente exigem doses mais altas, de até 2 a 5 milhões de células. Antes da compactação, os ilhéus SC devem apresentar uma morfologia esférica uniforme com diâmetro alvo de ~150-250 μm (faixa aceitável: 100-300 μm). Essa faixa de tamanho corresponde aproximadamente a ~10³-4 × 10³ células por cluster; agregados sobredimensionados (>300-400 μm) devem ser evitados, pois são mais suscetíveis à necrose central. O tamanho e a uniformidade do cluster são verificados antes da compactação por imagens em campo claro ou estereoscópio de poços representativos, seguidos pela medição do diâmetro usando software padrão de análise de imagem.
    2. Conecte a seringa ao conjunto agulha-tubo e encha com um meio S7.
    3. Aspire os aglomerados diretamente para o tubo da microcentrífuga. Dobre o tubo ao meio e insira a seção dobrada em uma ponta de pipeta de 200 μL. Insira o conjunto ponta-tubo e agulha em um tubo cônico de 15 mL e fixe as extremidades na borda do tubo usando fita.
    4. Centrifuge o tubo a 100 g por 2 minutos a 4 °C para compactar os aglomerados. Coloque o tubo imediatamente no gelo.
  2. Transplante de aglomerados em camundongos
    NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados utilizando equipamentos de proteção individual adequados e em conformidade com as regulamentações institucionais de biossegurança e bem-estar animal. Agentes anestésicos e objetos cortantes devem ser manuseados e descartados de acordo com os procedimentos de segurança aprovados.
    1. Induzir anestesia em camundongos NOD-scid-gama usando isoflurano a 3-5%.
    2. Raspe o lado posterior da perna direita abaixo do joelho e desinfete com etanol 70%.
    3. Desconecte o tubo da ponta da pipeta e conecte-o à seringa. Corte o tubo próximo aos cachos compactados e prenda-o na extremidade romba da agulha. Pressione o soro até que o primeiro aglomerado chegue à ponta da agulha.
    4. Posicione o rato deitado, inclinando-se para o lado direito, e estenda a perna direita. Insira a agulha 4-5 mm de profundidade no compartimento medial da coxa direita, na região entre os músculos adutor e grácil.
    5. Injete os clusters enquanto retrai a agulha em ~3 mm. Gire a seringa e retire a agulha.
    6. Monitore o rato até estar totalmente recuperado da anestesia.
      NOTA: Para caracterização funcional (ou seja, GSIS in vivo , seção 4), devem ser usadas ilhéus SC de um único genótipo por camundongo; Um único transplante é suficiente. No entanto, para caracterização histológica ou transcriptômica da maturação após a implantação, ambas as pernas podem ser usadas (por exemplo, uma perna com clusters SC derivados de hPSCs contendo uma variante genética associada à doença, e a outra perna com a variante corrigida). A administração intramuscular correta não pode ser confirmada diretamente in vivo imediatamente após a injeção. A implantação bem-sucedida é, em vez disso, verificada retrospectivamente por identificação macroscópica do enxerto no momento da coleta (Figura 3) e por análise histológica (Figura 4).

4. Secreção de insulina estimulada por glicose in vivo (GSIS)

NOTA: GSIS in vivo, via desafio oral da glicose, avalia a secreção funcional de insulina em resposta a um estímulo fisiológico. Todos os procedimentos devem seguir as diretrizes institucionais de cuidado e uso dos animais. As respostas funcionais das células β transplantadas melhoram com a maturação in vivo : o peptídeo C humano pode ser detectado já duas semanas após o transplante, enquanto a secreção robusta responsiva à glicose é tipicamente alcançada em 4 semanas. Esses prazos podem variar dependendo do estágio de desenvolvimento dos ilhéus SC no momento do transplante

  1. Mouse rápido por 4-6 horas antes da administração da glicose, garantindo acesso à água.
  2. Prepare uma solução de D-(+)-glicose a 20% (p/v) em água. Esterilize passando por um filtro de 0,22 μm e aqueça até a temperatura ambiente antes do uso.
  3. Pese cada camundongo e calcule a dose necessária de glicose em 3 g/kg de peso corporal.
  4. Coloque o volume apropriado de solução de glicose em uma agulha curva de 20 G, presa a uma seringa de 1 mL.
  5. Imobilize suavemente o camundongo e realize a penetração oral, garantindo a inserção suave da agulha para evitar aspiração traqueal.
  6. Colete amostras de sangue por perfuração submandibular ou na veia caudal no início (0 min) e 15 e 30 minutos após a penetração, usando tubos capilares e tubos microcentrífugas de 1,5 mL. Deixe o sangue coagular em temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos, depois armazene os tubos no gelo.
  7. Centrifuge as amostras a 1.000 g por 15 minutos a 4 °C e transfira o soro para novos tubos. Armazene a −80 °C até análise pelo ELISA.
    NOTA: Os pontos de tempo podem ser ajustados dependendo do modelo experimental. É fundamental usar um ensaio capaz de distinguir entre insulina humana e de camundongo ou peptídeo C para avaliar a secreção de insulina derivada do enxerto em modelos de xenotransplante.

5. Recuperação de aglomerados enxertados

  1. Eutanasie o camundongo seguindo as diretrizes institucionais de ética animal.
  2. Para minimizar a contaminação dos tecidos com pelos, borrife etanol em 70% (v/v) sobre o corpo.
  3. Remova a pele para expor os músculos dos membros inferiores e localize os aglomerados enxertados usando uma lupa. Extire tecido contendo enxerto usando tesoura e pinça.
  4. Enxágue o tecido uma vez com PBS e transfira para paraformaldeído (PFA) a 4% (p/v) sobre gelo. Fixe o tecido em 4% de PFA a 4 °C por 4 horas com sacudidas suaves.
  5. Lave a amostra em PBS por 1 hora com uma sacudida suave. Transfira o tecido para 30% (p/v) de sacarose no PBS e incube durante a noite a 4 °C.
    NOTA: Tecidos biológicos, amostras de sangue e resíduos químicos (incluindo fixadores e resíduos anestésicos) devem ser descartados seguindo as diretrizes institucionais de biossegurança e gestão de resíduos químicos.

6. Coloração dos explantações

  1. Embedding OCT
    1. Embutido o tecido em um molde preenchido com composto de Temperatura Ótima de Corte (OCT).
    2. Coloque o mofo em um banho de gelo seco com isopropanol para congelar rapidamente a amostra. Armazene a -80 °C até a criossecção.
    3. Usando um criostato, corte seções de 5-7 μm e armazene as lâminas a -80 °C.
  2. Imunocoloração
    1. Equilibre os slides em RT por 15 minutos dentro de um recipiente para evitar condensação.
    2. Enxágue os slides com PBS por 3 x 5 minutos.
    3. Incubar cada seção com 100 μL de solução bloqueante/permeabilização por 30 minutos em RT (0,1% de surfactante não iônico no PBS, com 5% de soro da espécie onde o anticorpo secundário foi elevado).
    4. Incubar cada seção com 50 μL de anticorpo primário diluído em solução bloqueante/permeabilização durante a noite a 4 °C.
    5. Enxágue os slides com PBS por 3 x 5 minutos.
    6. Incubar cada seção com 50 μL de anticorpos secundários diluídos em solução bloqueante/permeabilização por 1 hora na RT.
    7. Enxágue os slides com PBS por 3 x 5 minutos.
    8. Monte os ferrolhos com 15 μL de solução de montagem com DAPI e aplique um coverslip. Armazene a 4 °C no escuro até a imagem.

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Resultados

Os resultados apresentados correspondem ao transplante intramuscular de ilhéus SC de estágio 7 em camundongos imunodeficientes e a análise realizada 6 semanas após o transplante. Um número limitado de animais com enxertos representativos foi analisado para ilustrar a viabilidade do procedimento. Neste estudo, um resultado bem-sucedido é definido como a retirada macroscópica do enxerto intramuscular, seguida pela confirmação histológica da sobrevivência e ...

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Discussão

Neste protocolo, descrevemos o transplante intramuscular de ilhéus SC como uma abordagem direta, reproduzível e minimamente invasiva para maturação in vivo , com potencial para avaliação funcional. Embora o transplante sob a cápsula renal seja amplamente considerado o "padrão ouro" para o entrétimento de ilhotas ou ilhotas SC em roedores, requer maior expertise técnica e um procedimento cirúrgico mais longo. Em contraste, o local intramuscular oferece simplicidade procedimental ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Danwei Huangfu (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nova York, EUA) por fornecer generosamente as linhas de hPSC utilizadas neste estudo. Esse trabalho foi apoiado por bolsas PID2021-122284NA-I00 e CNS2023-145179 do Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha MICIU/AEI/10.13039/501100011033 e Next GenerationEU/PRTR (A.B.), e do CIBER-Consórcio para Pesquisa Biomédica em Rede, CB07/08/0029 e PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). O Centro de Pesquisa Biomédica em Diabetes e Distúrbios Metabólicos Associados (CIBERDEM) é uma iniciativa do ISCIII e parcialmente apoiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPT cocktail
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)SyncomCustom productGamma-secretase inhibitor
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT cocktail
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptCustom product
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich82184Used at 5% (w/v)
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT cocktail
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 Inhibitor
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGCell-permeable T3 analog
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT cocktail
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK inhibitor
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antibodies
Rat anti-Human C-peptide (insulin)DSHBGN-ID4-sUsed at 150 ng/mL
Mouse anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500

Referências

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