Esclerose Múltipla e Malignidades Hematológicas: Um Estudo de Randomização Mendeliana Bidirecional

Summary

Este estudo bidirecional de randomização mendeliana em duas amostras utilizou o GWAS europeu para avaliar as ligações causais entre esclerose múltipla (EM) e malignidades hematológicas (HM). A responsabilidade genética para a EM esteve associada a maiores chances de linfoma de Hodgkin e leucemia não especificada; Sem associações para outros subtipos ou em análises reversas.

Abstract

Estudos observacionais relataram associações entre esclerose múltipla (EM) e malignidades hematológicas (HM), mas os achados permanecem inconsistentes. Realizamos uma análise bidirecional de randomização mendeliana (RM) em duas amostras usando estatísticas de associação resumida em todo o genoma disponíveis publicamente para EM (n = 115.803) e HM (n = 218.792). Estimativas causais primárias foram obtidas com o estimador ponderado pela inversa da variância (IVW), complementadas por análises de sensibilidade pré-especificadas para heterogeneidade e pleiotropia. A responsabilidade geneticamente proxy para a EM esteve associada a maiores chances de leucemia (subtipo não especificado) (razão de chances [OR] 1,311, intervalo de confiança [IC] 95% 1,002-1,716, P = 0,048) e linfoma de Hodgkin (HL) (OR 1,224, IC 95% 1,052-1,425, P = 0,009), sem evidências de outros subtipos de leucemia, linfoma ou neoplasia de células plasmáticas (todos P > 0,05). Os exames não indicaram heterogeneidade substancial ou pleiotropia direcional para as análises de leucemia (subtipo não especificado) ou de HL. Esses resultados fornecem evidências genéticas consistentes com um risco elevado de subtipos selecionados de HM em indivíduos com maior responsabilidade genética para EM; No entanto, os sinais devem ser interpretados com cautela e validados em conjuntos de dados maiores, multiancestrales, e com estruturas causais adicionais.

Introduction

A esclerose múltipla (EM) é um distúrbio autoimune crônico do sistema nervoso central caracterizado por desmielinização inflamatória e um curso recorrente-remitente que pode levar à incapacidade e a um fardo social e familiar^{substancial 1}. As malignidades hematológicas (HM) compreendem neoplasias heterogêneas de origem hematopoiética ou linfoide e representam aproximadamente 6,5% de todos os tumores no^{mundo 2}. Embora as imunoterapias direcionadas e as imunoterapias tenham melhorado os resultados para muitos pacientes, o prognóstico permanece ruim para um^{subconjunto 3}. A relação entre EM e HM tem sido investigada por décadas, com resultados^{divergentes 4,5}. Em um estudo do registro norueguês que incluiu 6.883 casos de EM e 37.919 controles pareados, nenhuma associação estatisticamente significativa foi observada entre EM e risco de câncer hemalógico. De forma semelhante, um estudo dinamarquês relatou apenas uma elevação marginal e estatisticamente não significativa na incidência de HM entre pacientes com EM em comparação com controles populacionais. Em contraste, alguns estudos de coorte sugeriram riscos maiores em contextos ou subtipos específicos: um estudo prospectivo coreano relatou uma incidência 4,52 vezes maior de linfoma entre indivíduos com^{EM 6}, e uma grande análise de coorte (29.617 EM vs. 296.164 não-EM) encontrou maior risco geral de HM no^{grupo 7}. Outras investigações, no entanto, não observaram aumento dos riscos para linfoma não-Hodgkin (NHL) ou HL entre pacientes com EM estabelecido ^8,9. Coletivamente, a evidência de uma associação — particularmente no nível dos subtipos de HM — permanece incerta.

A randomização mendeliana (RM) utiliza variantes genéticas da linhagem germinativa como proxies para exposições modificáveis sob o princípio de que a alocação de alelos é efetivamente aleatória em relação a muitos fatores de confusão^{ambientais 10}. Ao usar instrumentos genéticos fortemente associados a uma determinada exposição, a RM pode fortalecer a inferência causal e reduzir o viés causalizado por confusão ou^{causalidade reversa 11}.

Aqui, aplicamos uma estrutura de RM bidirecional com duas amostras para avaliar possíveis ligações causais entre a EM e as principais classes de HM — leucemia, linfoma e mieloma múltiplo (MM) — sob uma perspectiva genética. Declaração de originalidade: Até onde sabemos, esta é a primeira RM bidirecional a interrogar sistematicamente as relações MS-HM específicas de subtipo, enquanto pré-especifica parâmetros operacionais (limiares de instrumentos, agrupamento de LD, harmonização e diagnóstico de sensibilidade) para permitir total reprodutibilidade.

Protocol

Este estudo analisou estatísticas de estudo de associação genômica ampla (GWAS) desidentificadas, em nível sumário, que são publicamente disponíveis. De acordo com as políticas do repositório e as aprovações obtidas pelos pesquisadores originais, não foi necessária nova aprovação do conselho institucional de revisão ou consentimento informado individual adicional para esta análise secundária. Todos os GWAS contribuintes relataram procedimentos de aprovação ética e consentimento em suas publicações fonte. Todas as análises foram conduzidas em conformidade com as diretrizes institucionais e a Declaração de Helsinque.

Visão geral e justificativa

O estudo implementou uma estrutura bidirecional de randomização mendeliana (RM) com duas amostras, restrita a estatísticas resumidas de ancestralidade europeia para avaliar possíveis relações causais entre esclerose múltipla (EM) e malignidades hematológicas (HM). O desenho adere às três principais suposições da RM: relevância do instrumento, independência dos fatores de confundimento e restrição de exclusão. O fluxo de trabalho, portanto, inclui: (i) acesso e curadoria de conjuntos de dados, (ii) seleção de instrumentos com significância genômica em todo o genoma com aglomeração de desequilíbrio de ligação (LD), (iii) triagem de confundidores usando PhenoScanner, (iv) harmonização de alelos com tratamento explícito de variantes palindrômicas, (v) avaliação de direcionalidade usando o teste Steiger¹², (vi) estimativa primária de RM com métodos complementares, (vii) um conjunto completo de diagnósticos de sensibilidade e (viii) geração padronizada de figuras e tabelas sob Controle de múltiplos testes. Cada uma dessas etapas é descrita em detalhes nas subseções subsequentes do protocolo, e uma visão geral do pipeline é apresentada na Figura 1.

Materiais, softwares e RRIDs

As análises foram realizadas na versão R 4.3.1 (RRID:SCR_001905) usando RStudio/Posit 2023.12+ (RRID:SCR_000432). O agrupamento LD, quando realizado localmente, usava PLINK v1.9 (build 2.3; RRID:SCR_001757)¹³. Estimativa e extração de dados por RM usaram o pacote R TwoSampleMR v0.5.7 ¹⁰; As buscas de instrumentos para potenciais confundidores usavam fenoscanner v1.0; detecção e correção de valores atípicos usaram MRPRESSO v1.0. Versões exatas são reportadas para pacotes sem RRIDs.

Fontes de dados e acesso

Estatísticas resumidas de EM foram obtidas a partir da meta-análise do International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, que abrange 47.429 casos de EM e 68.374 controles com controle de qualidade harmonizado em 15 coortes. Estatísticas resumidas da HM foram obtidas do FinnGen (total n = 218.792; >16 milhões de variantes) e incluíram linfoma de Hodgkin (HL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfomas maduros de células T/NK (MTNKL), outros linfomas não Hodgkin (NHL) especificados, leucemia linfoide, leucemia mieloide, leucemia de tipo celular não especificado e neoplasias múltiplas de mieloma/células^{plasmáticas 14}. Os conjuntos de dados foram acessados pelo portal IEU OpenGWAS usando identificadores de acesso^{documentados 15}. Todas as análises deste estudo, portanto, foram baseadas exclusivamente nesses conjuntos de dados GWAS em nível de resumo disponíveis publicamente; Nenhum dado interno de coorte institucional ou de pacientes em nível individual foi utilizado ou gerado. Como não identificamos GWAS adicionais com definições harmonizadas de subtipos de EM e malignidade hematológica que permitissem uma replicação completa do pipeline, a validação externa independente usando um conjunto de dados separado não foi realizada e é reconhecida como uma limitação. O protocolo foi escrito para poder ser reaplicado diretamente a futuros conjuntos de dados GWAS para validação independente.

Seleção de instrumentos e agrupamento de LD

Para cada exposição, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram selecionados com significância genômica (P < 5 × ^10-8) usando a função extract_instruments no TwoSampleMR aplicada aos conjuntos de dados do OpenGWAS. Para garantir a independência do instrumento, a agrupação LD foi então realizada contra um painel de referência de ancestralidade europeia, utilizando as utilidades internas de agrupamento do TwoSampleMR ou localmente com PLINK, com um limiar r² de 0,001 e uma janela física de 10.000 kilobases. Quando o PLINK foi usado, os parâmetros da linha de comando foram definidos para um limiar primário de significância de 5 × ^10-8, r² = 0,001 e uma janela de 10 Mb, de modo que os instrumentos agrupados correspondessem exatamente a esses critérios. A intensidade do instrumento foi avaliada usando a estatística F derivada da estimativa do efeito da exposição e seu erro padrão (F ≈ β²/SE²); variantes com F < 10 foram excluídas dos conjuntos finais de instrumentos, e os SNPs restantes foram levados adiante para a triagem do PhenoScanner.

Triagem de confundidores com PhenoScanner

Para minimizar a pleiotropia horizontal por fatores de risco conhecidos, cada instrumento candidato foi consultado no PhenoScanner V2 em todo o catálogo GWAS usando o encapsulamento R do fenoscanner (v1.0)^16,17. Para cada SNP, solicitamos todas as associações reportadas em P < 1 × 10⁻⁵ e inspecionamos manualmente os traços retornados. Associações que indicam ligações com fatores de risco hematológicos estabelecidos para malignidades — como exposição relacionada ao tabagismo ou características de adiposidade/antropometria (por exemplo, índice de massa corporal, circunferência da cintura e medidas de gordura corporal) — ou associações diretas com fenótipos de malignidade hematológicas levaram à exclusão do SNP correspondente do conjunto^{de instrumentos 18}. As categorias de características consideradas excludentes foram baseadas em evidências prévias que relacionavam obesidade e tabagismo ao risco de leucemia, linfoma ou^mieloma 18,19,20. As consultas usaram raízes amplas de palavras-chave (por exemplo, fumaça, cigarro, IMC, obesidade, cintura, adiposidade, malignidade hematológica, linfoma, leucemia, mieloma). Todas as remoções foram documentadas em uma planilha de rastreamento junto com a característica do PhenoScanner que desencadeou a exclusão, e as listas de instrumentos limpas foram então passadas para a etapa de harmonização.

Harmonização e manuseio palindrômico

Os alelos de efeito para cada SNP foram harmonizados entre os conjuntos de dados de exposição e resultado usando a função harmonise_data no pacote TwoSampleMR (v0.5.7, R). Alinhamos todos os alelos de desfecho ao alelo do efeito da exposição para que coeficientes beta positivos sempre correspondessem ao mesmo alelo em ambos os conjuntos de dados. Variantes palindrômicas (A/T ou C/G) com frequências intermediárias de alelo de efeito (0,42-0,58) no painel de referência OpenGWAS foram tratadas como ambíguas em fio e removidas automaticamente ao configurar a ação de harmonização para eliminar SNPs ambíguos. SNPs palindrômicos com frequências de alelo de efeito fora dessa faixa foram mantidos e alinhados usando as frequências alelares relatadas. Como a disponibilidade de alelos e o status palindrômico diferiam ligeiramente entre os desfechos do FinnGen, a harmonização foi realizada separadamente para cada fenótipo HM, e o número final de instrumentos inseridos em cada análise específica do resultado foi extraído dos objetos harmonizados R e relatado nas tabelas.

Avaliação de direcionalidade (filtragem de Steiger)

A direcionalidade foi avaliada usando a abordagem Steiger, conforme implementada na função steiger_filtering do TwoSampleMR. Para cada SNP, a função primeiro calculou a variância explicada (R²) na exposição e no resultado do coeficiente beta do GWAS, erro padrão e tamanho da amostra. O estudo então removeu instrumentos para os quais R² foi maior no resultado do que na exposição, indicando uma possível direção inversa do efeito. O filtro Steiger foi aplicado separadamente para cada conjunto de dados de resultados, e os demais instrumentos (linhas com steiger_dir == TRUE) foram salvos e usados nas análises de ressonância magnética subsequentes. As contagens de instrumentos pós-Steiger foram registradas para cada desfecho e são reportadas junto com as estimativas da RM.

Estimativa primária de RM e controle de testes múltiplos

Estimativas causais primárias foram obtidas com RM ponderada pela variância inversa (IVW) sob um modelo de efeitos fixos usando a função RM no TwoSampleMR, com métodos especificados como "mr_ivw", "mr_egger_regression" e "mr_weighted_median". Para cada resultado de HM, instrumentos harmonizados e filtrados por Steiger foram passados para a RM, e razões logarítmicas e erros padrão foram extraídos e exponenciados para obter razões de probabilidades (ORs) com intervalos de confiança (ICs) de 95% para características binárias²¹. Para examinar a robustez a violações modestas da suposição de não pleiotropia, aplicamos adicionalmente os estimadores de regressão Ponderada Mediana e^{MR-Egger 22,23}, implementados no mesmo pacote. Quando o teste Q de Cochran (de mr_heterogeneity) indicou heterogeneidade substancial (P < 0,05), o estudo também se adaptou aos modelos multiplicativos de IVW com efeitos aleatórios e relatou resultados de efeitos fixos e aleatórios. O erro familiar nos nove desfechos da HM foi controlado usando correção de Bonferroni com α = 0,05/9 = 5,56 × ^10-3; associações com valores de P abaixo desse limite foram consideradas estatisticamente significativas, enquanto aquelas com 0,0056 ≤ P < 0,05 foram interpretadas como sugestivas e descritas com cautela.

Diagnósticos de sensibilidade: heterogeneidade, pleiotropia e valores atípicos

A estatística Q de Cochran foi usada para avaliar a heterogeneidade entre instrumentos tanto para modelos de IVW quanto de MR-Egger, implementada via a função mr_heterogeneity no TwoSampleMR. A pleiotropia horizontal direcional foi avaliada usando o teste de interceptação MR-Egger (mr_pleiotropy_test) e o teste global no pacote^{MR-PRESSO 24}. ^{MR-PRESSO 24} foi executado com as configurações recomendadas em R (NbDistribution ≥ 5.000, SignifThreshold = 0,05) para detectar valores atípicos influentes e quantificar a possível distorção comparando estimativas de IVW antes e depois da remoção de outliers²⁵. Análises de deixo de fora (mr_leaveoneout) foram realizadas para cada par exposição-desfecho para determinar se algum SNP individual influenciou desproporcionalmente a estimativa geral. Para transparência e reprodutibilidade, todas as saídas diagnósticas foram exportadas de R e reportadas junto com as contagens correspondentes de instrumentos após harmonização, filtragem Steiger e remoção de valores atípicos MR-PRESSO.

Força do instrumento e avaliação do NOME

A intensidade do instrumento para MR-Egger foi quantificada usando a estatística I²GX, calculada como 1 menos a média dos erros padrão quadráticos das associações SNP-exposição dividida pela variância entre instrumentos²⁶. Valores próximos de 1 indicam melhor conformidade com a suposição de Sem Erro de Medição (NOME); valores mais baixos sugerem possível diluição de regressão e uma interpretação cautelosa e rápida dos resultados da MR-Egger. O I²GX foi calculado e reportado para cada análise específica de resultado.

Randomização Mendeliana reversa

O pipeline completo era repetido na direção inversa, tratando cada subtipo de HM como a exposição e MS como o resultado. Quando instrumentos significativos em todo o genoma eram insuficientes para uma dada exposição à HM, um limiar de seleção relaxado de P < 5 × ^10-6 foi permitido, mantendo os mesmos parâmetros de aglomeração do LD, triagem do Fenoscanner, procedimentos de harmonização, filtragem Steiger e diagnósticos de sensibilidade. Análises que usavam limiares relaxados estavam claramente rotuladas nas tabelas correspondentes e nas legendas das figuras.

Visualização e exportação de figuras

Plots dispersos, floresta, funil e deixa-um-fora foram gerados, com legendas posicionadas abaixo dos painéis e tamanhos de fonte ajustados para garantir que os rótulos não obscurecessem os dados plotados. Os limites dos eixos foram padronizados entre desfechos comparáveis para facilitar a comparação visual. As figuras eram exportadas a no mínimo 300 dpi em formatos sem perdas, como TIFF ou PNG. Todos os valores numéricos plotados foram cruzados com as estimativas reportadas para garantir consistência entre texto, tabelas e figuras.

Reprodutibilidade e compartilhamento de dados

Sementes aleatórias foram fixadas quando necessário, versões de software foram registradas e scripts de análise junto com objetos intermediários foram arquivados para permitir a reexecução de todas as etapas. Identificadores de acesso ao conjunto de dados e definições de fenótipos foram documentados, e as listas de instrumentos em cada estágio de filtragem — pós-agrupamento, pós-harmonização, pós-filtragem Steiger e pós-MR-PRESSO — foram preparadas para upload como arquivos de planilha de acordo com as diretrizes do periódico.

Results

Seleção de variantes instrumentais

Utilizando um limiar de significância genômica de P < 5×10⁻⁸, 22.466 SNPs foram inicialmente coletados para EM. Após a agrupação LD no PLINK (r² < 0,001, janela 10.000 kb), 72 SNPs permaneceram como instrumentos, e cada um tinha F > 10 (intervalo 30-1.044). Para minimizar a pleiotropia por meio de vias de risco conhecidas, 11 SNPs associados a potenciais confundentes de HM (por exemplo, índice de massa corporal, circunferê...

Discussion

Este estudo de randomização mendeliana (RM) com duas amostras em uma população de ascendência europeia fornece evidências genéticas consistentes com um risco maior de linfoma de Hodgkin (HL) e leucemia de tipo celular não especificado entre indivíduos com maior propício genética à esclerose múltipla (EM), sem apresentar associação convincente com outros subtipos de leucemia, subtipos de linfoma não-Hodgkin (NHL) ou neoplasias múltiplas de mieloma/células^{plasmáticas 27}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Correção de Bonferroni (&alfa; = 0,0056)	Referência de método estatístico	BC-0056	Método de correção por múltiplos testes para controlar a taxa de falsos positivos
Estatística Q de Cochran	Cochran, 1954	Q-001 (https://www.jstor.org/stable/2334368)	Usado para avaliar a heterogeneidade entre instrumentos de ressonância magnética
F-estatística	Documentação TwoSampleMR	F-049 (https://cran.r-project.org/web/packages/TwoSampleMR/vignettes/perform_mr.html)	Métrica para avaliar a resistência do instrumento em RM
Estatísticas Resumidas HM (GWAS)	FinnGen	https://www.finngen.fi/en	Dados genômicos para malignidades hematológicas (n = 218.792), incluindo linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia, etc.
Estatística I2GX	Bowden et al., 2016	I2GX-074 (https://academic.oup.com/ije/article/44/2/512/753845)	Estatística para avaliar a conformidade com a suposição de "sem erro de medição"
Parâmetros de Agrupamento de LD	PLINK	https://www.cog-genomics.org/plink/1.9	Parâmetros para aglomeração de L para garantir a independência dos instrumentos genéticos
MR-PRESSO v1.0	SR. PRESSO 	1445 (https://github.com/rondolab/MR-PRESSO)	Software para detecção e correção de heterogeneidade e outliers
Estatísticas Resumidas do MS (GWAS)	Consórcio Internacional de Genética de Esclerose Múltipla & nbsp;	https://imsgc.net	Dados genômicos para esclerose múltipla (EM) (n = 115.803), de coorte europeia
PhenoScanner V2	PhenoScanner	1550 (http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk)	Banco de dados para triagem de instrumentos genéticos quanto a associações com fatores de confusão conhecidos (por exemplo, tabagismo, IMC)
PLINK v1.9	PLINK	SCR_001757 (https://www.cog-genomics.org/plink/1.9)	Software para análise de associação genômica ampla e agrupamento de desequilíbrio de ligação (LD)
R versão 4.3.1	Fundação R	SCR_001905 ( https://www.r-project.org)	Software de computação estatística de código aberto
Teste Steiger	Metodologia TwoSampleMR	STG-001 (https://cran.r-project.org/web/packages/TwoSampleMR)	Teste estatístico para direcionalidade na randomização mendeliana
TwoSampleMR v0.5.7	RStudio / CRAN	1134 (https://cran.r-project.org/package=TwoSampleMR)	Pacote R para análise de randomização mendeliana (RM) com duas amostras
Mediana ponderada e MR-Egger	Métodos de Randomização Mendeliana	WM-026 ( https://cran.r-project.org/package=MendelianRandomization)	Estimadores alternativos para análise de sensibilidade em RM