Padronização do Modelo MCAO Intraluminal de Rato: Um Protocolo Detalhado com Medidas de Controle de Qualidade

Resumo

Este protocolo demonstra uma técnica otimizada de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de 60 minutos em ratos. O protocolo é validado usando abordagens multimodais, alcançando uma taxa de sucesso de 87,5% com mortalidade mínima e gerando desfechos reprodutíveis de infarto e comportamental para pesquisas em AVC.

Resumo

O modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) do rato permanece como padrão de referência para elucidar a fisiopatologia do AVC isquêmico e validar terapias neuroprotetoras. Desvios cirúrgicos sutis, no entanto, podem alterar profundamente o volume do infarto e os resultados comportamentais. Usando uma estrutura de "visualizar e depois sistematizar", reexaminamos cada etapa do estabelecimento e validação do modelo. Foi realizada documentação fotográfica detalhada dos principais marcos cirúrgicos e etapas críticas para padronizar a orientação anatômica e o posicionamento dos filamentos. A coloração com cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazólio (TTC) foi usada para mapear com precisão o volume e a topologia dos infartos às 24 horas e 72 horas após a reperfusão. Os déficits neurológicos foram classificados com as escalas Zea-Longa, Bederson e Garcia modificada. Vinte e quatro ratos machos de Sprague-Dawley passaram por MCAO transitório de 60 minutos; Volume do infarto e escores neurológicos foram avaliados às 24 horas e 72 horas. Aproximadamente 87,50% dos animais alcançaram bloqueio bem-sucedido do fluxo sanguíneo cerebral (Zea-Longa ≥ 1 e infarte definido pela TTC inequívoco), com mortalidade geral de 12,50%, atestando a alta fidelidade do modelo. Esse protocolo padronizado fornece uma base tecnicamente refinada e reprodutível para a pesquisa pré-clínica sobre AVC, facilitando a consistência interlaboratorial em estudos que investigam a fisiopatologia do AVC e intervenções terapêuticas.

Introdução

O AVC é a segunda principal causa de morte e a terceira principal causa de incapacidade no mundo ^1,2. O AVC afeta desproporcionalmente países de baixa e média renda, onde ocorre, em média, 15 anos antes do que em países de alta^{renda 1}. Os dois principais tipos são AVC isquêmico (85%) e hemorragia intracerebral (15%⁾³. O AVC isquêmico, responsável pela grande maioria dos AVCs, resulta de bloqueio do fluxo sanguíneo cerebral, levando à morte celular e infarto^{cerebral 4}. A cascata isquêmica envolve múltiplos eventos bioquímicos, incluindo processos pró-oxidativos^{significativos 5,6}.

Apesar dos extensos esforços pré-clínicos e clínicos, apenas um punhado de terapias — notadamente a trombólise intravenosa com ativador de plasminogênio tecidular e trombectomia mecânica — se mostraram eficazes, e esses tratamentos são limitados por janelas terapêuticas estreitas e critérios rigorosos de seleção de pacientes. Consequentemente, há uma necessidade urgente de elucidar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à lesão isquêmica, à reparação neurovascular e à recuperação pós-AVC. Um modelo animal reproduzível e clinicamente relevante é indispensável para alcançar esse objetivo.

O modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é amplamente utilizado para explorar o AVC isquêmico em^{roedores 7,8}. O método de oclusão intraluminal de filamentos é uma das técnicas MCAO mais clássicas e amplamente^{utilizadas 9}. Essa técnica pode modelar tanto oclusões permanentes quanto transitórias sem exigir craniectomia. Uma técnica transfemoral mais recente usando fios endovasculares mostrou potencial para induzir MCAO transitória em ratos, oferecendo desfechos mais^{consistentes 10}. Esse modelo envolve a oclusão da artéria cerebral média, tipicamente usando uma técnica de filamento^{intraluminal 11}. MCAO causa hipoperfusão cerebral focal, levando a isquemia e lesão por^{reperfusão 12}.

Embora o MCAO seja valioso para investigar a fisiopatologia do AVC e possíveis tratamentos, ele pode produzir volumes variáveis de^{lesão 7}. Portanto, melhorias no modelo MCAO — como o aprimoramento das técnicas de reperfusão, o estabelecimento de protocolos operacionais padronizados e o desenvolvimento de critérios unificados de avaliação — podem reduzir a variabilidade na localização e volume do infarto, aumentando assim sua utilidade na pesquisa do AVC isquêmico.

Esse protocolo exige uma curva de aprendizado de aproximadamente 10 a 15 cirurgias para obter resultados^{consistentes 13}. As taxas de sucesso podem variar com base na experiência do operador e na cepa^{do rato 14}. O modelo é adequado para estudar AVC isquêmico agudo, mas pode não replicar totalmente comorbidades humanas como hipertensão ou^{diabetes 15}. Assim, buscamos conceber e validar rigorosamente um protocolo MCAO otimizado que visasse reduzir a variabilidade experimental por meio de procedimentos padronizados e rigorosas medidas de controle de qualidade. Quatro inovações complementares foram integradas para alcançar ganhos duplos em padronização e confiabilidade dos dados: (1) Avaliação longitudinal em pontos de tempo duplos — escores neurológicos das escalas Zea-Longa, Bederson e Garcia Modificada foram obtidos em paralelo com volumes de infarto derivados do cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazólio (TTC) às 24 horas e 72 horas após a reperfusão, delineando a relação temporal entre resolução do edema e recuperação funcional; (2) Validação cruzada em três escalas — pontuação cega, com dois pesquisadores, com calibração integrada em três escalas aumentou significativamente a sensibilidade e precisão da avaliação comportamental; (3) Secção rápida hipotérmica em toda a extensão — foi estabelecido um procedimento operacional padrão (SOP) de "extração em banho de gelo de 90 s seguida de corte coronal de 2 mm em etapas únicas em moldes pré-refrigerados" para minimizar autólise e erro humano, garantindo medições volumétricas de alta fidelidade; (4) Estrutura integrada de controle de qualidade — uma SOP abrangente abrangendo jejum pré-operatório, controle de profundidade anestesiêmica, termorregulação pré-operatória e prevenção de contaminação cruzada foi construída para fornecer um procedimento operacional padrão MCAO reprodutível e facilmente transferível, estabelecendo uma base sólida para consistência interlaboratorial e comparabilidade entre estudos.

Protocolo

O experimento foi aprovado e supervisionado pelo Comitê de Experimentos Institucionais com Animais e Bem-Estar Experimental de Animais da Capital Medical University. Todos os protocolos estão em conformidade com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publ. 80-23, revisão de 1996), além de equipamentos estéreis e técnicas assépticas são necessários.

1. Seleção de animais

1. Use ratos machos de Sprague-Dawley (com idades entre 6 e 8 semanas, pesando 240–270 g) obtidos de um fornecedor certificado de animais de laboratório (Licença nº SCXK (Pequim) 2021-0011) para estabelecer um modelo de MCAO.
2. Abrigar os animais convencionalmente com comida e água ad libitum; todos os procedimentos seguiam o Código Internacional de Ética.
3. Use os seguintes critérios baseados no peso corporal do animal para a seleção do tamanho do filamento, garantindo uma oclusão consistente:
   - 220–250 g: 0,33–0,35 mm de diâmetro
   - 250–280 g: 0,35–0,38 mm de diâmetro
   - 280–310 g: 0,38–0,40 mm de diâmetro
   NOTA: Essas especificações consideram aumentos relacionados à idade no diâmetro do vaso e reduzem a incidência de SAH ou oclusão^{incompleta 13}.

2. Tamanho da amostra

1. Calcule o tamanho da amostra usando um software de cálculo de tamanho. Com base em dados preliminares que mostram um volume esperado de infarto de 35% ± 10% (média ± DS) no grupo MCAO versus 0% ± 2% no grupo SHAM, estime-se um tamanho de efeito (d de Cohen). Para um teste Mann-Whitney U de duas caudas (alternativa não paramétrica ao teste t), com α = 0,05 e potência (1-β) = 0,80, calcule um tamanho mínimo da amostra.
   NOTA: O tamanho do efeito foi estimado em 3,5 e o tamanho mínimo da amostra foi de 6 animais por grupo.
2. Para considerar a mortalidade prevista (12,5%) e a taxa de exclusão (5–10%), incluam 24 ratos no grupo MCAO e 6 ratos no grupo SHAM, fornecendo energia adequada (>0,90) para o desfecho primário (volume do infarto às 24 horas).

3. Critérios de inclusão e exclusão

1. Inclua os animais se atendessem aos seguintes critérios: (1) ratos machos de Sprague-Dawley, 240–270 g, 6–8 semanas de idade; (2) ausência de déficits neurológicos pré-existentes (pontuação neurológica pré-operatória = 0); (3) indução bem-sucedida da anestesia sem complicações.
2. Exclua animais da análise se apresentassem: (1) hemorragia subaracnoidiana (SAH) evidente na necropsia; (2) morte prematura (<24 h após a reperfusão) não relacionada à intervenção experimental; (3) falha na oclusão (escore neurológico = 0 e ausência de infarte definido pela TTC); (4) falha cirúrgica técnica (por exemplo, ruptura do CCA).
   NOTA: Esses critérios foram pré-especificados antes do início do estudo para minimizar o viés de seleção.
3. Política de substituição animal: Substituir apenas animais excluídos devido a falha cirúrgica técnica ou morte intraoperatória para manter o poder estatístico. Não substitua animais por modelagem malsucedida (oclusão falhada), mas reporte-os como parte do cálculo da taxa de sucesso para evitar reduzir artificialmente a variabilidade.

4. Preparações pré-cirúrgicas

1. Prepare ferramentas autoclave, filamento estéril e um campo drapeado.
2. Não é necessário jejum rotineiro; Quando necessário, limite a duração do jejum a 2–4 horas. Induza anestesia com isoflurano (3–4%) e mantenha-a em 1,5–2% em 30–40% de O₂ durante o procedimento. Confirme a profundidade da anestesia pela perda do reflexo de endireitamento e do beliscão do dedo do pé.
3. Mantenha a temperatura corporal em 37 ± 0,5 °C usando uma almofada térmica controlada por feedback e monitoramento da temperatura retal.
4. Raspe o pescoço e o couro cabeludo, depois limpe a área com povidona-iodo, seguido de 70% de etanol.
5. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg, subcutânea) 30 minutos antes da cirurgia e a cada 12 horas pós-operatórias por 48 horas, ou meloxicam (1 mg/kg, subcutâneo) uma vez ao dia por 3^{dias e 16}. Avaliar a dor monitorando o comportamento de tosa, postura e atividade espontânea; Administre analgesia adicional caso os sinais de desconforto persistam.

5. Oclusão do MCA

1. Coloque o rato em posição dorsal deitada com a cabeça suavemente estendida para expor o pescoço ventral.
2. Faça uma incisão cervical na linha média (1,5–2,0 cm) usando tesoura de íris.
3. Separe de forma direta os músculos esternomastoide e omohióide usando pinças curvas para expor a bifurcação da artéria carótida comum esquerda (CCA).
4. Liga a artéria carótida externa (ECA) distalmente com um ponto permanente de seda 4-0 e proximalmente com uma ligadura temporária. Crie uma pequena incisão entre as duas ligaduras ECA usando microtesoura.
5. Ocluir temporariamente a ACC e a artéria carótida interna (ICA) usando grampos microvasculares (pressão de 60 g).
6. Insira um monofilamento revestido de silicone 4-0 (0,35–0,40 mm de diâmetro) através da incisão ECA. Avance retrogradamente para o CCA, depois redirecione-o para o ICA além da bifurcação do CCA.
   NOTA: Certifique-se de que o filamento entre na ACI em direção à base craniana, e não à artéria pterigopalatina (PPA), que se ramifica lateralmente. Se houver resistência em <10 mm, retrair o filamento, girar a cabeça do animal 30° em direção ao lado contralateral e avançar novamente para redirecionar além da origem PPA.
7. Avance o filamento 18–20 mm a partir da bifurcação CCA até que uma leve resistência indique oclusão da origem MCA. Verifique a profundidade usando a linha de referência pré-marcada no filamento (posicionada 2 mm proximal ao tampão de silicone), medida com um calibre a partir do ponto de inserção do coto ECA. Solte a grampa CCA assim que o filamento estiver no lugar.

6. Reperfusão

1. Após 60 minutos de oclusão, reabra a incisão e afrouxe a ligadura temporária da ECA.
2. Retire suavemente o filamento até que a ponta passe pelo coto do ECA, restaurando assim o fluxo sanguíneo. Coloque prontamente uma ligadura permanente próxima ao coto para evitar sangramentos nas costas. Feche o ferimento em camadas.
3. Transfira o rato para uma gaiola de recuperação aquecida para monitoramento contínuo.

7. Cirurgia simulada

1. Prepare o animal seguindo o mesmo procedimento descrito acima para MCAO (jejum, anestesia, controle de temperatura, drapeamento estéril).
2. Realize incisão cervical e exposição à bifurcação CCA conforme acima.
3. Dissecar e expor o recipiente. Não insira o filamento.
4. Deixe as artérias permanecerem patentes; Não induza isquemia cerebral.
5. Feche a incisão em camadas após 10 minutos de exposição. Transfira o animal para uma gaiola de recuperação aquecida para monitoramento.

8. Escores neurológicos pós-operatórios

1. Avalie às 24 e 72 horas após a reperfusão, imediatamente antes do sacrifício para a medição do volume do infarto.
2. Habitue o animal em um cômodo silencioso, 25 °C por 30 minutos.
3. Tenha dois investigadores independentes cegos para a alocação em grupo. Fazer com que cada investigador registre as pontuações em folhas separadas sem consulta; Qualquer diferença entre avaliadores ≥1 ponto desencadeia uma reavaliação.
4. Escalas (em ordem de administração): Realizar pontuação Zea-Longa¹⁷ (Tabela 1), Bederson¹⁸ (Tabela 2) e Garcia¹⁹ Modificada (Tabela 3), seguindo os protocolos mais recentes publicados para critérios consistentes.
5. Use a média dos dois observadores para análise estatística. Exclua dados de qualquer animal se as médias variarem em >10% e substitua por um novo sujeito.

9. Medição do volume do infarto cerebral

1. Às 24 e 72 horas após a reperfusão, anestesiar profundamente ratos com 5% de isoflurano. Confirme anestesia profunda pela perda do reflexo de endireitamento e da resposta de beliscão no dedo do pé, juntamente com respiração estável, antes de prosseguir.
2. Remova rapidamente o cérebro dentro de 90 segundos após a confirmação da anestesia profunda, enxágue com PBS gelado e corte em fatias coronais de 2 mm usando uma matriz cerebral de rato resfriada. Durante a fatiação, siga as seguintes precauções
   1. Mantenha todo o procedimento no gelo entre 0 e 4 °C; Colhe o cérebro em até 90 segundos e posicione-o plano em uma matriz pré-resfriada.
   2. Use uma lâmina afiada para fazer cortes simples e limpos para seções coronais precisas de 2 mm, coletando cada fatia em ordem rostro-caudal em PBS gelado.
   3. Limpe imediatamente a matriz e a lâmina com etanol a 75% entre os animais para evitar contaminação cruzada.
3. Após pré-aquecer 2% para tentar fazer 37 °C, mergulhe completamente as fatias e incube no escuro por 20 minutos, girando suavemente a cada 5 minutos a 20 minutos.
4. Pare a reação imediatamente enxaguando três vezes com PBS de 4 °C. Depois, coloque paraformaldeído a 4% a 4 °C durante a noite.
5. A 300 dpi, fotografe ambos os lados de cada fatia uma vez.
   1. Use iluminação fixa contra fundo branco para eliminar sombras e reflexos.
   2. Coloque as fatias planas sem sobreposição, e inclua uma barra de escala e um rótulo de identificação em cada quadro. Segure a câmera perpendicular às seções e mantenha a distância focal e o balanço de branco constantes durante todo o tempo.
6. Quantifique o volume do infarto usando o ImageJ.
   1. Importe a imagem de 300 dpi (formato RGB) e converta para escala de cinza de 8 bits (Tipo > Imagem > 8 bits).
   2. Aplique o auto-limiar do Otsu (Imagem > Ajustar > Limite Automático > selecionar Otsu) para separar o infarto (branco) do tecido viável (vermelho).
   3. Use a ferramenta de seleção livre para delinear o limite do hemisfério ipsilateral.
   4. Meça a área (Analise > Meça) e registre a contagem de pixels.
   5. Calcule o volume do infarto: Σ (área do infarto × espessura do corte [2 mm]) × (volume do hemisfério contralateral/volume do hemisfério ipsilateral), expresso como uma porcentagem do hemisfério contralateral.

10. Análise estatística

1. Apresente os dados como média ± desvio padrão (SD) ou mediana [intervalo interquartil], conforme apropriado.
2. Realize comparações entre grupos usando o teste t de Student não pareado ou o teste Mann-Whitney U para dados distribuídos de forma não normal.
3. Defina significância estatística em P < 0,05. Realize todas as análises utilizando um software de análise estatística apropriado.

Resultados

Os animais foram alocados aleatoriamente para grupos de sobrevivência pós-reperfusão de 24 h (n = 10) ou 72 h (n = 10) para a coloração terminal da TTC. Mais 4 ratos passaram pelo MCAO, mas morreram antes do desfecho previsto (taxa de mortalidade de 12,5%). O grupo SHAM compreendia n = 6. Assim, o número total de animais utilizados foi de 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

Os ratos passaram por MCAO de 60 minutos para induzir isquemia cerebral (Figura 1). A reperfusão foi iniciada removendo o filamento intraluminal e liberando a ligadura proximal na ECA. Entre os 24 ratos MCAO, 3 morreram em até 72 horas; um mostrou infarto extenso após a coloração post-mortem do engravidante dentro de 24 horas, enquanto o outro morreu por causas indeterminadas em 72 horas. Dois ratos adicionais foram excluídos devido à modelagem malsucedida (as escores neurológicas não atenderam aos critérios, e a coloração da TTC não revelou infarto). Assim, a taxa de mortalidade em 72 horas foi de 12,50%. Definimos o estabelecimento bem-sucedido do modelo como sobrevivência por 24 horas, mais um escore Longa de 1–3, e a taxa de modelagem bem-sucedida atingiu 87,50%.

A função neurológica foi avaliada às 24 e 72 horas após o início do AVC (antes da medição do volume do infarto). Três escalas mais comumente usadas relatadas na literatura — Zea-Longa, Bederson e Garcia modificada — foram empregadas para fornecer uma avaliação abrangente (Figura 2). Às 24 horas, os ratos (n = 20) obtiveram 2,02 ± 0,41 na escala Zea-Longa, 2,80 ± 0,41 na escala de Bederson e 8,15 ± 1,18 na escala Garcia modificada; esses déficits permaneceram pronunciados às 72 h (Zea-Longa: 1,65 ± 0,59; Bederson: 1,93 ± 0,38; Garcia modificado: 11.00 ± 1.34). O volume do infarto, expresso como porcentagem do hemisfério contralateral, foi de 37,61 ± 2,81% às 24 horas após o MCAO e diminuiu para 28,32 ± 4,18% às 72 horas.

Figura 1: Diagrama esquemático da fisiologia arterial cervico-cerebral esquerda e embolia da artéria cerebral média no rato. Diagrama esquemático de (A) anatomia arterial cervico-cerebral, (B) pré-inserção, (C) pós-inserção e (D) malposição do filamento na artéria pterigopala. CCA: artéria carótida comum; ICA: artéria carótida interna; ECA: artéria carótida externa; PPA: artéria pterigopalatina; MCA: artéria cerebral média. "Triângulo preto": o local da incisão; Linha azul: o filamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Medição do volume do infarto e avaliação neurocomportamental após oclusão da artéria cerebral em ratos. (A) Tentar engravidar as seções cerebrais. (B) O volume do infarto às 72 h é menor que o das 24 h. (C,D) As pontuações Zea-Longa e as pontuações de Bederson às 72 h são menores do que as das 24 h. (E) As pontuações Garcia modificadas às 72 h são maiores do que as às 24 h. ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Manifestação	Pontuação / pontos
Sem déficit neurológico	0
Membro anterior contralateral flexionado e aduzido durante a suspensão da cauda (déficit neurológico leve)	1
Circulação espontânea em direção ao lado contralateral enquanto rastejo (déficit neurológico moderado)	2
Cair para o lado contralateral ao estar em pé ou caminhar	3
(déficit neurológico severo)
Nenhum movimento espontâneo acompanhado de consciência prejudicada	4

Tabela 1: Pontuação Zea-Longa^.

Manifestação	Placar/pontos
Segure a cauda do animal e levante-a de modo que o corpo fique suspenso 10 cm acima do banco. Em ratos normais, ambos os membros anteriores permanecem estendidos em direção ao chão. Ratos com déficits neurológicos podem apresentar os seguintes comportamentos:
Sem déficit neurológico	0
O membro anterior parético é flexionado e mantido próximo ao abdômen, enquanto o membro não afetado se estende em direção ao banco	1
Além do comportamento descrito no 1, a resistência ao empurrão lateral em direção ao lado parético é significativamente reduzida quando o animal é colocado deitado no banco	2
Além dos comportamentos descritos em 1 e 2, o animal circula em direção ao lado parético enquanto caminha	3

Tabela 2: Pontuação ^Bederson.

Item	Manifestação	Placar/pontos
a) Movimento Espontâneo	Atividade normal	3
(Observe a atividade do rato na gaiola por 5 minutos)	Levemente prejudicado	2
	Moderadamente comprometido	1
	Nenhum movimento espontâneo	0
b) Movimento Simétrico do Membro	Postura simétrica	3
	Postura assimétrica	2
	Hemiplegia	1
c) Extensão do membro anterior	Simétrico	3
(Segure a cauda e leve os membros dianteiros para a borda da mesa; observe a extensão da pata dianteira)	Levemente assimétrico	2
	Marcadamente assimétrico	1
	Hemiplegia	0
d) Empunhadura e habilidade de escalada	Sobe forte com aderência firme	3
	Déficit unilateral observado	2
	Incapaz de escalar ou fazer círculos	1
e) Reflexo tátil bilateral no corpo	Simétrico em ambos os lados	3
	Resposta lenta de um lado	2
	Nenhuma resposta de um lado	1
f) Resposta bilateral do toque vibrissae	Simétrico	3
	Assimétrico	2
	Sem resposta	1

Tabela 3: Pontuação Garcia modificada. Placar total: 0–18 pontos; Pontuações mais altas indicam melhor função neurológica.

Discussão

É importante esclarecer que o objetivo principal deste estudo foi a padronização metodológica, e não a descoberta biológica. Desenvolver um protocolo padronizado de MCAO é vital para reduzir a variabilidade interlaboratorial e aumentar a reprodutibilidade na pesquisa sobre AVC isquêmico. Esse protocolo aprimora a transparência processual por meio de rigorosas medidas de controle de qualidade e aborda deficiências técnicas comuns na modelagem MCAO, incluindo inserção padronizada de filamento, regulação de temperatura e processamento histológico.

Embora a redução observada no volume do infarto de 24 horas para 72 horas e a recuperação neurológica parcial representem fenômenos fisiopatológicos esperados em MCAO transitório, a contribuição deste estudo está em estabelecer a confiabilidade temporal desses desfechos usando um procedimento rigorosamente padronizado. Ao fornecer uma estrutura técnica detalhada e em etapas, esse protocolo garante que futuros estudos mecanicistas — seja investigando cascatas neuroinflamatórias, vias apoptóticas ou intervenções terapêuticas — sejam construídos sobre dados de base reproduzíveis e comparáveis. Posicionamos explicitamente este trabalho como um recurso técnico consistente com o escopo do JoVE, fornecendo uma base para pesquisas padronizadas pré-clínicas sobre AVC, em vez de avançar em insights mecanicistas.

Várias etapas desse protocolo são particularmente cruciais para garantir isquemia e reperfusão consistentes. Primeiramente, avançar precisamente a linha de oclusão até que uma leve resistência seja sentida é essencial para alcançar o MCAO reproduzível, pois um pequeno desvio na profundidade de inserção pode levar à oclusão incompleta ou hemorragia subaracnoide^20,21. Em segundo lugar, manter uma temperatura corporal normal intraoperatória rigorosa (37 ± 0,5 °C) e o controle da temperatura pós-operatório é crucial, pois a temperatura corporal muito baixa ou alta pode alterar significativamente a área do infarto e o desfecho neurológico^12,22. Em terceiro lugar, remover rapidamente o cérebro em até 90 s e realizar resfriamento por banho de gelo pode minimizar a autólise e manter a integridade dos tecidos, garantindo assim a precisão da coloração TTC e da análise de volume²³. Se esses passos puderem ser implementados de forma consistente, eles melhorarão significativamente a fidelidade e a comparabilidade dos modelos entre os estudos.

Aprimoramos o método tradicional MCAO para aumentar sua reprodutibilidade e facilidade de uso. O uso de moldes de fatias cerebrais pré-resfriados e protocolos padronizados de fatiamento reduziu erros humanos e artefatos de fatia. Além disso, a adoção de uma avaliação da função neurológica em três escalas (Zea-Longa, Bederson e Garcia modificado) por dois pesquisadores cegos aumentou a robustez e sensibilidade da avaliação^funcional 17,18,19. Por meio de procedimentos operacionais padrão detalhados que cobrem cada etapa do programa, ajuda a identificar problemas comuns, como disposição do filamento, reperfusão prematura ou hipotermia pós-operatória. Orientações para complicações comuns incluem: (1) Linha de oclusão descolocada (entrada PPA), reconhecida pela ausência de resistência em 10–12 mm e melhora neurológica imediata — se encontrado, retrair imediatamente o filamento, girar a cabeça do animal 30° em direção ao lado contralateral e reavançar com leve angulação medial em direção à base craniana; (2) Reperfusão prematura, indicada por melhora neurológica súbita durante a oclusão — certifique-se de que a rolha de silicone esteja firmemente fixada no coto da ECA, verifique se o diâmetro do filamento corresponde ao tamanho da artéria (0,35–0,40 mm para ratos de 240–270 g) e considere o uso de um filamento mais longo (aumente o revestimento de silicone em 0,5 mm) se o deslocamento persistir; e (3) Hipotermia pós-operatória (temperatura retal <36ºC) — aumentar a temperatura da almofada térmica para 38 °C, colocar uma lâmpada de calor 30 cm acima do animal e administrar solução salina estéril morna (0,5 mL, intraperitonealmente, 37ºC).

Apesar desses avanços, esse protocolo apresenta várias limitações. Primeiro, a técnica exige uma curva de aprendizado substancial (10–15 cirurgias) para alcançar taxas de sucesso consistentes, e variações individuais na anatomia vascular do rato podem afetar a colocação dos^{filamentos 21,24}. Segundo, o protocolo atual depende da verificação pós-hoc (pontuação neurológica e coloração TTC) em vez do monitoramento intraoperatório do fluxo sanguíneo cerebral (LDF ou LSCI), que limita o controle de qualidade durante a cirurgia e impede a exclusão precoce de animais com oclusão^{incompleta 25}. Terceiro, a validação foi limitada a ratos Sprague-Dawley machos jovens, restringindo a generalização a fêmeas, animais idosos e modelos^{comórbidos 26,27}. Estudos futuros devem incorporar: (1) ambos os sexos para tratar o sexo como uma variável biológica; (2) ratos idosos (12–18 meses) com comorbidades vasculares; e (3) monitoramento em tempo real da CBF para aumentar a reprodutibilidade em estudos de intervenção medicamentosa.

Esse método é particularmente valioso na triagem pré-clínica de medicamentos, pois a consistência e a relevância translacional de seus resultados são de importância crucial. O protocolo padronizado descrito neste artigo traz grande potencial para aprimorar o rigor e a reprodutibilidade da pesquisa sobre AVC isquêmico. Aplicações futuras deste protocolo incluem: (1) triagem pré-clínica de agentes neuroprotetores administrados durante a janela de reperfusão; (2) estudos mecanicistas de lesão isquemia-reperfusão usando os pontos de tempo de 24 horas e 72 horas; (3) investigação da neuroplasticidade pós-AVC e recuperação funcional; e (4) validação de alvos terapêuticos em combinação com intervenções genéticas ou farmacológicas. Ao fornecer uma POS detalhada e suportada por vídeo, nosso objetivo é facilitar a adoção ampla desse método em laboratórios de vários níveis profissionais, contribuindo para pesquisas pré-clínicas sobre AVC mais confiáveis e clinicamente relevantes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2% TTC staining solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/bottle, ≥98 % purity
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL ready-to-use
Absorbable suture	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 teeth, 12 cm
Dumont curved forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm length, 0.05 mm fine tip
Feedback heating pad	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0.3 °C closed loop
ImageJ	National Institutes of Health	version 1.53k
Iris scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Curved tip, 10 cm
Micro-vascular clips	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1.5 cm curved clip
Non-absorbable silk	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Black silk thread
PASS software	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	version 15.0	Sample size calculation software
Rat brain matrix	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	2 mm coronal slots
Silicone-coated nylon filament	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0.35 mm OD, 30 mm silicone tip, EO-sterile
Small-animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Isoflurane vaporizer, induction chamber & mask included
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	version 26.0	Statistical analysis software
Vannas micro-scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Curved tip, 8 cm