Perfilamento RNA-seq de linfonodos drenantes e metastáticos em câncer de mama HER2-positivo identifica o POSTN como marcador prognóstico

Resumo

Revelamos um programa centrado em matriz extracelular e PI3K-AKT subjacente à disseminação dos linfonodos no câncer de mama HER2-positivo e identificamos o POSTN como um marcador de prognóstico ruim, apoiando a estratificação de risco e estratégias terapêuticas orientadas por vias.

Resumo

O câncer de mama HER2-positivo é clinicamente agressivo e frequentemente se dissemina para os linfonodos regionais, mas os programas transcriptômicos associados à disseminação dos linfonodos permanecem incompletamente definidos. Aqui, perfilamos linfonodos que drenam tumores (TDLN) e linfonodos envolvidos tumoralmente metastáticos (TMLN) de seis pacientes com câncer de mama HER2-positivo, utilizando sequenciamento de RNA (RNA-seq). A análise diferencial de expressão foi realizada com DESeq2, aplicando correção de Benjamini-Hochberg (FDR < 0,05) e um limiar absoluto de variação de dobra log2 (|log2FC| ≥ 1). Identificamos 237 genes diferencialmente expressos (182 com regulação positiva e 55 com regulação negativa em TMLN vs. TDLN). Análises de enriquecimento funcional destacaram a interação matriz extracelular (ECM) e receptor, sinalização PI3K-AKT, adesão focal e metabolismo do colesterol como vias proeminentes associadas aos linfonodos metastáticos, sugerindo remodelação coordenada da ECM e ativação da sinalização durante a disseminação nodal. Entre os genes mais aumentados, o POSTN emergiu como um candidato-chave e foi ainda associado a características clinicopatológicas adversas. Em uma coorte independente de validação (n = 120), uma expressão mais alta de POSTN esteve associada a uma sobrevivência livre de doença inferior. Coletivamente, esses resultados indicam o POSTN como um potencial biomarcador prognóstico e apoiam mecanismos centrados em ECM e relacionados ao PI3K-AKT como características biológicas acionáveis da metástase linfânica no câncer de mama HER2-positivo.

Introdução

O câncer de mama (BC) é o câncer mais frequentemente diagnosticado em mulheres e uma das principais causas de mortalidade por câncer no mundo, com uma carga substancial e crescente na China^. Aproximadamente 15%-20% dos contraceptivos são HER2-positivos (HER2+), caracterizados por amplificação/superexpressão de ERBB2 e fenótipo agressivo com riscos maiores de recidiva e^{morte 2,3}. Embora a terapia sistêmica anti-HER2 tenha melhorado significativamente os resultados, uma proporção considerável de pacientes ainda recae ou desenvolve metástases, ressaltando a necessidade de estratificação de risco biologicamente informada e novas opções^{terapêuticas 4}.

A metástase linfonodal (LNM) é um determinante fundamental do estadiamento, seleção do tratamento adjuvante e prognóstico na BC; O envolvimento axilar prenuncia uma sobrevivência inferior e facilita a disseminação adicional para órgãos^{distantes 5,6}. No entanto, biomarcadores robustos que capturam a biologia da disseminação linfonodal na doença HER2+ continuam limitados, e os fatores clínicopatológicos atuais explicam apenas parcialmente a heterogeneidade dos^{resultados 7}.

Avanços no RNA-seq permitem o perfilamento em todo o transcriptoma e alta faixa dinâmica, sendo amplamente adotados na oncologia^{translacional 8}. No entanto, a maioria dos estudos de expressão em HER2+ BC foca em tumores primários ou coortes não emparelhadas, enquanto o perfil comparativo de linfonodos drenadores tumorais (TDLN) e linfonodos tumorais metastáticos (TMLN) é escasso, limitando o conhecimento sobre os programas moleculares que fundamentam a colonização e progressão dos gânglios⁹.

Com base na importância clínica da metástase dos gânglios linfáticos e nas evidências prévias que implicavam remodelação da matriz extracelular (ECM) e ativação do PI3K-AKT na semeadura^{metastática 10}, hipotetizamos que, dentro do mesmo paciente, os linfonodos tumor-metastáticos (TMLN) apresentariam um programa transcriptômico distinto em comparação com os linfonodos que drenam tumores (TDLN) correspondentes, e que um subconjunto de genes associados à ECM consistentemente aumentados estaria ligado a características clinicopatológicas adversas e Risco de recidiva. Para testar essa hipótese, perfilamos TDLN e TMLN pareados de seis pacientes positivos para HER2 para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs) e vias associadas à disseminação nodal. Em seguida, priorizamos o POSTN e avaliamos sua relevância prognóstica em uma coorte independente, vinculando a remodelação de ECM e a sinalização PI3K-AKT à estratificação de risco clinicamente útil no câncer de mama HER2+. Detalhes da avaliação HER2 (de acordo com os critérios contemporâneos ASCO-CAP), controle de qualidade do sequenciamento, chamada DEG com controle DESeq2 e Benjamini-Hochberg FDR, e procedimentos de validação são fornecidos^{aqui 11,12}.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional e realizado de acordo com a Declaração de Helsinque e as regulamentações locais que regem o uso de bioamostras humanas. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Boai de Zhongshan (KY-2020-012-124). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes de qualquer procedimento específico do estudo.

Coortes de estudo e amostras
A coorte de descoberta foi composta por tecidos pareados de linfonodo drenante tumoral (TDLN) e linfonodo metastático (TMLN) coletados intraoperatório de 6 pacientes com câncer de mama HER2-positivo. Para cada paciente, o TDLN compatível foi definido como um linfonodo drenante sem evidência histológica de metástase e serviu como comparador controle dentro do paciente, enquanto o TMLN era tecido metastático confirmado por patologia. Tecidos frescos foram brevemente enxaguados em soro salino frio tamponado com fosfato (PBS), secados com secagem, congelados rapidamente em nitrogênio líquido dentro de 30 minutos após a excisão e armazenados a -80 °C até a extração. Os critérios de inclusão foram carcinoma invasivo de mama patologicamente confirmado, status HER2-positivo por ASCO/CAP, disponibilidade de linfonodos pareados e ausência de terapia neoadjuvante. Os critérios de exclusão foram número inadequado de integridade do tecido ou RNA (RIN) < 7,0. Uma amostra inicialmente triada falhou no QC devido ao RIN < 7,0 e foi excluída, então todas as análises de descoberta usam consistentemente n = 6. A coorte independente de validação compreendia 120 amostras arquivadas de linfonodos FFPE com acompanhamento clínico e foi utilizada para qRT-PCR e análises de desfechos. Para modelagem prognóstica, os pacientes foram comparados por grupos de expressão POSTN (Alto vs. Baixo, com ponto de corte determinado por X-tile), com o grupo Baixo servindo como comparador de referência. Casos com acompanhamento ausente ou covariáveis incompletas foram excluídos da modelagem prognóstica.

Justificativa do tamanho da amostra (Descoberta e validação)
A fase de descoberta utilizou um desenho pareado TDLN-TMLN para maximizar o contraste dentro do paciente e reduzir a variância entre indivíduos, controlando a multiplicidade em FDR = 0,05. Para a coorte de validação (n = 120), a expressão do POSTN foi dicotomizada no ponto de corte determinado pelo X (Alto/Baixo = 40/80). Dadas 48 eventos de sobrevivência livre de doença (DFS) e α = 0,05, uma aproximação de Schoenfeld indica ≥ 80% de poder para detectar razões de risco clinicamente relevantes de aproximadamente HR ≥ 2,3 sob alocação igual; isso é consistente com o tamanho do efeito observado (HR = 2,31, IC 95% 1,41-3,77).

Definição de positividade HER2
A positividade do HER2 seguiu os critérios^{contemporâneos ASCO/CAP 13}: imunohistoquímica (IHC) 3+ definida como coloração uniforme intensa de membrana em >10% das células tumorais, ou hibridização in situ amplificada (ISH) definida como uma razão HER2/CEP17 ≥2,0 com um número médio de cópias HER2 ≥4,0 sinais por célula. Os resultados do IHC 2+ passaram por reflexo ISH com recontagem cega de ≥20 células tumorais invasivas para confirmar o status de amplificação.

Processamento de tecidos e isolamento de RNA
Todos os procedimentos foram realizados no gelo, salvo especificação específica, utilizando consumíveis livres de RNase. Para cada amostra com ≤ tecido de 100 mg, a homogeneização foi realizada em 1 mL de reagente ácido de tiocianato de guanidinium-fenol-clorofórmio (AGPC), seguida pela adição de 200 μL de clorofórmio com 15 s de mistura vigorosa e incubação em temperatura ambiente de 2 a 3 minutos. A separação de fases foi alcançada por centrifugação a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. A camada aquosa foi então transferida para um tubo fresco, e o RNA foi precipitado com 500 μL de isopropanol após uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente. A granulação foi concluída a 12.000 x g por 10 minutos a 4 °C. O pellet foi lavado com 1 mL de etanol a 75% e centrifugado a 7.500 x g por 5 minutos a 4 °C, seco ao ar por 5-10 minutos e dissolvido em água sem RNase. Uma digestão de DNase I na coluna foi usada quando se suspeitava de transferência genômica de DNA. Os pontos de verificação visuais incluíram separação clara de fases após extração do clorofórmio e um pellet translúcido intacto após a precipitação de isopropanol. A solução de problemas incluía repetir a lavagem com etanol para baixas proporções A260/230 e estender a precipitação ou garantir resfriamento durante a pelletagem para baixos rendimentos.

Controle de qualidade de RNA
A quantificação utilizou espectrofotometria para monitorar A260/280 e A260/230 com alvos em torno de 1,8-2,1, complementados por medições fluorométricas para precisão. A integridade foi avaliada em um sistema de eletroforese microfluídico e exigiu RIN ≥ 7,0. Picos distintos de rRNA 18S/28S e a ausência de um esfregaço genômico de DNA foram usados como critérios de aceitação; Os limiares de falha das amostras foram reextraídos ou excluídos.

Preparação da biblioteca
Bibliotecas de mRNA em cadeado foram construídas com seleção poli(A) para RNA intacto, enquanto a depleção do rRNA foi permitida para entradas parcialmente degradadas. A entrada típica era ≥ 1 μg de RNA total por biblioteca. A fragmentação foi realizada perto de 94 °C por 8 minutos; síntese de cDNA da primeira fita a 50 °C por 50 minutos; síntese de segunda cadeia a 16 °C por 60 minutos; ligação de adaptador a 20 °C por 15 minutos; e a amplificação por PCR usava 10-12 ciclos ajustados para evitar superamplificação. As limpezas empregaram razões de esferas próximas de 0,8x-1,0x, e a distribuição esperada do tamanho da biblioteca era de 300 pb, incluindo adaptadores. A qualidade da biblioteca foi verificada por eletroforese microfluídica; A contaminação por adaptadores e dímeros levou a uma limpeza mais rigorosa, e distribuições excessivamente amplas de tamanho foram corrigidas encurtando modestamente a fragmentação.

Sequenciamento
As bibliotecas indexadas foram sequenciadas no modo de ponta pareada de 150 bp (PE150), com o objetivo de 30 milhões de pares de leitura por biblioteca. A qualidade em nível de execução exigia Q30 ≥ 90% e densidades estáveis de cluster com viés mínimo de faixa. Bibliotecas foram randomizadas entre faixas para mitigar efeitos em lote, e rodar registros, documentar as atribuições de faixas e quaisquer controles sentinela usados para monitorar contaminação cruzada.

Análise computacional e expressão diferencial
As análises foram realizadas em R (v4.3.2) no Linux. A qualidade bruta da leitura foi avaliada com o FastQC (v0.11.9). O ajuste de adaptadores e de qualidade foi realizado com fastp (v0.23.4) usando detecção automática de adaptador, corte deslizante de janelas (tamanho da janela 4 bp; médio Phred Q ≥ 20), comprimento mínimo de leitura de 50 bp e corte poli-G quando as químicas relevantes foram detectadas. As leituras foram alinhadas ao genoma de referência GRCh37/hg19 usando HISAT2 (v2.2.1) com parâmetros de fita apropriados para a biblioteca e índices conhecidos do sítio de emenda. Contagens em nível de gene foram geradas com featureCounts (Subread v2.0.3) contra o GENCODE v19 usando contagem de extremidades pareadas, tratamento de leitura quimérica, configurações conscientes de múltiplos mapeadores e a flag correta de fiação. Genes de baixa contagem foram filtrados exigindo contagens ≥ 10 em pelo menos três amostras. A análise de expressão diferencial (DE) foi realizada usando DESeq2 (v1.40.2) sob um desenho pareado (projeto = ~ par + condição) para comparar TMLN versus TDLN, com normalização padrão do fator de tamanho e encolhimento de variação de dobra-log2 via apeglm. Os potenciais valores fora da curva foram avaliados usando a distância de Cook. A multiplicidade em todo o transcriptoma foi controlada usando a taxa de falsas descobertas de Benjamini-Hochberg (FDR). A significância foi definida como FDR < 0,05 e um limiar absoluto de variação de dobra log2 (|log2FC|) ≥ 1. A estrutura binomial negativa do DESeq2 fornece modelagem adequada de média-variância para dados de contagem e estabiliza estimativas de variação de dobras em coortes pequenas a moderadas. Como análises de sensibilidade, reexecutamos testes de DE usando edgeR e limma-voom com os mesmos critérios de filtragem e limiares FDR, o que gerou sinais concordantes de topo classificado, apoiando a robustez das principais escolhas de análise.

Enriquecimento funcional (GO e KEGG)
A anotação funcional foi realizada em R usando clusterProfiler (v4.8.3). DEGs regulados para alta e para baixo foram analisados separadamente. Identificadores gênicos foram mapeados para IDs de genes Entrez (organismo: Homo sapiens) antes do enriquecimento. O enriquecimento da Ontologia Gênica (GO) foi realizado usando o enrichGO (OrgDb: org. Hs.eg.db; ont = BP/CC/MF; pAdajustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05), e o enriquecimento da via KEGG foi realizado usando enrichKEGG (organism = "has"; pAdajustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05). O universo de fundo foi definido como todos os genes expressos retidos após filtragem de baixa contagem na análise de DE. Os termos enriquecidos foram adicionalmente filtrados para manter conjuntos de genes com 10-500 genes anotados (minGSSize = 10; maxGSSize = 500). Visualizações foram geradas usando ggplot2 (v3.5.1) e ComplexHeatmap (v2.16.1), incluindo pontos gráficos da razão gênica e valores de -log10 (P ajustado); o termo "vias de resposta imunológica" refere-se a módulos GO curados que abrangem processamento e apresentação de antígenos, sinalização de interferônio e ativação de linfócitos.

Interrogatório de banco de dados externo
Genes candidatos foram interrogados em recursos externos para fornecer contexto ortogonal. A expressão tumor versus mRNA normal foi consultada usando GEPIA2 (v2.0) com amostras de tumor do carcinoma invasivo de mama TCGA (TCGA-BRCA) comparadas com tecidos mamários normais (normais GTEx/TCGA, conforme disponível). Os valores de expressão reportados pelo GEPIA2 (log2[TPM+1]) e sua estrutura estatística padrão para comparações de grupos foram usados para gerar boxplots e valores P para cada gene consultado. A localização em nível de proteína foi avaliada usando o Atlas de Proteínas Humanas (HPA), revisando imagens e anotações imunohistoquímicas do Atlas de Tecidos e do Atlas de Patologia para tecido/câncer de mama, registrando a intensidade de coloração relatada e o compartimento celular (por exemplo, estromal vs epitelial) quando disponíveis.

Validação qRT-PCR
Tecidos linfânicos independentes foram processados como acima para extrair RNA total, e o cDNA foi sintetizado a partir de 1 μg de RNA em reações de transcrição reversa de 20 μL. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada usando química baseada em SYBR, com cada reação contendo 1x mistura master e 0,2-0,4 μM de cada primer. A especificidade do primer foi confirmada por perfis de curva de fusão de pico único, e a eficiência de amplificação foi avaliada usando curvas padrão em série de diluição, com eficiências aceitáveis definidas como 90%-110%. Cada amostra foi analisada em triplicado técnico; as réplicas deveriam atender a um SD de limiar de ciclo (Ct) ≤ 0,3. A expressão gênica foi normalizada para GAPDH (ou outro gene de referência validado, quando aplicável), e a expressão relativa foi calculada usando o método 2^-ΔΔCt. A normalidade foi avaliada usando testes de Shapiro-Wilk; comparações entre grupos usaram testes t bilaterais para dados aproximadamente normais ou testes Mann-Whitney U de outra forma.

Análise prognóstica na coorte de validação
A sobrevivência livre de doença (DFS) foi o principal desfecho e foi calculada desde a data da cirurgia até o primeiro evento documentado de recidiva ou último acompanhamento (censurado). Para a análise primária, a expressão do POSTN foi dicotomizada no ponto de corte determinado pelo X (Alto vs Baixo = 40/80); Análises de sensibilidade usaram pontos de corte alternativos, como tertéis. Curvas de Kaplan-Meier e testes de log-rank foram usados para comparações univariáveis. Modelos de risco proporcional de Cox multivariados foram adequados para estimar razões de risco (HRs) e intervalos de confiança de 95%, ajustando a priori para idade, tamanho do tumor, status lântuo, grau histológico e status dos receptores. A suposição de riscos proporcionais foi avaliada usando resíduos de Schoenfeld, a colinearidade foi examinada usando fatores de variância-inflação, e observações influentes foram avaliadas usando dfbetas. Análises completas de casos foram realizadas após exclusão de casos com acompanhamento ausente ou covariáveis incompletas, conforme descrito acima.

Estatísticas gerais e relatórios
Salvo indicação em contrário, os dados são resumidos como média ± DS ou mediana (IQR), testes bilaterais são usados e p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo. Para análises e enriquecimento em todo o transcriptoma, a multiplicidade é controlada com BH-FDR, e os tamanhos dos efeitos são acompanhados por intervalos de confiança de 95% sempre que possível.

Segurança e descarte de resíduos
Reagentes de fenol-guanidinio e solventes orgânicos foram manuseados em uma exaustão certificada com jalecos laboratoriais, luvas de nitrilo e proteção contra respingos. Resíduos orgânicos e halogenados foram segregados em recipientes rotulados e descartados de acordo com as políticas institucionais. Resíduos biológicos foram autoclavados ou desinfetados quimicamente antes do descarte, e superfícies e ferramentas foram descontaminadas com soluções inativadoras de RNase. Riscos específicos do reagente, como corrosividade e toxicidade, foram documentados em procedimentos padrão de laboratório e observados durante todos os procedimentos.

Resultados

Coortes e características clinicopatológicas
A coorte de descoberta consistiu em 6 amostras pareadas de TDLN/TMLN, e a coorte de validação compreendia 120 amostras arquivísticas de linfonodos com acompanhamento longitudinal. As características clinicopatológicas de base para ambas as coortes, incluindo idade, tamanho do tumor, grau, status receptor e status nodal, estão resumidas na Tabela 1.

Qualidade do sequenciamento e estrutura global de dados

Discussão

O câncer de mama HER2-positivo é caracterizado por aumento da invasividade, frequentes metástases linfânicas (LNM) e desfechos inferiores, apesar da terapia sistêmica^{moderna 15}. Fatores clinicopatológicos convencionais explicam apenas parcialmente o prognóstico nesse subtipo, deixando uma lacuna para marcadores biologicamente fundamentados que capturam o risco de disseminação^{nodal 16}. Ao perfilar comparativamente os linfonodos dren...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bioanalisador	2100-BA	Agilent, EUA	Equipamentos para avaliação da integridade e controle de qualidade do RNA.
DESeq2	N/A	R Biocondutor	Software de análise de expressão diferencial para dados de RNA-seq.
FastQC Software	N/A	Babraham Bioinformática	Software de controle de qualidade para dados RNA-seq para avaliar a qualidade da sequência.
Linha Celular HEK293	ATCC-CRL-1573	ATCC, EUA	Linha celular embrionária de rim humana usada em experimentos de transfecção.
Kit qRT-PCR	4385616	ThermoFisher, EUA	Kit quantitativo de PCR para validação da expressão gênica.
Kit de Extração de RNA	74204	Qiagen, Alemanha	Kit de extração de RNA usado para isolar RNA de alta qualidade de amostras de tecido.
Kit de Sequenciamento de RNA	RS-122-2001	Illumina, EUA	Kit de preparação de biblioteca de RNA para sequenciamento de amostras de RNA.
Plataforma de Sequenciamento	NovaSeq 6000	Illumina, EUA	Plataforma de sequenciamento de RNA de alto rendimento para sequenciamento de bibliotecas de RNA.
Equipamentos de Congelação de Tecidos	TFE-300	Thermo Fisher, EUA	Equipamentos para congelar amostras de tecido em nitrogênio líquido.
Termômetro Timpânico	55678-TT	ThermoScience, Japão	Termômetro preciso usado para medição da temperatura corporal.