Artigo de método

Estabelecimento de uma trombose do seio sagital superior induzida por cloreto férrico modificado

379 vistas

⸱

DOI:

10.3791/69563

⸱

30 de dezembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital Capital Medical University

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta um protocolo para estabelecer um modelo reprodutível e minimamente invasivo em rato da trombose do seio sagital superior induzida por cloreto férrico, utilizando um método de sutura de seda em combinação com imagem de contraste de manchas a laser e ultrassom de alta resolução para avaliação.

Resumo

A trombose venosa cerebral (CVT) é um distúrbio neurológico raro, mas potencialmente fatal. Modelos animais oferecem plataformas críticas para investigar sua fisiopatologia e avaliar potenciais terapias. Neste estudo, apresentamos um modelo modificado de tronbose do seio sagital superior (SSS) em ratos, utilizando uma técnica de sutura embebida em FeCl₃. Ratos machos de Sprague-Dawley (220-250 g) passaram por uma incisão paramediana no couro cabeludo e a criação de uma janela óssea craniana de 1 cm sobre a SSS. Comparada à incisão tradicional na linha média, essa abordagem previne a adesão entre a pele incisa, a janela óssea e a dura-máter subjacente. Além disso, evita a interferência causada por nós de sutura localizados sobre o SSS, melhorando assim a qualidade da imagem por ultrassom. Um ponto de seda 2-0 embebido em 40% deFeCl 3 foi aplicado diretamente sobre o seio expuesto por dois intervalos consecutivos de 5 minutos. Comparado ao método tradicional depapel filtro FeCl 3, essa técnica minimiza o dano químico direto ao córtex parasagital. A imagem de contraste a laser de speckle foi empregada para avaliar a perfusão venosa cerebral antes e depois da aplicação do FeCl3 . Uma redução significativa no fluxo sanguíneo confirmou trombose bem-sucedida. Sete dias após a cirurgia, a formação do trombo e as alterações hemodinâmicas foram avaliadas por meio de ultrassom de alta resolução e analisadas usando o software Vevo LAB, que forneceu dados volumétricos e hemodinâmicos do trombo. Esse modelo modificado oferece uma abordagem reprodutível, minimamente invasiva e compatível com imagens para pesquisas pré-clínicas em TVC.

Introdução

A trombose venosa cerebral (CVT) é um tipo especial de doença cerebrovascular, responsável por 0,5-3% de todos os AVCs e sendo uma causa importante de AVC em adultosjovens 1. A mudança patológica central dessa doença é a trombose nos seios venosos durais e/ou nas veias cerebrais, que leva a drenagem venosa cerebral comprometida, causando subsequentemente aumento da pressão intracraniana, edema cerebral, infarto venoso ouhemorragia 2. Para elucidar melhor seus mecanismos subjacentes e avaliar novas intervenções terapêuticas, modelos animais confiáveis e reprodutíveis são indispensáveis. Considerando que o seno sagital superior (SSS) é o local mais frequentemente afetado e sua localização superficial facilita procedimentosoperacionais 2,3, os experimentos atuais em animais utilizam principalmente o modelo de trombose do seio sagital superior (SSST).

Entre vários métodos de modelagem, o método de indução cloreto férrico (FeCl3) tornou-se uma das técnicas mais amplamente utilizadas devido à sua simplicidade operacional ecusto-benefício 4. Neste modelo, a aplicação tópica de uma solução deFeCl 3 danifica diretamente o endotélio do seio venoso, expondo a matriz subendotelial por suas fortes propriedades oxidativas. Essa exposição ativa a agregação de plaquetas e a cascata de coagulação, induzindo finalmente trombose do seiovenoso 5. No entanto, comparado a outros métodos, o modelo tradicional de papel filtroFeCl 3 também apresenta várias desdesvans. A questão mais crítica é que as propriedades paramagnéticas e a alta suscetibilidade magnética do FeCl3 geram artefatos substanciais durante a ressonância magnética, comprometendo severamente a precisão da avaliação do trombo e da observação da recanalização do seiovenoso 6. Além disso, o formato do papel filtro não combina bem com o SSS, tornando-o propenso a lesões no parênquima cerebral ao redor do seio sinusal. Portanto, é difícil determinar se o dano parênquimatose ao redor da SSS resulta da trombose em si ou de uma lesão química direta causada pelo FeCl3.

O objetivo geral do presente trabalho é estabelecer um modelo modificado de rato SSST induzido porFeCl 3 que reduza a lesão cortical direta causada peloFeCl 3 e permita a avaliação do fluxo sanguíneo e do tamanho do trombo dentro do SSS. Este estudo introduz uma abordagem paramediana combinada com uma técnica de sutura embebida emFeCl 3, que minimiza a lesão química cortical direta causada peloFeCl 3 e possibilita o monitoramento em tempo real, não invasivo e quantitativo do fluxo sanguíneo do seio venoso e da formação de trombos usando ultrassom de alta resolução.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Experimentos e Bem-Estar Experimental de Animais da Capital Medical University com a Aprovação nº AEEI-2025-138. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento de um modelo modificado de SSST de rato induzido porFeCl 3

  1. Use ratos machos de Sprague-Dawley (SD) com idades entre 6 e 7 semanas, pesando entre 220 e 250 g para o experimento. Antes dos procedimentos cirúrgicos, aclimate os ratos por 1 semana e retenha a comida por 12 horas.
  2. Prepare os seguintes reagentes, instrumentos e equipamentos: solução pentobarbital 2%, solução 40% de FeCl3 , 5% de povidona-iodo, soro fisiológico normal, pomada oftálmica, lâminas de barbear descartáveis, bisturis, tesouras cirúrgicas, pinças, suturas de seda 2-0 e 4-0, agulhas reversas, suportes de agulhas, seringas de 1 mL e 5 mL, fitas médicas, plataforma de operação para roedores, almofada térmica com sonda de temperatura retal e uma microfuradeira craniana portátil.
  3. Após a pesagem, anestesie o rato por injeção intraperitoneal de pentobarbital a 2% (50 mg/kg) (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). Depois, belisque a pele do membro posterior com pinças para confirmar a ausência de abstinência e respostas à dor.
  4. Aplique pomada oftálmica e raspe os pelos do couro cabeludo do rato com uma lâmina descartável.
  5. Prenda o rato em posição deitada sobre uma plataforma de operação de roedores com fitas médicas, mantenha a temperatura corporal em 37 ± 0,2 °C com uma bolsa térmica e monitore continuamente a temperatura central com uma sonda retal.
  6. Desinfete o couro cabeludo com 5% de povidona-iodo.
  7. Faça uma incisão paramediana de 15 mm na pele no couro cabeludo e, em seguida, dissece de forma direta a fáscia e o periósteo subjacentes para expor totalmente o crânio.
  8. Afine o crânio com uma broca craniana até que o SSS fique claramente exposto, começando pelo lambda e estendendo-se 10 mm para frente ao longo da sutura sagital. Utilize uma técnica de perfuração intermitente para evitar danificar a dura-mátera subjacente e o SSS, e irrigue repetidamente a broca com soro fisiológico normal para evitar danos térmicos no córtex.
  9. Aplique um segmento de 10 mm de ponto de seda 2-0 embebido com solução 40% de FeCl3 sobre a superfície exposta do SSS por 5 minutos, depois substitua o ponto por um segmento recém-encharcado para mais 5 minutos de aplicação.
  10. Enxágue o campo cirúrgico com 0,5 mL de soro fisiológico normal três vezes para remover o FeCl3 residual.
  11. Feche a pele com pontos interrompidos usando sutura de seda 4-0, seguida de desinfecção com povidona-iodo.
  12. Observe o rato até estar totalmente acordado, depois o coloque de volta na gaiola.

2. Avaliação do estabelecimento bem-sucedido do modelo

NOTA: Durante o procedimento cirúrgico, LSCI foi usada para medir o fluxo sanguíneo venoso no SSS após a criação da janela craniana e antes da aplicação deFeCl 3 , e novamente após a aplicação deFeCl 3 e enxágue do campo cirúrgico, mas antes do fechamento da pele. O modelo é considerado estabelecido com sucesso quando o fluxo sanguíneo venoso na SSS apresenta uma diminuição significativa.

  1. Ligue o LSCI e o software correspondente (RFLSI v5.0) e então pressione o botão do modo online .
  2. Ajuste a altura e a posição do instrumento até que o laser indicador fique centralizado no campo de visão.
  3. Coloque o rato em uma plataforma de espuma e ajuste a posição até que o SSS se alinhe com o laser indicador.
  4. Ajuste a ampliação e o foco até que a imagem apareça claramente. Defina os limites inferior e superior do limiar de pseudocor em 10 e 200 para otimizar a aparência visual da imagem pseudocolorida.
  5. Pressione o botão Definir ROI , selecione a ferramenta circular e delinee a região SSS.
  6. Pressione o botão Gravar para obter o fluxo sanguíneo venoso e capturar imagens originais e pseudocoloridas.

3. Avaliação da área/volume do trombo e mudanças hemodinâmicas

NOTA: De vários dias a várias semanas após o procedimento, utilize ultrassom de alta resolução para avaliar alterações no trombo e recanalização vascular.

  1. Prepare os seguintes medicamentos, instrumentos e equipamentos: isoflurano, gel de ultrassom, lâminas de barbear descartáveis, fitas médicas, uma máquina de anestesia para pequenos animais, um sistema de ultrassom e imagem fotoacústica de alta resolução para pequenos animais, um transdutor de matriz linear UHF57x ultra-alta frequência de 70 MHz e um motor de aquisição 3D.
  2. Instale o motor de aquisição 3D e o transdutor UHF57x. Depois, inicialize o motor.
  3. Anestesie o rato em uma câmara de indução com isoflurano a 3% misturado com 1 L/min de oxigênio.
  4. Coloque o rato na posição deitada na placa de imagem termostática de 37 °C, com a cabeça e os membros suavemente fixados por fitas médicas, e mantenha a anestesia com 1,5%-2% de isoflurano através de um cone nasal.
  5. Raspe os pelos do couro cabeludo com uma lâmina descartável para expor a área de detecção e depois aplique gel de ultrassom.
  6. Ajuste a posição e orientação do rato em relação ao transdutor até que o SSS e o trombo intraluminal estejam claramente visualizados.
  7. Adquira imagens tomográficas sequenciais do SSS tanto no plano sagital quanto no coronal usando 3Dimaging em modo B com tamanho de passo de 0,04 mm.
  8. Use o modo Doppler colorido para observar o fluxo sanguíneo no SSS e, em seguida, aplique o modo Doppler de Onda Pulsada (PW) para medir a velocidade do fluxo sanguíneo.
  9. Interrompa a anestesia e devolva o rato à gaiola depois que ele estiver totalmente acordado.
  10. Exporte as imagens e analise-as usando o software Vevo LAB. Registre as áreas mais secionais sagital e coronal, e o volume do trombo no SSS, juntamente com a velocidade máxima do fluxo sanguíneo do seio sinusal.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O diagrama esquemático do modelo modificado de SSST induzido por FeCl3 é mostrado na Figura 1. Resultados experimentais demonstraram que, após a aplicação da sutura de seda saturada com FeCl3 ao SSS, o LSCI detectou uma redução significativa no fluxo sanguíneo local, indicando oclusão bem-sucedida do seio venoso e confirmando a sensibilidade do LSCI para detectar mudanças dinâmicas de perfusão (Figura 2). N...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A CVT é um tipo específico de doença cerebrovascular incomum, mas potencialmente fatal1. Para investigar mais a fundo seus mecanismos patológicos e desenvolver estratégias eficazes de intervenção, os pesquisadores estabeleceram vários modelos animais de SSST, incluindo principalmente a ligadura ou oclusão deSSS 7,8,9, injeção de substância protromb...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82401527).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL de seringaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3020
Suturas de seda 2-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdA224
Motor de aquisição 3DFujifilm VisualSonicshttps://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor
Suturas de seda 4-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdA222
5% povidona-iodoShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/100.html
Seringa de 5 mLShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3023
Lâmina de barbear descartávelDongyang Jinmin Trading Co., Ltd.ST300
FeCl3MacklinI811935
Bolsa térmicaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.36-0001
IsofluranoCiências da Vida RWDR510-22-10
Sistema de imagem a laser de specklesCiências da Vida RWDRFLSI III
Transdutor de matriz linearFujifilm VisualSonicsUHF57x
Fita médicaSuzhou Konlida Medical Supplies Co., Ltd.B02
Micro broca craniana portátilCiências da Vida RWD78001
Suporte de agulhaCiências da Vida RWDF31025-13
Soro fisiológico normalShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST341-500ml
Pomada oftálmicaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.19-7223
Agulhas de corte reversoShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdTJ-3-514
Plataforma de operação para roedoresShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.30150
Lâmina do bisturiCiências da Vida RWDS31015-01
Cabo de bisturiCiências da Vida RWDS32003-12
Máquina de anestesia para pequenos animaisCiências da Vida RWDR500
Sistema de ultrassom e imagem fotoacústica para pequenos animaisFujifilm VisualSonicsVevo F2
Pinça lisaCiências da Vida RWDF12013-10
Pentobarbital de sódioSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.P3761
Tesoura CirúrgicaCiências da Vida RWDS14014-10
Pinças DentadasCiências da Vida RWDF12011-13
Gel de ultrassomShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/230.html

Referências

  1. Saposnik, G., et al. Diagnosis and management of cerebral venous thrombosis: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 55 (3), e77-e90 (2024).
  2. Cohen, O., Pegoraro, S., Ageno, W. Cerebral venous thrombosis. Minerva Med. 112 (6), 755-766 (2021).
  3. Li, M., Chen, J., Meng, R., Ji, X. Rhythmic deep-brain magnetic stimulation promotes angiogenesis and inhibits apoptosis by regulating the JAK2/STAT3 pathway in rats with superior sagittal sinus thrombosis. Brain Res. 1852, 149509(2025).
  4. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  5. Schoenwaelder, S. M., Jackson, S. P. Ferric chloride thrombosis model: unraveling the vascular effects of a highly corrosive oxidant. Blood. 126 (24), 2652-2653 (2015).
  6. Hachenberger, M., et al. Aluminium chloride instead of ferric chloride for inducing superior sagittal sinus thrombosis to reduce ferromagnetic artifacts on MRI imaging in experimental models. Sci Rep. 14 (1), 10998(2024).
  7. Gotoh, M., Ohmoto, T., Kuyama, H. Experimental study of venous circulatory disturbance by dural sinus occlusion. Acta Neurochir (Wien). 124 (2-4), 120-126 (1993).
  8. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  9. Fries, G., et al. Occlusion of the pig superior sagittal sinus, bridging and cortical veins: multistep evolution of sinus-vein thrombosis. J Neurosurg. 77 (1), 127-133 (1992).
  10. Wang, J., Ji, X., Ling, F., He, X. Comparison of anticoagulation and thrombolysis treatments in a rat model of superior sagittal sinus thrombosis. Int J Neurosci. 124 (7), 532-541 (2014).
  11. Ye, Y., et al. Impacts on thrombus and chordae Willisii during mechanical thrombectomy in the superior sagittal sinus. Front Neurol. 12, 639018(2021).
  12. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306, 39-49 (2015).
  13. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  14. Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
  15. Srivastava, A. K., Kalita, J., Haris, M., Gupta, R. K., Misra, U. K. Radiological and histological changes following cerebral venous sinus thrombosis in a rat model. Neurosci Res. 65 (4), 343-346 (2009).
  16. Wang, W., et al. Establishment of a rat model of superior sagittal-sinus occlusion and recanalization via a thread-embolism method. Neuroscience. 416, 41-49 (2019).
  17. Hachenberger, M., et al. Comparison of edoxaban and enoxaparin in a rat model of AlCl3-induced thrombosis of the superior sagittal sinus. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 396 (12), 3887-3892 (2023).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Trombose por Cloreto F rricoTrombose Venosa CerebralModelo de Trombose em RatosImagem por Laser SpeckleUltrassom de Alta Resolu oForma o de TromboMedi o do Fluxo Sangu neoImagem TridimensionalDoppler de Onda Pulsada

Artigos relacionados